Een snelle, schaalbare methode voor het isoleren, functionele studie en analyse van cel-afgeleide extracellulaire matrix

Summary

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Abstract

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.

Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

Introduction

In de afgelopen decennia is de extracellulaire matrix (ECM) wordt erkend als een gevarieerde, dynamische en complexe omgeving die betrokken is bij meerdere cel-fysiologische en pathologische processen. Op het weefsel niveau, de ECM beïnvloedt cell signaling, beweeglijkheid, differentiatie, angiogenese, stamcel biologie, het ontstaan van tumoren, fibrose, etc. ^1,2. De studie van ECM organisatie en ECM-afhankelijke processen heeft dus grote gevolgen voor de celbiologie en weefsel fysiologie. Een mechanistisch begrip van ECM samenstelling, organisatie en functionele eigenschappen bereikt worden werkwijzen voor de nauwkeurige isolatie van ECM vereist. Overwegende dat de eerste identificatie van de ECM eiwitten ingeroepen isolatie van weefsels ^3, heeft de voorbereiding van de ECM uit gekweekte cellen inmiddels vaker.

De isolatie en analyse van cellen afgeleide ECM is ingewikkeld om twee belangrijke redenen. Enerzijds, de aanwezigheid van cellen en deir overvloedige intracellulaire eiwitten kan het moeilijk maken om de ECM te isoleren als discrete extracellulaire structuur. Inderdaad Sommige ECM eiwitten rollen in de cel en in de ECM ^4; derhalve de efficiënte verwijdering van intracellulaire eiwitten uit cellen afgeleide ECM is essentieel als de studie van eiwitten in de ECM niet te verwarren met hun rollen in de cel. Ten tweede wordt de cel afkomstige ECM uit vele grote, oligomere eiwitten, die vaak covalent verknoopt aan ECM assemblage en derhalve onoplosbaar in standaard reinigingsmiddelen. Deze eigenschappen kunnen opvragen en verdere analyse van ECM bemoeilijken. Om deze problemen aan te pakken, is een werkwijze vereist die de efficiënte scheiding van ECM eiwitten uit cellulaire componenten mogelijk maakt.

Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor de isolatie van ECM van zowel celkweek of weefselextracten. Veel van deze methoden gericht op de winning van de overvloedige ECM protein, collageen, uit weefsels en omvatten het gebruik van neutrale zouten ^3, zure omstandigheden ^5,6 of pepsine ^7. Isolatie van totale ECM uit weefselextracten gaat vaak cellen ontdoen van het weefsel voorafgaand aan de isolatie van de ECM. Zo heeft een sequentiële extractie methode beschreven dat ECM uit menselijk hartweefsel ⁸ isolaten. Eerst werden losjes gebonden ECM eiwitten geëxtraheerd met 0,5 M NaCl voor natriumdodecylsulfaat (SDS) werd gebruikt om de cellen te verwijderen. Tenslotte werden de resterende ECM eiwitten geëxtraheerd middels 4 M guanidine ^8. ECM kunnen ook oplosbaar worden gemaakt van cellen ontdane mbv 8 M ureum ^9. Andere technieken detergenten, zoals deoxycholinezuur ^10, zowel cellen en ECM extraheren voordat scheiden onoplosbare ECM eiwitten uit de oplosbare cellysaat door centrifugatie.

De werkwijze voor isolatie en analyse van cellen afgeleide ECM in dit rapport beschreven is, een reproduceerbare werkwijze voor het verwijderen van celmateriaal, waardoor cellen afgeleide ECM die door in situ immunofluorescentie kunnen worden geanalyseerd of verwijderd voor verdere biochemische analyse. Deze methode kan worden aangepast voor alle aanhangend celtype en kan worden opgeschaald voor stroomafwaartse procedures, zoals immunoblotting of massaspectrometrie, of gebruik van het geïsoleerde ECM functionele studies. De werkwijze kan ook worden gebruikt in combinatie met confocale microscopie van levende cellen om ECM afzetting van een gemerkt eiwit van interesse in real time volgen. Dit wordt bereikt door het gebruik van een gerasterde glazen bodem schaal. Kortom, de aanpak een nauwkeurige isolatie van cellen afgeleide ECM en ook de omvang opsporen en volgen de afzetting en dynamica van individuele ECM eiwitten.

Protocol

1. Verwijdering van Cellen met ammoniumhydroxideoplossing

1. Bereid hechtende cellen door Plating in de juiste dichtheid.
   LET OP: De cellen kunnen alle aanhangend celtype dat er voldoende ECM produceert voor analyse. Hier beschrijven we het gebruik van COS-7-cellen, Afrikaanse groene aap nier fibroblast-achtige cellijn die SV-40 virus-DNA-sequenties bevat; RCS, een rat chondrosarcoom cellijn; of normale menselijke dermale fibroblasten (HDF) stammen uit juveniele voorhuid. HDF gebruik van passage 1 tot enige passage 8.
   1. Plaat de cellen op dekglaasjes voor beeldvorming van levende cellen en de ECM, fluorescentiemicroscopie studies van vaste ECM of voor de bereiding van cellen afgeleide ECM kleinschalige functionele bepalingen. Plate de cellen op celkweek gerechten voor SDS-PAGE-analyse, immunoblot of proteomics studies.
      OPMERKING: De celkweekomstandigheden (aantal cellen aan de plaat en kweekmedium) zal afhangen van het celtype. Het aantal cellen tot op het bord zal moetenempirisch worden vastgesteld voor de bepaalde cellijn of cellijn.
   2. Maken een geschikte tijd om de cellen te deponeren ECM, meestal> 16 uur. OPMERKING: De tijdsperiode hangt af van het celtype en moet empirisch worden bepaald. Indien bij ectopische expressie, zodat passende tijd voor de expressie van de getransfecteerde eiwit van belang en voor de afzetting van ECM.
2. In een afzuigkap, Bereid 20 mM ammoniumhydroxide in een geschikt vat door verdunning van de Stock Solution 1/14 met gedeïoniseerd H ₂ O.
   1. Verwijder de cellen van de incubator en verwijder voorzichtig kweekmedium. Add fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 ⁺ / Mg2 ⁺ door langzaam gieten tegen de wanden van de schaal. Rock de schotel twee keer en verwijder de vloeistof met een plastic overdracht pipet. Herhaal dit nog twee keer.
3. In een afzuigkap, kantelen elk gerecht en verwijder de PBS uit stap 1.2 met een plastic overdracht pipet. Voeg 3mL ammoniumhydroxide per 100 mm schaal en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Gedurende de 5 min incubatieperiode voorzichtig schudden de schotel elke min aan de lyse van de cellen te waarborgen. Stappen 1,4-1,7 zal ook in de afzuigkap worden uitgevoerd.
   OPMERKING: Alternatieve verwijdering cel reagentia omvatten 2 M en 8 M ureum, die zijn geïncubeerd met de cellen gedurende 10 min.
4. Voeg overvloedige hoeveelheden gedeïoniseerd _H2O elk gerecht, tenminste 20 ml per 100 mm schaal met schommelen. Gooi de ammoniumhydroxide-oplosbaar materiaal-dat uit ammoniumhydroxide, gelyseerde cellen en gedeïoniseerd _H2O-door afzuigen met een transferpipet. Breng deze oplossing afval in een container voor vloeibaar afval.
5. Was de onoplosbare ECM laag in overvloedige gedeïoniseerd _H2O vier keer om de volledige verwijdering van de ammoniumhydroxide-oplosbaar materiaal te waarborgen.
6. Voor het onderzoek van de ECM door immunofluorescentie, bevestig de ECM door toevoeging van 2%paraformaldehyde (PFA, 3 ml per 100 mm schaal) bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
   Let op: PFA is zeer gevaarlijk in geval van de huid of ogen en ernstige overbelichting kan longschade, verstikking, bewusteloosheid, of de dood veroorzaken. Het mag alleen worden behandeld in een afzuigkap en persoonlijke beschermingsmiddelen moeten gedragen worden.
7. Was elk vaste monster tweemaal met PBS, zoals in stap 1.2, en gooi de PFA-oplossing in een geschikte bak vloeibaar afval. Indien nodig maakt ECM monsters in PBS bij 4 ° C voor te bereiden op fluorescentie microscopie.

2. Tracking Afzetting van een ECM-eiwit door confocale microscopie beeldvorming van levende cellen

1. Tel de cellen onder een hemocytometer. Voor COS-7-cellen, plaat 250.000 cellen op een 60 mm celkweek schotel voor transfectie.
   Opmerking: Voor live cell imaging, moeten de cellen worden getransfecteerd met een vector die codeert voor het ECM eiwit van belang gefuseerd in frame met een genetisch gecodeerd fluorescerennt tag. Dit is de identificatie van de ECM eiwit van belang bij live-cell imaging inschakelen.
2. Na een geschikte tijd voor proteïne-expressie (bijvoorbeeld 16 uur) te verwijderen van de cellen van de schaal met trypsine-EDTA-oplossing, ze tellen in een hemocytometer en plaat ~ 150.000 cellen op een 35-mm gerasterde, glazen bodem schotel voor beeldvorming. Laat 2 uur om de cellen weer vast en ECM afzetting beginnen (de tijdsperiode is afhankelijk van het celtype en dient empirisch te worden vastgesteld).
   LET OP: Gebruik een cel medium dat geen fenolrood bevat, omdat deze een rode tint die de beeldkwaliteit beïnvloedt kan geven.
3. Tijdens de bovengenoemde periode van 2 uur, het opzetten van een confocale microscoop met een 37 ° C incubator kamer en een _{CO2-levering.} Hierdoor kan de temperatuur in de kamer en in de schaal te stabiliseren tot 37 ° C voor de beeldvorming; Dit kan tot 1 uur.
4. Incubeer de cellen uitgeplaat op de 35 mm gerasterde schotel met een fluorescerende cel marker voor 30 min. Vervolgens was de cellentweemaal in fenolrood-vrij kweekmedium voorafgaand aan beeldvorming.
   OPMERKING: Een cytoplasmatisch fluorescente merker kan worden gebruikt om celvolumes visualiseren of een membraan waarin marker kan worden gebruikt om celranden visualiseren.
5. Met behulp van de 20X objectief en fase contrast op een confocale microscoop, identificeren een geschikte raster plein dat een aantal (> 3) hechtende, gezonde cellen bevat. Bevestigen de expressie van het doeleiwit keuze in de cellen in de geselecteerde rastervak ​​met de doelstellingen 63X en 100X en de juiste golflengtes onder fluorescentiemicroscopie.
6. Opzetten fluorescentie en fase-contrast time-lapse beeldvorming met behulp van een z-stack software. Stel de "begint" stack net onder de ECM laag en het "einde" stack om net boven het cellichaam. Stel de z-stapgrootte 0,3 urn en de z-volume tussen 5 en 10 urn diepte in totaal, afhankelijk van het celtype. Dit zal tussen de 15-30 z-profielen per tijdstip geven.
7. Capture fluorescentie (voor rood fluorescerend eiwit (RFP), excitatie = 555 nm en emissie = 584 nm) en fase-contrast beelden periodiek over een bepaalde periode. Gebruik bijvoorbeeld de time-lapse-software om het tijdsinterval op 2 min en de duur tot 2 uur in te stellen. Selecteert u de knop "start" om het vastleggen van z-sectie beelden beginnen over de gedefinieerde periode.
8. Aan het einde van de periode, verwijderen van de cellen van schotel, zoals beschreven in stappen 1.1-1.5, de lokalisatie van de fluorescent gemerkt eiwit van interesse in de ECM bevestigen.
9. Gebruik fase-contrast beeldvorming en de 20X objectief te verhuizen de desbetreffende raster plein.
10. Overschakelen naar het 63x objectief en identificeren van de ECM laag onder fluorescentie microscopie. Vergelijk dit beeld Het beeld van de pre-winning tot

3. Steriele Voorbereiding van de Cell-afgeleide ECM for Cell functionele testen

1. Grow een populatie van cellen (de "matrix producent" cellen) op dekglaasjes en andere popuordening (de "test" cellen) in standaardkweek in een 100 mm kweekschaal cel ten minste 24 uur.
   Opmerking: Dit kunnen twee verschillende hechtende celtypen en proefopzet kunnen omvatten transfectie van één of beide celpopulaties een fluorescent-gelabelde ECM-eiwit tot expressie.
2. In een laminaire stroming kap, zoals gebruikt voor celkweek, voor te bereiden steriele oplossingen van PBS zonder Ca ²⁺ / Mg ^2+, 20 mM ammonium hydroxide (zie stap 1.3), en de-geïoniseerde H ₂ O door het passeren van elk door een steriel 0,2 um filter in een geschikte steriele container.
3. Het handhaven van steriele techniek, voorzichtig te wassen de "matrix producent" cellen op dekglaasjes drie keer met steriele PBS (zie stap 1.2).
4. Verwijder de PBS door aspiratie met een steriele pipet en gooi het in een geschikte houder vloeibaar afval. Voeg 20 mM steriel ammoniumhydroxide (3 ml / 100 mm schaal) en incubeer ze gedurende 5 minuten met tussenpozen schommelen.
5. Voeg grote hoeveelhedensteriel gedeïoniseerd H ₂ O aan de "matrix producent" schaal, ten minste 20 ml per 100 mm schaal, met schommelstoelen, en giet weg het cellysaat in een geschikte afvalcontainer.
6. Herhaal stap 3,5 vier keer om de volledige verwijdering van de ammoniumhydroxide-oplosbaar materiaal te waarborgen.
   LET OP: De ECM door de "matrix producent" cellen afgezet op de dekglaasjes biedt dan een steriele ECM voor functionele assays met enige testcellen van belang.
7. Incubeer de testcellen uit de cel stock schaal met 1,5 ml trypsine-EDTA-oplossing per 100 mm schaal (0,05% w / v trypsine en 0,02% w / v EDTA in gebalanceerde zoutoplossing Hank's) tot de testcellen worden losgemaakt van de schotel . Voeg cel medium, centrifuge de test cellen op 400 xg gedurende 5 minuten, en verwijder de bovenstaande vloeistof.
8. Resuspendeer de testcellen in vers, steriel medium en tellen in een hemocytometer. Plate een passend aantal van deze testcellen op de steriele, geïsoleerde ECM op coverslips. Cultuur hen in de juiste cel medium voor 2-3 uur, of voor de tijd die nodig is voor de experimentele opzet.
9. Om de organisatie van het actine cytoskelet te onderzoeken, bevestig de testcellen in 2% PFA en vlekken ze met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) -phalloidin (excitatie = 490 nm en emissie = 525 nm) te visualiseren F-actine en met 4 ', 6 -diamidino-2-phenylindole (DAPI; excitatie = 358 nm en emissie = 461 nm) om de kernen ¹¹ te visualiseren.
   Opmerking: Vergelijk de morfologie en actine organisatie in de test cellen op heterologe cellen afgeleide ECM met testcellen uitgeplaat op hun ECM.

4. Isolatie van ECM voor SDS-PAGE, immunoblotanalyse of Proteomics

1. Grow hechtende cellen van de rente op 100 mm celkweek gerechten (5-10 gerechten voor proteomics of 1-2 gerechten voor immunoblotting) voor 24-96 uur, afhankelijk van het celtype, om secretie en afzetting van ECM mogelijk te maken.
2. Verwijder de cellen als descrIBED in stappen 1,1-1,5.
3. Kantelen elke plaat een hoek om resterende H ₂ O afvoer aan de bodem van de schaal, en verwijder alle resterende H ₂ O met een p200 pipet totdat de plaat volledig droog.
4. Tegelijkertijd warmte SDS-PAGE monsterbuffer bevattende 100 mM dithiothreitol (DTT) tot 95 ° C gedurende 2 minuten met een verwarmingsblok en vervolgens toevoegen aan de plaat. 200 pl monsterbuffer per 100 mm plaat is geschikt voor monsters met immunoblot te onderzoeken.
   1. ECM door massaspectrometrie geanalyseerd, bereiken een meer geconcentreerde monster door het verzamelen van de SDS-PAGE monsterbuffer van de schaal (zoals beschreven in stap 4.5 en 4.6, hieronder), opnieuw te verwarmen tot 95 ° C, en met dezelfde hoeveelheid in 2-3 extra schotels.
5. Gebruik een cel schraper om grondig te schrapen de ECM uit de schotel, ervoor te zorgen dat alle gebieden van het gerecht zijn geschraapt.
6. Met celschraper verzamelen van het monster aan een kant van de schaal en verwijderen met een 200pi pipetpunt in een buis.
7. De eventueel achtergebleven SDS-PAGE monsterbuffer uittreksel uit de cel schraperuiteinde in de buis om het verlies van ECM materiaal te minimaliseren. Voor een geconcentreerd monster, re-verwarmen hetzelfde SDS-PAGE sample buffer monster tot 95 ° C en opnieuw te gebruiken het over 2-3 extra borden.
8. Los het ECM eiwitten door SDS-PAGE ^12, met behulp van 7% of 4-7% gradiënt polyacrylamide gels.
   LET OP: Het is handig om pre-lood eiwit markers te gebruiken.
9. De resolutie van het hoge molecuulgewicht ECM eiwitten, het beleid gel looptijd zodanig dat de 37 kDa molecuulgewicht merker loopt dicht bij de bodem van de gel en molecuulgewichtsmerkers <37 kDa werking van de gel.
10. Voor proteomics analyse van ECM eiwitten, vlekken op de gel met een eiwit vlek en vastleggen van een beeld. Snijd banden van interesse van de gel, verteren ze met trypsine en analyseren door matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) -massa spectrometrie ^13.
11. Als alternatief voor een meer uitgebreide analyse van de ECM-extract en het gehele monster te analyseren, snijd de gel laan in secties, verteren ze met trypsine, en het uitvoeren van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) ^14.
12. Als alternatief voor immunoblotting ^15, transfer eiwitten van de SDS-PAGE gel op polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan bij 15 V gedurende ten minste 1 h 10 min (semi-droge methode) de overdracht van het hoge molecuulgewicht ECM eiwitten garanderen . Visualiseren het totale eiwit overgebracht naar het membraan met Ponceau S kleuring.
13. Na stap 4.11, gebruikt antilichamen om de aanwezigheid vast te stellen en / of een semi-kwantitatieve analyse van de individuele ECM eiwitten ^15.
    1. Blokkeer het membraan met 2% (w / v) melk in TBS-Tween 20 (blokkerende buffer) overnacht bij 4 ° C. Verdun specifieke antilichamen ECM eiwitten in blokkerende buffer en geïncubeerd met het membraan gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur (antilichaam tegen fibronectin verdund 1/600 en antilichaam tegen thrombospondin-1 verdund 1/150; Aanvullende Tabel 1).
    2. Test de kwaliteit van de ECM isolatie door het opnieuw sonderen dezelfde blot met antilichamen tegen overvloedige intracellulaire proteïnen, zoals actine en tubuline (anti-actine verdund 1 / 10.000 en anti-tubuline verdund 1/5000).

Results

De beschreven protocol stappen 1,1-1,5 handelingen om cellen te verwijderen en achter de cel afkomstige ECM. Het protocol werd uitgevoerd op COS-7-cellen gekweekt gedurende 96 h op dekglaasjes uitgevoerd en de cellen afgeleide ECM werd geanalyseerd met fluorescentiemicroscopie. Het ammoniumhydroxide behandeling verwijderd doeltreffend de cellen, zoals vastgesteld door het verlies van de celkernen en actine cytoskelet volgens DAPI kleuring en phalloidin respectievelijk (figuur 1). De extractie van cellen met 2 M ureum was niet zo effectief als ammoniumhydroxide; sporen en DAPI kleuring phalloidin werden gedetecteerd na behandeling. 8 M ureum had hetzelfde effect als ammoniumhydroxide (figuur 1). Vervolgens werd de cel afkomstige ECM zichtbaar voor en na de behandeling ammoniumhydroxide (stappen 2,1-2,11). COS-7-cellen werden getransfecteerd met een monomere fluorescerende proteïne (mRFP) gemerkte thrombospondine-1 C-terminale trimeer (mRFPovTSP1C) ¹1 en gekweekt op een 35 mm schotel met een gerasterde glazen voet.

Twee uur na de plating, een geschikte raster vierkante die meerdere gezonde cellen die mRFPovTSP1C bevatte werd gevisualiseerd onder een confocale microscoop. Image Een verwijzing fase contrast werd genomen van dit gebied, en vervolgens fluorescentie time-lapse imaging werd elke 1 min 2 uur (Figuur 2A) uitgevoerd. Cellen werden vervolgens verwijderd met ammoniumhydroxide en dezelfde rastervak ​​op de schotel is verplaatst onder fasecontrast en vervolgens opnieuw geanalyseerd door fluorescentie microscopie. De cellen waren niet meer aanwezig in het raster plein, maar mRFPovTSP1C bleven binnen de ECM, gedetecteerd door fluorescentie microscopie als kenmerkend puncta (Figuur 2A). Elke mRFPovTSP1C afgezet in de ECM vóór verwijdering cel werd geïdentificeerd door vergelijking van de fluorescentie patroon voor en na verwijdering van cellen. De fluorescerende puncta die in beide beelden (Figure 2A, bijvoorbeeld pijlen) worden afgeleid geassocieerd met de ECM.

Ammoniumhydroxide behandeling werd vervolgens gebruikt om natieve ECM isoleren uit gekweekte, hechtende cellen. Menselijke dermale fibroblasten (HDF) werden gekweekt op dekglaasjes gedurende 96 uur. De cellen werden verwijderd met ammoniumhydroxide en de ECM werd gesondeerd met een anti-collageen I antilichaam, dat een karakteristiek fibrillair en meshwork kleuringspatroon ¹⁶ (figuur 2B) aangetoond. Fibronectine patroon werd onderzocht rond vaste, niet-gepermeabiliseerde cellen chondrosarcoma rat (RCS) en in de ECM na het verwijderen van de RCS-cellen (Figuur 2C). De ammoniumhydroxide isolatie van ECM werd ook uitgevoerd onder steriele omstandigheden uitgevoerd zodat "test" cellen kunnen opnieuw worden verzilverd op de ECM voor fenotypische of functionele studies. Bijvoorbeeld, "test" COS-7 cellen werden gedurende 2 uur op steriele ECM door RCS cellen en tanneer zij werden vastgesteld, permeabel gemaakt en geanalyseerd op F-actine organisatie door FITC-phalloidin kleuring in vergelijking met COS-7 cellen die hun ECM (stappen 3,1-3,9) (figuur 3).

Op grotere schaal, werd de methode voor ECM isoleren biochemische. Zo werden RCS cellen gekweekt op twee 100 mm celkweek gerechten voor 7 dagen, en de procedures in de stappen 4,1-4,7 werden gevolgd. Eiwitten in de cel afkomstige ECM werden verzameld door schrapen ze in hete SDS-PAGE monsterbuffer en werden gescheiden door SDS-PAGE op een 7% polyacrylamidegel onder reducerende omstandigheden. De gel werd gekleurd voor eiwit en de vier hoofdbanden werden elk geïsoleerd en geanalyseerd met massaspectrometrie (figuur 4A). Een aantal ECM eiwitten, waaronder fibronectine, thrombospondine 1 (TSP1), trombospondine 5 / kraakbeen oligomeer matrixproteïne (TSP5 / COMP) en matrilin-1 werden geïdentificeerd (Figuur 4B).

Als alternatief kunnen kleinschaliger bereidingen van ECM worden geëvalueerd door immunoblots. Bijvoorbeeld, cellen afgeleide ECM van COS-7 cellen die ectopisch tot expressie mRFPovTSP1C werd gescheiden door SDS-PAGE, overgebracht naar een PVDF membraan en onderzocht voor RFP met een anti-RFP antilichaam (Figuur 4C). Deze techniek is gevoelig genoeg om verschillen tussen met een natief trimeer van TSP1 (mRFPovTSP1C) en een aangelegde pentameer van het TSP1 C-eindstandige gebied (mRFP-TSP-5-1C) ¹⁷ (figuur 4C) detecteren. De endogene ECM van HDF onderzoeken, de aanwezigheid van specifieke eiwitten in cellysaat of geïsoleerde ECM werd onderzocht door immunoblotting. De kenmerkende ECM eiwitten fibronectine en thrombospondine-1 gedetecteerd in de ECM, terwijl de overvloedige intracellulaire eiwitten α-tubuline en β-actine afwezig het geïsoleerde ECM (Figuur 4D) waren.

Figuur 1: Vergelijking van manieren Cell verwijderen. COS-7-cellen werden bij hoge dichtheid gedurende 96 h op dekglaasjes, in 2% PFA gefixeerd en gepermeabiliseerd in 0,5% Triton X100, of behandeld zoals aangegeven voor celverwijdering. De dekglaasjes werden vervolgens gekleurd met FITC-phalloidin visualiseren F-actine en DAPI om kernen te visualiseren. Schaal bar = 25 pm. Dit cijfer wordt gewijzigd van een originele publicatie in het Journal of Cell Science ^11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Identificatie van ECM eiwitten in geïsoleerde ECM. (A) Fase-contrast en fluorescentie beelden vanCOS-7 cellen die mRFPovTSP1C en gekweekt op een 35 mm schaal met een doorzichtige bodem, gerasterde basis voor 2 uur. Beelden worden weergegeven voor en na de verwijdering van de cellen door ammoniumhydroxide. De rand van de letter rooster wordt in het fasecontrast beelden met een stippellijn. Witte pijlen geven voorbeelden van fluorescerende puncta die voor en na celverwijdering aanwezig waren. (B) Detectie van collageen I in HDF ECM door indirecte immunofluorescentie. HDF werden gedurende 96 uur en verwijderd met ammoniumhydroxide en de ECM werd gekleurd voor menselijk fibrillair collageen I. De ECM werd gekleurd met FITC-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam alleen. (C) Lokalisatie van fibronectine rond RCS cellen of in geïsoleerde RCS ECM, zoals gedetecteerd door indirecte immunofluorescentie. RCS cellen werden gedurende 48 uur in 2% PFA gefixeerd en gekleurd met DAPI en fibronectine. Parallel schotels werden cellen verwijderd met 20 mM ammoniumhydroxide en de ECM werd gekleurd voor fibronectin en met DAPI. Cellen werden gekleurd met FITC-geconjugeerd anti-muis IgG antilichaam alleen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Het gebruik van steriel ECM voor functionele studies. RCS "matrix producerende" cellen werden gedurende 48 uur op glazen dekglaasjes en behandeld met 20 mM ammoniumhydroxide onder steriele omstandigheden om de cellen te verwijderen. COS-7 "test" cellen werden uitgeplaat op dekglaasjes met of zonder geïsoleerde RCS ECM gedurende 2 uur in 2% PFA gefixeerd, gepermeabiliseerd in 0,5% Triton X100 en gekleurd met FITC-phalloidin aan F-actine en DAPI om kernen te visualiseren visualiseren . COS-7 cellen op RCS ECM verspreid uitgebreider en vormden grote gloeidraad bundels (bijvoorbeeld pijlen) en de rand kemphaanles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Identificatie van eiwitten uit geïsoleerde ECM door SDS-PAGE, massaspectrometrie of immunoblotting. (A) RCS cellen werden gedurende 7 dagen en verwijderd met 20 mM ammoniumhydroxide; de ECM werd geschraapt omhoog in hete SDS-PAGE sample buffer met 100 mM DTT. De ECM preparaat werd gescheiden door SDS-PAGE op een 7% polyacrylamidegel onder reducerende omstandigheden. Vier significante banden (pijlen 1-4) geïdentificeerd door eiwitkleuring. (B) eiwitten van RCS ECM groepen 1-4 werden geïdentificeerd door MALDI massaspectrometrie. (C) COS-7 cellen die ofwel mRFPovTSP1C (trimeer) of mRFP-TSP-5-1C (pentameer) werden gedurende 48h en verwijderd met 20 mM ammoniumhydroxide en de ECM werd geïsoleerd in hete SDS-PAGE monsterbuffer bevattende 100 mM DTT. De ECM preparaat werd gescheiden door SDS-PAGE op een 7% polyacrylamidegel onder reducerende omstandigheden, overgebracht naar een PVDF membraan en gemerkt met een anti-RFP antilichaam. Dit paneel wordt gewijzigd van een originele uitgave in de bio-rapporten ^17. (D) HDF werden gedurende 96 uur en vervolgens behandeld met ofwel 2% deoxycholzuur in PBS (cellysaat) of 20 mM ammoniumhydroxide om cellen te verwijderen. De ECM werd afgeschraapt in hete SDS-PAGE sample buffer. De twee fracties werden gescheiden door SDS-PAGE op een 10% polyacrylamidegel onder reducerende omstandigheden, overgebracht naar een PVDF membraan en gemerkt met antilichamen, zoals aangegeven. In elk paneel, worden de posities van molecuulgewichtsmerkers in kDa aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze fi bekijkenguur.

Discussion

Kritische stappen in het protocol

De methode heeft een aantal kritische stappen die moeten worden gevolgd om de succesvolle isolatie en analyse van ECM te waarborgen. Zo wordt ammoniumhydroxide gebruikt om de cellen te verwijderen en ECM isoleren voor analyse. Hoewel ammoniumhydroxide stabiel in waterige oplossingen in het donker en kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen, flessen moeten goed opnieuw gesloten tussen elk gebruik. Omdat het gas kan verdampen uit de oplossing, waardoor de concentratie verminderen, raden we starten van een frisse fles om de 6-8 weken. Bovendien moet de werkoplossing vers gemaakt voor elk experiment. Het is ook essentieel dat de cellen volledig zijn verwijderd met overvloedige wassingen in gedeïoniseerd water. Als deze stappen niet voldoende worden uitgevoerd, kan celmateriaal op de schotel blijven en vervuilen downstream analyses. Indien cellen werden gekweekt gedurende 10 dagen of langer, kan extra water wassingen nodig zijn. Het is belangrijk om noot dat de geïsoleerde ECM laag is typisch zeer dun in vergelijking met de cellen ^11, dat zorg nodig is bij het identificeren van de ECM tijdens de beeldvorming. Voor doelmatige winning van de geïsoleerde ECM in SDS-PAGE monsterbuffer, is het essentieel dat de monster buffer bevat een reductiemiddel. Voor de meest effectieve verwijdering van de ECM, moet kokend hete monsterbuffer gebruikt. Voor experimenten waarbij ECM monsters worden opgelost door SDS-PAGE elektroforese voor eiwitkleuring of proteomics, is het essentieel om een ​​geconcentreerd monster te bereiken door schrapen verschillende platen-waarde van ECM in dezelfde hoeveelheid monsterbuffer.

Wijzigingen en problemen oplossen

De productie en secretie van ECM eiwitten kan sterk variëren tussen celtypen, zodat termijnen voor secretie en afzetting van ECM moet de novo worden bepaald voor elk celtype. Het is ook belangrijk te weten dat ECM samenstelling dynamisch verandert met betrekking to celdichtheid en tijd in de cultuur ^18. Deze factor moet rekening worden gehouden bij het ontwerpen experimenten. Is duidelijk dat de selectie van een celtype voor deze methode is belangrijk, vooral bij het uitpakken ECM voor analyse met massaspectrometrie, die een aanzienlijke hoeveelheid totale eiwitten ECM nodig.

Beperkingen van de Techniek

Cellen die zeer lage niveaus van ECM eiwitten uitscheiden extra uitdaging voor gebruik met deze methode. Niet-hechtende cellen, 3D celculturen of celinvasie assays ongeschikt thans voor ECM isoleren volgens deze methode. De werkwijze is vooral geschikt voor gebruik met standaard "2-dimensionale" celkweken. Omdat de ammoniumhydroxide extractie verwijdert de cellen volledig, ECM verbonden aan de bovenzijde van cellen en uitgescheiden, maar niet verknoopt zijn ECM eiwitten ook verwijderd, waarbij de schotel een dunne laag samengesteld ECM van beneden en rond de hellingen van de cellen ^11,17 . Het complex te kwantificeren hoeveel ECM wordt vrijgegeven door de ammoniumhydroxide extractie, omdat de vrijgekomen stof ook ECM eiwitten die intracellulaire ofwel voorafgaand aan secretie of na opname van het celoppervlak.

Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods

De mogelijkheid om een ​​breed scala aan experimenten met geïsoleerde ECM uit te voeren is het belangrijk in het kader van celbiologie en weefsel fysiologie, en het heeft ook gevolgen voor het gebied van weefselregeneratie en tissue engineering. De methode heeft voordelen ten opzichte van gels gevormd uit gezuiverd collageen of andere gezuiverde ECM eiwitten in dat de cellen assembleren complex ECM structuren op hun eigen formaat, met native verknoping mechanismen en met individuele ECM eiwitten die aanwezig zijn in verhoudingen aangepast aan de celtype van herkomst. Bijvoorbeeld, het proteomische studie van RCS ECM toonden overvloedige matrilins en COMP / TSP5, zoals verwacht vooreen kraakbeenachtige ECM ^19,20 (figuur 4). In het algemeen wordt de analyse van cellen afgeleide ECM belemmerd door het karakter van een omvangrijke, proteïnenetwerk dat resulteert in covalente verknoping en de onoplosbaarheid van vele ECM-eiwitten, alsook door de potentiële verontreiniging van ECM extracten met intracellulaire eiwitten. Een multi-step procedure ontworpen om de ECM-fractie uit weefsels voor proteoomanalyse isoleren leverde 8% van de ECM eiwitten in de totale groep eiwitten geïdentificeerd ^21. Echter, peptiden van ECM eiwitten waren 73% van de totale peptiden geïdentificeerd. Deze methode voor isolatie en analyse van cellen afgeleide ECM snel en betrouwbaar het celmateriaal behoud ECM eiwitten. Deze methode kan worden gebruikt voor diverse celtypes en verdere toepassingen en vergemakkelijkt de analyse van ECM biologie en cel-ECM interacties in celkweek. De protocollen detail hoe de werkwijze op verschillende schalen kan worden toegepast op een breed scala aan exp pakkenerimental vragen met betrekking tot ECM organisatie, dynamiek, of samenstelling, en de functionele effecten van geïsoleerde ECM op cellen.

Toekomstige toepassingen of richtingen na Mastering deze techniek

Kijkend naar de toekomst, kan de methode worden aangepast voor gebruik met 3D celculturen; dit zou de fysiologische relevantie te breiden. Cellen ontdane natief weefsel heeft groot potentieel als een matrix voor de regeneratie van verloren of beschadigde weefsel en als alternatief voor transplantatie, bijvoorbeeld na hartfalen ^22. Het heeft de potentie om de problemen van donor beschikbaarheid en immunoafstoting overwinnen. Toekomstige toepassingen van de in dit verslag beschreven werkwijze kan het gebruik ervan met 3D celculturen of weefsel ontcelling, die verder de reikwijdte van deze benadering zou toenemen onderzoeken.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody to COL1A1	Novus	NB600-408	Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200
Antibody to fibronectin	Sigma	F3648	Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 h. IF: 1/200
Antibody to thrombospondin 1	ThermoFisher	MA5-13398	Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 h
Antibody to RFP	Abcam	ab62341	Rabbit polyclonal. WB: 1/2,000 for 2 h
Antibody to β-actin	Sigma	A1978	Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10,000 for 1.5 h
Antibody to α-tubulin	Sigma	T9026	Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5,000 for 1.5 h
Cell Tracker Green	ThermoFisher	C2925	Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin	Sigma	P-5282	Stock = 50 mg/mL in DMSO. 1/50 for 45 min
FITC-conjugated goat anti-mouse IgG	Sigma	F8771	IF: 1/50 for 1 h
FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG	SIgma	F7512	IF: 1/50 for 1 h
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-80010	WB: 1/50,000 for 1 h
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG	LI-COR	926-80011	WB: 1/100,000 for 1 h
Vectorshield mounting medium with DAPI	Vector	H-1200	Store at 4 °C in the dark
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D6429	Warm before use
Fibroblast growth medium	PromoCell	C-23010	Warm before use, supplement with 50 µg/mL ascorbic acid
Phenol red-free DMEM	ThermoFisher	21063-029	Warm before use
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm before use
Gridded glass-bottomed dish	MatTek	P35G-2-14-C-GRID
NH4OH, 28-30% solution	Sigma	221228	Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped.
Paraformaldehyde, 16% solution	Alfa Aesar	43368	Dilute to 2% (v/v) in PBS
Deoxycholic acid	Sigma	D2510	Use at 2% (v/v) final concentration
Triton X-100	Sigma	T8787	Dilute to 0.5% (v/v) final concentration
GelCode Blue stain reagent	ThermoFisher	24590	Protein stain for SDS-PAGE gels
Precision Plus protein standards	Biorad	161-0374	Protein standards for SDS-PAGE gels
Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell	Biorad	1703940	Efficient transfer of high molecular weight proteins
PVDF transfer membrane	Millipore	ISEQ00010	Immobilon-PSQ
Ponceau S stain	Sigma	P7170	Reversible protein stain for PVDF membrane
WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate	LI-COR	926-80200
High performance chemiluminescence film	GE Healthcare	28906837
Sterile filtration unit, MILLEX-GV	Millipore	ML481051
SP8 AOBS confocal laser scanning microscope	Leica		Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services)
Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot