Cell-Free DNA Integrity Analysis in de urine monsters

Samenvatting

Er wordt een methode voorgesteld voor het analyseren van de DNA-integriteit in de celvrije supernatantfractie van urinemonsters. De methode is geschikt voor vroege detectie van urologische maligniteiten en heeft bewezen nauwkeurig te zijn voor de vroege diagnose van blaaskanker.

Samenvatting

Hoewel de aanwezigheid van circulerend celvrij DNA in plasma of serum is op grote schaal aangetoond dat een geschikte bron van biomarkers voor vele vormen van kanker zijn er weinig studies gericht op het mogelijke gebruik van urine celvrij (UCF) DNA. Uitgaande van de hypothese dat de normale apoptotische cellen sterk gefragmenteerd DNA en dat kankercellen vrijgave langer DNA, de mogelijke rol van DNA integriteit UCF beoordeeld als vroege diagnostische merker kan onderscheiden tussen patiënten met prostaatkanker of blaaskanker en gezonde individuen.

Een UCF DNA integriteit analyse is voorgesteld op basis van vier kwantitatieve real-time PCR van vier sequenties langer dan 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2 en AR. Sequenties die vaak een groter aantal DNA-kopieën in de blaas en prostaat kanker werden voor de analyse, maar de werkwijze is flexibel, en deze genen kunnen worden vervangen door andere genen van interest. De potentiële bruikbaarheid van UCF DNA als bron van biomarkers reeds aangetoond voor urologische maligniteiten, aldus de weg voor verdere studies UCF DNA typering bestrating. UCF DNA integriteit test het voordeel dat niet-invasief, snel en gemakkelijk uit te voeren met slechts een paar milliliter urine nodig de analyse worden uitgevoerd.

Inleiding

Celvrij DNA in bloed en urine door celdood gedetecteerd door apoptotische of necrotische mechanismen. Celvrij DNA in bloed is uitgebreid bestudeerd voor diagnostische en prognostische doeleinden bij verschillende ziekten, met name kanker ^1. Maar minder bekend is over de rol van urine-cel-vrij (UCF) DNA. UCF DNA kan afkomstig zijn van bloed dat door de glomerulaire filtratie systeem of uit cellen die direct in contact komen met de lichaamsvloeistof ² (bijvoorbeeld urotheelcellen of prostaatcellen). Het gebruik van UCF DNA als bron van biomarkers is hoofdzakelijk onderzocht voor de vroege diagnose van nier, blaas en prostaat kanker door het hoge percentage UCF DNA rechtstreeks uit urinewegen cellen ^3,4.

Weinig bekend over UCF DNA en de beste methoden voor het isoleren en karakteriseren van het. Aangezien de hypothese dat tumorcellen vrijkomen langer DNA-fragmenten dan normale cellen, de evaluatiecelvrij DNA integriteit is onderzocht in een poging om de oorsprong van DNA ophelderen in de bloedsomloop ^5. Sommige studies hebben aangetoond dat celvrij DNA integriteit in bloed vormt een goede diagnostische test voor vele soorten kanker ^6, en dezelfde hypothese is die met betrekking tot urine ^7-9.

Dit artikel beschrijft een nieuwe werkwijze voor UCF DNA integriteit analyse met een mogelijke toepassing van de blaas en prostaat kanker detectie. Vooral de integriteit van UCF DNA fragmenten meer dan 250 bp werd getest in 4 regio's waarin een hoger aantal DNA-kopieën in vaste tumoren, zoals prostaat- en blaaskanker: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ) BCAS1 (20q13.2), en AR (Xq12) ^10-14. Specifieke oncogenen, plaats willekeurige sequenties werden gekozen om de kans op het vinden van hen in het celvrije fractie van kankerpatiënten te verhogen. Een van de belangrijkste voordelen vandeze methode is dat het flexibel is en dat andere gebieden kunnen ook worden geselecteerd op basis van het type tumor en kenmerken.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen van de IRST Human ethische commissie onderzoek.

LET OP: In dit protocol, geïsoleerde we DNA van urinemonsters naar een UCF DNA integriteit analyses uit te voeren. LNCaP en MRC cellijnen werden gebruikt om standaarden te construeren. Technieken zoals DNA-extractie DNA kwantificatie (spectrofotometer en real-time PCR voor de controle gen STOX1) en real-time PCR voor bepaalde oncogenen werden uitgevoerd (figuur 1).

1. Urine verwerven en verwerken

1. Zorg voor een schone bijvangst eerste ochtend urine monster in een schone, droge, plastic beker. Vang minimaal 50 ml van het urinemonster.
2. Handhaaf de urine bij 4 ° C gedurende maximaal 3 uur en het naar het laboratorium bij dezelfde temperatuur.
3. Meng elk monster door het tweemaal inverteren onmiddellijk na aankomst in het laboratorium en overdracht in twee 50-mL-conische bodem polypropyleen buizen.
4. Centrifugeer de buizenbij 850 xg gedurende 10 min bij 4 ° C of bij kamertemperatuur.
5. Zorgvuldig overdracht 10 ml van het bovenste deel van de urine supernatant in twee 5-ml buizen, waarbij ten minste 2 ml van de bovenstaande vloeistof boven de celpellet.
   OPMERKING: overbrengen het bovenste deel van het supernatant vermindert het gevaar voor besmetting met cellen of celresten. Er is geen duidelijke afbakening tussen de bovenste en onderste delen.
6. Gooi de pellet en het supernatant onmiddellijk bevriezen bij -80 ° C tot gebruik.

2. DNA-isolatie uit de urine supernatant en cellijnen

OPMERKING: Isoleer het DNA uit een cellijn (bijvoorbeeld LNCaP prostaatkanker of blaaskanker MRC) met een commerciële kit en de instructies van de fabrikant. Isolatie van DNA uit de urine supernatant moet worden uitgevoerd met de commerciële protocol als volgt gewijzigd:

1. Dooi een portie van de supernatant urine bij kamertemperatuur.
2. Vortex en meng de urine monster en 1 ml van het supernatant urine in een duidelijke 5-mL buis. Bevries de residuele urine bij -80 ° C.
3. Voeg 100 ul proteïnase k rechtstreeks aan het monster.
4. Voeg 1 ml AL buffer aan het monster en goed mengen door pipetteren.
5. Sluit de buis en incubeer de monsters bij 56 ° C gedurende 15 minuten.
6. Tijdens incubatie bereiden één kolom voor elk monster en de voorbereiding van de wasbuffers, AW1 en AW2, volgens instructies van de fabrikant (voeg de opgegeven hoeveelheid 100% ethanol).
7. Breng de monsters naar kamertemperatuur en voeg 1 ml absolute ethanol. Meng volledig door pipetteren.
8. Voeg 650 ul van het mengsel verkregen in stap 2.7 op de kolom en centrifugeer bij 6000 xg deze gedurende 1 min.
9. Gooi de buis met het doorstroomkanaal en plaats de kolom op een nieuwe, schone verzamelbuis. Herhaal de stappen 2,8 en 2,9 tot alle monster mengsel is gebruikt (5 maal).
10. Voeg 500 &# 181, L buffer AW1 zonder bevochtiging de rand van de kolom. Centrifugeer bij 6000 xg gedurende 1 min.
11. Gooi de buis met het doorstroomkanaal en vervangen door een nieuwe, schone verzamelbuis.
12. Voeg 500 ul buffer AW2 zonder bevochtiging de rand van de kolom. Centrifugeer het op volle snelheid (20.000 x g) gedurende 3 min.
13. Gooi de buis met het doorstroomkanaal en vervangen door een nieuwe, schone verzamelbuis.
14. Herhaal stap 2.12 om eventuele resten wassen buffer te verwijderen.
15. Plaats de kolom in een schone 1,5-mL buis. Voeg 50 ul elutiebuffer AE en wacht 7 minuten zodat de buffer bevochtigt de kolom.
16. Centrifugeer bij 8000 xg gedurende 1 min.
17. Pipetteer het eluens uit stap 2,15 in de mini-kolom en centrifugeer het op maximale snelheid gedurende 1 minuut tot de maximale herstel van DNA te waarborgen.

3. DNA Kwantificering en verdunning

1. Met behulp van een spectrofotometer, voert de kwantificering van DNA uit both de cellijn en de urine supernatant monsters. Gebruik 2 pi monster op een bench-top spectrometer, volgens instructies van de fabrikant.
2. Verdun de UCF DNA monsters worden tot een concentratie van 1 ng / ul verkrijgen en opslaan van de DNA bij -20 ° C totdat het DNA integriteit analyse.
   Opmerking: Als de DNA hoeveelheid onvoldoende te gaan met real-time PCR (ten minste 100 ng) Voer een nieuw DNA isolatiewerkwijze.
3. Verdun het DNA van cellijn monsters met zes standaarden te verkrijgen met verschillende concentraties: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 en 2 ng / ul, elk met een volume van 100 pl (ST1, ST2, ST3, ST4, ST5, en ST6). Bewaar de cellijn DNA standaarden bij -20 ° C totdat het DNA integriteit analyse.

4. DNA Integrity Test - PCR

1. Ontdooi de primers (de concentratie afhankelijk van het type test), groene Supermix, cellijn DNA standaarden en UCF DNA verdunde monsters op ijs.
2. Bereid strip buizen in de plaat fof de 72-well rotor disc. Aliquot 10 pi in duplo voor elke standaard en verdunde monster en 10 ul van RNase-vrij water voor de negatieve controle.
3. Bereid een mengsel van 1 pi van elke primer (de concentraties aangegeven in tabel 1), 12,5 pl groene Supermix en 6,5 ui RNase-vrij water voor elk monster. Bij de voorbereiding van de mix, gebruikt u het volgende aantal monsters: 6-normen voor 2 herhalingen, aantal monsters voor 2 duplo, negatieve controle voor 2 herhalingen, en 2 extra monsters.
4. Aliquot 15 pi van het mengsel in elk putje. Niet pipet of draai de buizen.
5. Start het protocol met de in tabel 1 PCR-omstandigheden.
   LET OP: Voor de UCF DNA waarde werden 29 DNA-monsters verwerkt voor elke real-time experiment met behulp van de 72-well rotor schijf: 29 x 2 monsters + 6 x 2 normen + negatieve controle x 2 = 72 (UCF DNA-waarde).
   LET OP: Het protocol voor de UCF DNA integriteit analyse kan ookuitgevoerd met een andere PCR real-time instrument (bij gebruik van een ander apparaat, kan ROX kleurstof te worden toegevoegd).

5. DNA Integrity Test - Data-analyse en interpretatie

OPMERKING: De UCF DNA voor elk monster werd verkregen door een real-time-detectie instrument systeemsoftware met een standaard curve constructie voor elk individueel gen PCR evaluatie en onder gebruikmaking standaardkromme interpolatie, zoals eerder beschreven ^7-9 (figuur 2).

1. Evalueer de replica's; monster repliceert met een verschil ≥1 Ct moeten worden verwijderd en opnieuw geëvalueerd in een tweede experiment.
2. Bereken de mediaan Ct voor elk monster en beschouwen monsters met een Ct-waarde ≤ 36.
3. Evalueer de specificiteit van de PCR producten met behulp van smelt-analyse.
4. Evalueer de concentratie van elke amplicon door interpolatie van de standaardcurve; het verkrijgen van een concentratie (ng / ul) voor elke amplicon.

Resultaten

De totale vrije DNA-concentratie was meetbaar spectrofotometrisch voor alle geanalyseerde monsters, met een bereik tussen 1,51 en 138 ng / ul. Vijf controlemonsters werden gebruikt voor de reproduceerbaarheid van de gegevens: twee onafhankelijke realtime experimenten werden uitgevoerd voor c-MYC, HER2, BCAS1, AR en STOX1. De variatiecoëfficiënten (CV) werden vervolgens berekend voor elk gen (Tabel 2), met een goede reproduceer...

Discussie

UCF DNA integriteit analyse is een nieuwe, niet-invasieve werkwijze voor het bepalen van DNA integriteit in urine. Het werd onlangs voorgesteld voor de vroege diagnose van de blaas ⁹ en prostaatkanker ^7,8. Een aantal van de voor- en nadelen van de UCF DNA betrouwbaarheidstoetsing komen hier aan bod, samen met toekomstperspectief.

Het belangrijkste voordeel van de benadering is dat het een goedkope, niet-invasieve werkwijze en een eenvoudig protocol om urine te onderzoek...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304
iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µL rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL)	Biorad	1708880
IDT custom DNA oligos	IDT		HPLC-zuivering, 100nMole DNA oligo
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific		Andere spectrofotometrische methoden kunnen ook worden gebruikt om DNA te kwantificeren
Rotor-Gene 6000	Corbett		Een ander Real Time PCR-instrument kan ook worden gebruikt
microcentrifuge
één centrifuge voor 50 mL buizen
incubator
-80 °C vriezer
-20 °C vriezer
10 μL pipette
20 μL pipette
200 μL pipette
1.000 μL pipette
pipettips (10; 20; 200; 1.000)
1,5 mL buizen
50 mL buizen
15 mL buizen
Rotor-Disc 72 Rotor	Corbett	9018899
Strip Tubes en Kappen, 0,1 mL (250)	Qiagen	981103
Collectiebuizen (2 mL)	Qiagen	19201
Buffer AL (264 mL)	Qiagen	19075
Proteinase K (10 mL)	Qiagen	19133