Met een GFP-gelabeld TMEM184A Construct voor bevestiging van Heparine Receptor Identity

Samenvatting

Een construct dat codeert TMEM184A met een GFP-tag aan het carboxy-uiteinde ontworpen voor eukaryotische expressie, werd gebruikt in testen die de identificatie van TMEM184A als heparine receptor in vasculaire cellen bevestigen.

Samenvatting

Wanneer nieuwe eiwitten worden geïdentificeerd door middel van affiniteit gebaseerde isolatie en bioinformatica-analyse, zijn ze vaak grotendeels ongekarakteriseerd. Antilichamen tegen specifieke peptiden binnen de voorspelde sequentie toelaten dat sommige lokalisatie experimenten. Echter, andere mogelijke interacties met de antilichamen vaak niet worden uitgesloten. Deze situatie bood de gelegenheid om een ​​reeks assays afhankelijk van de eiwitsequentie ontwikkelen. Specifiek, een construct bevattende de gensequentie gekoppeld met de GFP coderende sequentie aan het C-terminale uiteinde van het eiwit werd verkregen en gebruikt voor deze doeleinden. Experimenten te karakteriseren lokalisatie, ligand affiniteit en versterking van de functie werden oorspronkelijk ontworpen en uitgevoerd om de identificatie van TMEM184A als heparine receptor ¹ bevestigen. Bovendien kan het construct worden gebruikt voor studies naar membraantopologie vragen en gedetailleerde eiwit-ligand interacties. Het voorliggende rapport presenteert arange experimentele protocollen gebaseerd op het GFP-construct TMEM184A expressie gebracht in vasculaire cellen die gemakkelijk kunnen worden aangepast voor andere nieuwe eiwitten.

Inleiding

Identificatie van gegadigde eiwitten voor nieuwe functies vaak afhankelijk affiniteit gebaseerde isolatie protocollen gevolgd door een gedeeltelijke sequentiebepaling. Recente voorbeelden van nieuw geïdentificeerde eiwitten omvatten transmembraaneiwit 184A (TMEM184A), een heparine receptor geïdentificeerd na heparine-affiniteit interacties ^1, en TgPH1, een pleckstrin homologie domein eiwit dat fosfoinositide PI (3,5) _P2 ² bindt. Andere nieuwe proteïne-identificatie omvat directe sequentieanalyse van peptiden zoals door Vit, et al. die vroeger transmembraan peptiden aan eiwitproducten te identificeren sinds de voorgaande uncharacterized genen ^3. Evenzo kan identificatie van nieuwe eiwitsequenties worden uitgevoerd met bioinformatica zoeken van eerder gekarakteriseerde eiwitten families zoals de identificatie van nieuwe eiwitten 4TM ^4. Onderzoek van aquaporine familie gensequenties heeft alzo leverde de identificatie van nieuwe leden met nieuwe functies ^5. Na identificatie, analyse van eiwitfunctie typisch een volgende stap die soms kunnen worden onderzocht met een specifieke assay van eiwitfunctie, zoals in het geval aquaporine.

Indien mogelijk, kan de functie van een onlangs geïdentificeerd eiwit, met specifieke enzymatische of vergelijkbare functie in vitro assays. Omdat veel functies van nieuwe eiwitten afhankelijk complexe interacties die alleen voorkomen in intacte cellen of organismen in vitro testen zijn niet altijd effectief. Wel moet de in vivo assays worden ontworpen zodanig dat deze afhankelijk gensequentie. In celcultuur en / of eenvoudig model organismen, kan knock-down bewijsmateriaal in te dienen voor het eiwit / functie identificatie ^6. Met nieuwe eiwitten die zoals hierboven vermeld, is het vaak voldoende om alleen neerhalen een eiwit functie te bevestigen, eend de opzet van in vivo functionele assays die afhankelijk gensequentie wordt belangrijk voor de karakterisering van nieuwe eiwitten.

De recente identificatie van TMEM184A als heparine receptor (die moduleert proliferatie in vasculaire gladde spieren en ontstekingsreacties in endotheelcellen) middels affiniteitschromatografie en MALDI MS ^{1, 7} bood de gelegenheid om een verzameling assays ontwikkelen na knockdown vruchten afgeworpen in overeenstemming met de identificatie . Een recente beoordeling bevestigde dat heparine interageert specifiek met veel groeifactoren, hun receptoren, extracellulaire matrix componenten, celadhesie receptoren en andere eiwitten ^8. In het vaatstelsel, heparine en heparansulfaat proteoglycanen (met heparansulfaat ketens gelijksoortige structuur heparine) interageren met honderden proteïnen ^9. Om functioneel te bevestigen that TMEM184A was betrokken bij heparine opname en binding, technieken die het gen construct voor TMEM184A tewerkgesteld werden ontwikkeld. Het huidige rapport bevat een verzameling van testen op basis van een GFP-TMEM184A construct voor gebruik bij de bevestiging van de identiteit van TMEM184A als heparine receptor.

Protocol

1. Ontwerp van een GFP-eiwit Construct

1. Aankoop, of het ontwerp en de bouw, een GFP-tag construct op basis van het eiwit in kwestie.
   OPMERKING: Bij een gekochte construct standaard vectoren zijn verkrijgbaar bij commerciële laboratoria dat sommige of alle van de volgende suggesties omvatten: Voor een membraaneiwit, selecteer een C-terminale plaats van het GFP omdat het minder waarschijnlijk verstoort membraaneiwit handel. Beschouw een verlenging tussen het gen van interesse en GFP indien aannemelijk is de C-terminus van het eiwit betrokken compact gevouwen in een domein van het proteïne. Selecteer het construct voor algemene eukaryotische cel meningsuiting, maar laat de bouw van de productie in bacteriële systemen. Onder een splitsingsplaats (zoals de TEV protease) waardoor GFP desgewenst sommige experimenten waarbij het GFP kunnen interfereren met de eiwitactiviteit kunnen worden verwijderd. Voeg andere inserts, zoals een extra tag voor het lokaliseren of affiniteit ininteracties (bijvoorbeeld His6). Dit was niet nodig de hierin beschreven assays, maar kan andere testen te vergemakkelijken, of nuttig zijn direct grenzend aan het gen voor het GFP, indien verwijderd GFP gewenst.

2. GFP-TMEM184A Expressie in vasculaire cellen

1. Cultuur endotheelcellen of vasculaire gladde spiercellen op 0,2% gelatine beklede weefselkweekplaten zoals eerder ^{1, 6, 7} gerapporteerd.
2. Voeg 5 ml celkweek trypsine-oplossing (0,5% w / v) aan een gespoeld 100 mm of groter, confluente schaal cellen. Incubeer bij 37 ° C totdat de cellen juist kunnen bewegen van de plaat, en breng de cellen naar een steriele polypropyleen centrifugebuis.
3. Voeg een trypsineremmer (bijvoorbeeld een gelijk volume normale kweekmedium), zoals gebruikt in de routine cultuur, de cel / trypsine oplossing trypsineactiviteit beperken. Pellet de cellen gedurende 5 minuten bij approximlijk 600 xg (of de juiste snelheid en tijd om gewoon pellet de cellen voor standaard weefselkweek). Zuig het supernatant.
4. Resuspendeer cellen in 1 ml HeBS (Hepes-gebufferde zoutoplossing) elektroporatiebuffer beperking van de hoeveelheid tijd cellen in de pellet of suspensie. Plaats de celsuspensie op ijs en uit te voeren overige stappen op het ijs.
   LET OP: Pellet kan worden gewassen eenmaal met HeBS voorafgaand aan resuspensie.
5. Voeg voldoende hoeveelheid GFP-gelabeld TMEM184A plasmide aan de cellen tot een eindconcentratie van 20 ug / ml DNA bereiken. Gebruik een identiek protocol voor een GFP-construct.
6. Leg ongeveer 0,4 ml van de celoplossing HeBS in een elektroporatie cuvet. Pre-chill de cuvetten voor gebruik.
7. Electroporate de cellen onder de volgende omstandigheden: exponentieel, 500 uF, ∞ ohm en 170 V.
   OPMERKING: De spanning voor een bepaald celtype worden geoptimaliseerd. Voorlopige studies met endotheel- en gladde spier cell types werden bereikt met een GFP-construct vinculin de optimale spanningswaarde opgemerkt, bijvoorbeeld ¹⁰ bepalen.
   1. Om elektroporatie te optimaliseren, te beginnen met de aanbevelingen van de fabrikant van het apparaat (die de voorwaarden voor een aantal standaard celtypen bevatten). Gebruik het gewenste construct of control fluorescerend eiwit construct vergelijkbaar in grootte en fluorescerende eigenschappen voor de gewenste construct.
      OPMERKING: Kleine nucleïnezuren lijken cellen gemakkelijker voer dan grotere constructies, zodat een construct slechts een fluorescerend eiwit gemakkelijker te drukken dan een groter een.
   2. Met fluorescentiemicroscopie levensvatbaarheid van de cellen, het percentage cellen waarin het fluorescerende construct tot expressie wordt gebracht na 24 en 48 uur, en de intensiteit van expressie te bepalen.
      LET OP: Verlaag de spanning en / of tijd iets als overleving laag is. Doel voor de kortst mogelijke tijd tussen de release van de cellen uit de kweek oppervlak en de terugkeercellen aan de cultuur om te overleven te vergroten. Een lichte toename in de tijd of een tweede puls kan construct opname verbeteren als de overleving is hoog en expressie is laag. Optimale omstandigheden en expressie zullen variëren tussen celtypen. Indien het percentage van cellen die het construct is hoog, maar intensiteit is laag, waardoor de DNA-concentratie en bewaken van de getransfecteerde cellen in de tijd voor een optimale intensiteit die varieert afhankelijk van halfwaardetijd van het eiwit en expressie, kan de intensiteit verbeteren. Kleuring intensiteit kan worden vergroot voor sommige assays eventueel door immunofluorescentie kleuring van GFP met anti-GFP antilichamen
8. Na elektroporatie, het zaad van de cellen in zes 30 mm weefselkweek wells met dekglaasjes voor imaging of in weefselkweek gerechten. Kweken van de cellen onder toepassing van standaard celkweek procedures.
9. Optioneel: Vervang het kweekmedium na 24 uur aan een HeBS elektroporatie buffer te verwijderen.

3. Visualisatie van GFP-TMEM184A Localization

1. Spoel de cellen met PBS en voorzichtig schudden na kweken gedurende ten minste 24 uur. Beperk blootstelling aan fel licht om GFP verkleuring te voorkomen.
2. Fix cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Gebruik geen methanol bevattende reagentia die de cellen permeabel. Fixatie met methanol kan worden gebruikt als het niet nodig ligand interacties te evalueren.
   Let op: Paraformaldehyde is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Gebruik in een zuurkast, met zorg, en correct ontdoen.
3. Spoelen met PBS zoals hierboven. Voor antilichamen gebaseerde vlekken, zie 3.6 hieronder.
4. Mount coverslips om dia's met behulp van Mowiol of een ander geschikt montage medium.
5. Afbeelding dia's met behulp van een confocale of fluorescentiemicroscoop met de juiste filter sets voor GFP excitatie en emissie spectra. Confocale microscopie heeft de voorkeur vanwege de mogelijkheid om monsters te scheiden in het z-vlak. Bewaar afbeeldingen in grijstinten voor quantitation doeleinden in TIF-formaat (in aanvulling op full colour afbeeldingen voor illustraties).
6. Ter vergelijking met WT TMEM184A door de cellen tot expressie bereiden andere cellen voor immunofluorescentie gebruikmakend van primaire antilichamen bereid op een peptide (s) vanaf het TMEM184A sequentie, bijvoorbeeld ^1. Identificatie van GFP-TEMEM184A kan ook mogelijk met antilichamen tegen GFP. Evalueer beide celmonsters door identieke microscopische technieken.

4. Rhodamine-Heparine Binding en colocalisatie met GFP-TMEM184A-getransfecteerde cellen

1. Behandel GFP-TMEM184A tot expressie brengende cellen met 100 ug / ml rhodamine-heparine toegevoegd aan kweekmedium en laat cellen incuberen gedurende een bepaalde tijd, typisch minder dan 10 min voor A7r5 cellen. Spoel en bevestig zoals in 3.1 en 3.2.
   OPMERKING: De optimale tijd en concentratie van ligand afhankelijk celrespons, fluorescentie-intensiteit van het ligand en beeldintensiteit verkregen. dit concentration van heparine werd gebruikt omdat het leidt tot meer dan 50% respons in andere testen ^11. Deze concentratie kan worden gevisualiseerd met behulp van standaard fluorescentie microscopie technieken, dus het was niet nodig om het te verhogen. Verdunning van rhodamine-heparine met ongelabelde heparine resulteert in lagere fluorescentie in de cellen, is dus moeilijker om de afbeelding en te kwantificeren.
2. Om de rhodamine-heparine binden als gevolg van GFP-TMEM184A transfectie kwantificeren, identieke cellen te bereiden zonder getransfecteerd GFP-TMEM184A.
3. Beeld de cellen met behulp van een confocale microscoop met de geschikte GFP (488 nm) en rhodamine (543 nm) excitatie en emissie (500-530 nm voor GFP en groter dan 560 nm voor rhodamine) waarden co-localisatie. beelden van ten minste 50 cellen te verkrijgen uit ten minste drie afzonderlijke experimenten statistieken te verkrijgen. Onderhouden identieke instellingen in experimenten, en gebruik van een controlemonster (s) (bijvoorbeeld getransfecteerde cellen zonder behandeling) eten kunnen worden gebruikt om te normaliseren en analyse van meerdere experimenten.
4. Onderzoek de beelden met behulp van een computerprogramma om relatieve rhodamine bepalen binding / opname in elke cel voor kwantificering van binding.
   OPMERKING: TIF beelden moet indien zij geschikt voor analyse en kunnen worden omgezet in grijs schaal in vele computerprogramma's als ze niet oorspronkelijk zijn opgeslagen in dat formaat. Afbeelding J (freeware) werd in deze analyse en maakt stippellijn pixel intensiteit te meten van een door de gebruiker gedefinieerde gebied een beeld.
   1. Gebruik een uit de losse hand op een cel cirkel binnen een tl-imago en het gebruik van de maatregel instrument om de intensiteit binnen die ruimte te bepalen.
      Opmerking: Deze metingen verschaffen de benodigde informatie om de totale intensiteit te berekenen voor een door de gebruiker gedefinieerde gebied (hele cellen, kern, etc.) een manier om verschillende cellen te vergelijken met verschillende geometrieën. Gemiddelde intensiteit over een oppervlakte van achtergrond kan worden gemeld, en dat vergemakkelijkts collectie van de achtergrond intensiteit voor analyse.
   2. Uitvoer naar een spreadsheet voor het gebied, vermenigvuldigd met de intensiteit te berekenen en aftrekken achtergrond die evenveel gebied. Het gemiddelde van de fluorescentie / cel voor voldoende cellen / experiment om statistische significantie te verkrijgen.

5. Fluorescence Resonance Energy Transfer van GFP-TMEM184A aan Rhodamine-heparine

1. Bereid getransfecteerde cellen en geïncubeerd met 200 ug / ml rhodamine-gelabeld ligand zoals in 3.1. Merk op dat de incubatietijd met fluorescerende ligand celtype afhankelijk. Bevestig met slechts PFA, en dia's mount voor beeldvorming.
2. Ten eerste, prikkelen bij 405 nm en het beeld voor rhodamine emissie (566-685 nm; FRET). Ten tweede, prikkelen bij 488 GFP (afbeelding bij 493-530) voor, en de derde, prikkelen op 561 voor rhodamine (afbeelding bij 566-685). Controles zonder GFP-TMEM184A of zonder rhodamine-heparine zijn kritisch.

6. live-cell imaging van Rhodamine-Heparin opname

1. Het zaad van de GFP-TMEM184A getransfecteerde cellen in individuele schotels ontworpen voor live-cell imaging en te behandelen als in protocol 3.
   Opmerking: Het aantal cellen nodig is, hangt van het celtype en gewenste dichtheid. Om de hoeveelheid tijd die cellen in suspensie een minimum te beperken, hebben de cellen niet mee. Zaad cellen van een 100 mm confluente schaal in zes 35 mm live-imaging gerechten aan cellen in de buurt van samenvloeiing te verkrijgen in 48 uur.
2. Na 48 uur, vervangen door kweekmedium medium zonder fenolrood.
3. Transfer een schotel van cellen om een ​​confocale microscoop met een warming podium om temperatuur te houden, en de focus van de microscoop.
4. Pipet 100 ug / ml rhodamine-heparine in de schaal en meng.
5. Meteen beginnen met het opnemen van live-beelden. Indien geen celopname heparine plaatsvindt binnen de regio weergeven door de schaal iets naar cellen te identificeren met ten minste één groene blaasje met het rhodamine label.
   LET OP: Imaging excitatie en emissie details zijn dehetzelfde als voor de heparine opname protocol (hoofdstuk 5). De periode tussen de beelden was ongeveer 16 s. De omstandigheden van de proef en de microscoop typisch bepaalt de snelheid waarmee beelden kunnen worden verkregen.

7. Isolatie van GFP-TMEM184A en GFP uit gekweekte cellen

1. Na verwijdering kweekmedium en spoelen met PBS, voeg 2 mL 0,2% (w / v) CHAPS 1x PBS oplossing proteaseremmers een 150 mm plaat van cellen die GFP-TMEM184A of GFP (voor controle bindingstesten). Schraap de cellen van de schotel, zet de cellen / CHAPS oplossing in een 15 ml polypropyleen buis op het ijs, en meng goed door te tikken. Voltooi alle stappen in fel licht om ervoor te zorgen het GFP-tag wordt gebleekt voor de binding assay hieronder.
2. Specifiek binden GFP-TMEM184A (of een geschikte GFP controle), voeg 2 ug / ml gebiotinyleerd anti-GFP antilichaam aan de oplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C met schommelen.
3. Voeg 500 ulstreptavidine-agarose korrels tenminste 5 ml 0,2% CHAPS / PBS en centrifugeer bij ongeveer 600 xg gedurende 3 tot 5 minuten. Verwijder het supernatant. Herhaal twee keer met verse CHAPS / PBS per keer. beads toevoegen antilichaam en cel-oplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C met schommelen om de korrels te binden aan het gebiotinyleerde anti-GFP antilichaam gebonden aan de GFP of GFP-TMEM184A.
4. Pellet de parels door centrifugeren (zoals in 7.3) en verwijder de niet-gebonden materiaal. Voeg ten minste 5 ml 0,2% CHAPS / PBS / proteaseremmers te wassen. Herhaal het wassen en centrifugeren tenminste 3x om effectief te verwijderen ongebonden eiwit.
5. Na verwijdering van de laatste wasbeurt, incubeer de bolletjes met 1 ml 0,2 M glycine / 0,2% CHAPS in PBS (pH tot 2,0 met behulp HCl) op ijs gedurende 3 min dissocieert het antilichaam-GFP binding (leidend tot vrije GFP-TMEM184A of vrij GFP). Meng voorzichtig door te tikken op elke 30 s.
6. Centrifugeer bij ongeveer 600 xg en breng het supernatant dat de gezuiverde pProtein een nieuwe 15 ml buis gevolgd door onmiddellijke neutralisatie met 5 ml 1 M natriumbicarbonaat (breng de pH op 7).
7. Concentreer het monster met behulp van een 10.000 Dalton moleculair gewicht cut-off centrifugale concentrator (in dienst centrifugeren snelheid aanbevolen door de leverancier). Wanneer het volume ongeveer 0,5 ml bereikt, voeg 0,2% CHAPS / PBS. Verder concentreren en het toevoegen van 0,2% CHAPS / PBS tot ten minste tien delen (maal het uitgangsmonster volume) van 0,2% CHAPS / PBS toegevoegd.
8. Om een ​​schatting van de hoeveelheid geïsoleerde GFP of GFP-gemerkt eiwit te bepalen, het verkrijgen van een absorptiewaarde bij 280 nm en vergelijken met een standaardcurve bereid uit runderserumalbumine of andere controle-eiwit in dezelfde buffer.
   LET OP: Door extinctiecoëfficiënt verschillen, deze concentratie is een schatting, maar kan bij benadering een eiwit concentratie verdere analyse te vergemakkelijken zonder verspilling monster. Nauwkeurige eiwitconcentratie te ontmoedigenbepaald met behulp van een micro-Lowry eiwit bepaling worden bepaald aan de standaard eiwit bereid in dezelfde buffer als het monster. Verdere analyse van het geïsoleerde eiwit kan worden bewerkstelligd door Western blotting van het geïsoleerde eiwit (met behulp van antilichaam detectie voor GFP) en vergeleken met het voorspelde molecuulgewicht. Als alternatief kan het gebruik van de TMEM184A antilichamen resulteren in een band van de voorspelde grootte construct, maar kan ook resulteren in een WT TMEM184A band als dimeren (of hogere orde oligomeren) aanwezig in het monster. Een schatting van zuiverheid kan worden verkregen door kleuring een blot van totaal eiwit van het geïsoleerde monster versus totaal eiwit uit een hoeveelheid van het uitgangsmateriaal.

8. In vitro bindingsassay Heparine

1. Bereid een zwart-avidine gecoate 96-well plaat door wassen met 200 pl 0,2% CHAPS / PBS driemaal gedurende 5 minuten onder schudden. Bereid een identieke noncoated zwarte 96-putjesplaat toepassing van dezelfde wasprocedure. Bereid eenlayout voor de experimentele monsters (in drievoud) te volgen tijdens de test. Onder meer putten voor standaard heparine concentraties buffer controles, en putten met GFP monsters zonder heparine te bleken van GFP te bevestigen.
   LET OP: Als optimale isolatie of ligand interactie buffers zijn verschillend voor het eiwit in kwestie, alles doen wat van de plaat voorbereidingen en het wassen met de optimale buffer systeem.
2. Voeg 100 pl 60 pmol / well gebiotinyleerd anti-GFP aan alle putjes in de met avidine beklede plaat waarin GFP binding wordt gewenst. De hoeveelheid antilichaam voldoende om alleen verzadigen met hoge affiniteit avidine in de putjes.
   1. buffer toe alleen op alle wells voor controledoeleinden (geen GFP of GFP-TMEM184A binding gewenst). Sluit de putten met een plaat deksel om verdamping te voorkomen. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder schudden.
      OPMERKING: Volumes toegevoegd aan de putjes en de incubatie tijden zijn gebaseerd op aanbevelingen van de provider.
3. Spoel alle wells drie keergedurende 5 min met 200 ul 0,2% CHAPS / PBS.
4. Voeg 100 ul van 5 nmol / putje GFP-TMEM184A of GFP aan putjes in de met avidine beklede plaat passende en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder schudden. Was opnieuw zoals in 8.3.
   Opmerking: Deze eiwitconcentratie werd gekozen dat alle plaatsen werden verzadigd met overmaat GFP of GFP-TMEM184A. Dit is belangrijk dat dezelfde hoeveelheid eiwit gebonden aan elke well. Lagere hoeveelheden eiwit zou ook verzadigen plaatsen, de mogelijkheid dat door de beoordeling van ongebonden eiwit overblijft na incubatie van verscheidene concentraties van eiwitten met de plaat en het vergelijken van ongebonden eiwit en Ligandbindingstesten kunnen worden onderzocht.
5. Bereid verschillende concentraties fluoresceïne-gelabeld heparine, bijvoorbeeld 10, 25, 50, 75, 100, 200 ug / mL in 0,2% CHAPS / PBS. Doe dit en alle overige werkzaamheden in het donker.
   Opmerking: alvorens met concentraties, specifieke concentraties voor andere liganden worden bepaald voor de Protein doel in kwestie. Moet de laagste concentratie detecteerbaar in de plaat lezer. Daarom is het belangrijk om eerst de range die nauwkeurig in het buffersysteem toegepast kan worden gedetecteerd bepalen. Dan bepalen de range die nodig zijn om meetbare binding te verkrijgen. Concentraties van fluoresceïne-heparine beneden 10 ug / ml niet op consistente inschrijven in de plaatlezer onder buffer omstandigheden gebruikt. Zo kwam rhodamine-heparine als gebruikt in de andere testen, kunnen worden gevisualiseerd in de plaatlezer, in de bufferomstandigheden en de voor bindingsconcentraties de fluorescentie metingen van normen niet reproduceerbaar afwijkt van dat fluorofoor.
6. Voeg 100 ul van fluoresceïne-heparine geschikte test putjes in de met avidine beklede platen en concentratienorm putten in zowel de met avidine gecoate en de niet-beklede plaat. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder schudden. Houd platen in het donker (of folie bedekt).
7. Met behulp van een plaat reader Noteer de initiële fluorescentie-emissie van het heparine in de controle putjes van beide platen en de initiële fluorescentie (totaal) emissie van putjes geïmmobiliseerd GFP-TMEM184A of GFP in de avidine-beklede plaat. Pas indien nodig het instrument winst voor de detectie van fluorescerende heparine tussen de laagste en hoogste concentraties te waarborgen.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de plaat leest putten van boven en leest op de optimale locatie in de putten als dat is verstelbaar. Voor de studie in kwestie, de optimale locatie was ongeveer 75% lager dan de putten. Informatie verkrijgbaar met de plaat lezer moet suggesties die uniek zijn voor de plaat lezer in kwestie zijn voor het lezen van assays van gebonden monster in zwarte platen bieden.
8. Verwijder ongebonden fluorescerende heparine uit putjes geïmmobiliseerd GFP-TMEM184A of GFP en plaats in overeenkomstige putjes in de niet-beklede zwarte plaat. Onmiddellijk lezen van de fluorescentie-emissie.
9. Voeg 100 ul vers 0,2% CHAPS / PBS terug into putten waaruit de fluoresceïne-heparine werd verwijderd en lees fluorescentie-emissie.
10. Herhaal stap 8,8-8,9 3x.
    LET OP: Deze lezingen uit de gecoate plaat te geven fluoresceïne heparine die nog in de GFP of GFP-TMEM184A putten. Bij aanzienlijke fluorescentie in de derde niet-gebonden monster een extra wasbeurt optreden. Als fluorescentie in elke wasbeurt worden verwijderd blijft, binding van ligand misschien lage affiniteit zijn, en de voorwaarden moeten opnieuw worden geëvalueerd. De laatste lezing vormt de gebonden heparine lezen.
11. Record fluorescentie-emissie van het verwijderde, ongebonden, monsters in de noncoated plaat, het verkrijgen van nummers voor elke wasbeurt. Dit zijn de "ongebonden" metingen.
12. Gebruik totale heparine emissiewaarden verkregen 8,7 om de juiste niveaus van heparine toegevoegd aan elk putje bevestigen. Trek de gemiddelde achtergrond lezingen uit de waarden.
    OPMERKING: Wells zonder fluoresceïne-heparine dienen als achtergrond door antilichaam GFP en buffer. average de achtergrond wordt herhaald om de achtergrond waarde te verkrijgen. Aftrekken gemiddelde achtergrondconcentratie lezingen uit de gebonden en ongebonden lezingen de werkelijke waarden te krijgen.
13. Gebruik een perceel van emissie versus totale fluoresceïne-heparine toegevoegd aan de omvang van de emissie versus hoeveelheid heparine te bepalen.
    OPMERKING: alleen antilichaam, of antilichaam en antigeen resulteerde in een aantal quenching van fluorescentie. Derhalve werd totaal heparine bepaald op basis van de totale toegevoegde heparine zoals in 8.7.
14. Plot de gecorrigeerde gebonden heparine versus de toegevoegde heparine voor de drie exemplaren in zowel de GFP-TMEM184A zaak en de GFP geval.
15. Bepaal vrij ligand door toevoegen van de niet-gebonden waarden van alle wasbeurten voor een bepaalde concentratie.

Resultaten

Terwijl in theorie transfectie van elke DNA-construct in cellen kunnen worden bereikt met lipofiele transfectie reagentia eerdere rapporten blijkt effectiever transfectie van GFP-constructen in endotheelcellen middels elektroporatie ^12. Het protocol die hier gewoonlijk bereikt GFP-construct expressie in meer dan 80% van de primaire-afgeleide endotheelcellen en gladde spiercellen gebruikt. Het ontwerp van het construct in dienst gebruik gemaakt van een commercieel ...

Discussie

De protocollen hier vermeld zijn ontworpen om bevestiging op voor de identificatie van TMEM184A als heparine receptor in vasculaire cellen ¹ leveren. Knockdown technieken worden routinematig gebruikt als een mechanisme voor de identificatie van nieuwe eiwitten te bevestigen. Sommige functionele verlies na knockdown is gewoonlijk niet voldoende bewijs dat een kandidaat eiwit is eigenlijk de juiste receptor (of ander functioneel eiwit). Het is ook belangrijk om bewijs dat de gegadigde eiwit feiteli...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
GFP-TMEM184A construct	OriGene	RG213192
Rhodamine-Heparin	Creative PEGWorks	HP-204	Lichtgevoelig
Fluorescein-Heparin	Creative PEGWorks	HP-201	Lichtgevoelig
Mowiol	EMD Millipore	475904-100GM
Paraformaldehyde (PFA, methanolvrij)	Thermo Sci Pierce Biotech, verkrijgbaar via Fisher Scientific	PI28908 bij Fisher	Gebruik in een afzuigkap
Reacti-bind neutravidine platen (Avidine gecoate zwarte 96-well platen)	Thermo Sci Pierce Biotech, via Fisher Scientific	PI15510 bij Fisher	Let op de houdbaarheid
Zwarte 96-well platen	Corning Life Sciences Plastic, gekocht via Fisher Scientific	064432 bij Fisher
A7r5 vasculaire gladde spiercellijn	ATCC	CRL 1444	Kan worden omgezet in MEM-medium1
BAOEC boviene aorta endotheelcellen	Cell Applications, Inc.	B304-05	Kweek zoals aanbevolen, kan worden omgezet in MEM-medium voor doorlopende kweek1,7
BAOSMC boviene aorta gladde spiercellen	Cell Applications, Inc.	B354-05	Kweek zoals aanbevolen, kan worden omgezet in MEM-medium voor doorlopende kweek1
RAOEC ratten aorta endotheelcellen	Cell Applications, Inc.	R304-05a	Kweek zoals aanbevolen, kan worden omgezet in MEM-medium voor doorlopende kweek7
Biotinyleerde anti-GFP	Thermo Sci Pierce Biotech, via Fisher Scientific	MA5-15256-BTIN
Streptavidine-gecoate kralen	Sigma	S1638
HeBS	Beschikbaar bij Bio-Rad		Kan in het lab worden bereid. De pH is 6,8
TMEM184A antilichaam naar het N-uiteinde	Santa Cruz Biotechnology	sc292006	Enige bekende TMEM184A antilichaam naar N-terminale regio.
TMEM184A antilichaam naar het C-uiteinde	Verkregen van ProSci Inc, Poway, CA	Pro Sci 5681	ProSci gebruikt in Figuur 1
GFP antilichamen	Santa Cruz Biotechnology	sc9996	Gebruikt in Figuur 5
Secundaire antilichamen, gelabeld met TRITC of Cy3	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA	711 025 152 (ezel anti-konijn, TRITC) 715 165 150 (ezel anti-muis, Cy3)	Minimale kruisreactiviteit om niet-specifieke kleuring te minimaliseren.
CHAPS	Gekocht bij Sigma	C5849	Let op dat dit specifieke catalogusnummer is stopgezet.  De leverancier zal informatie verstrekken over vervanging.
Live imaging 35-mm schotels	MatTek (Ashland MA)	P35G-1.0 – 20 mm - C
Confocale microscoop	Zeiss	LSM 510 Meta met een 63X olie-immersielens	Gebruikt voor afbeeldingen en live-imaging in Figuur 1, 2 en 3
Confocale microscoop	Nikon	C2+ confocal met een 60X olie-immersielens	Gebruikt voor afbeeldingen in Figuur 5
Confocale microscoop	Zeiss	Zeiss LSM 880 met een 63X olie-immersielens	Gebruikt voor afbeeldingen in Figuur 2C
Electroporatieapparatuur	Bio-Rad	Gene Pulser X-Cell System
Electroporatie cuvettes	Beschikbaar bij MidSci	EC2L	Kan ook worden verkregen bij de apparatuurleverancier
Plate reader	TECAN	TECAN Infinite® m200 Pro plate reader	Metingen in het midden van de putjes in plaats van aan het oppervlak.
Computerprogramma voor het meten van kleuringsintensiteit	Image J	https://imagej.nih.gov/ij/ Programma en informatie beschikbaar online	Elk geschikt programma kan worden gebruikt. Zie https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html voor meer informatie
Celcultuur trypsine-oplossing	Sigma	T4174	gekocht als een 10x oplossing