Het gebruik van de Soft-agar Overlay techniek voor het screenen op bacterieel geproduceerd remmende verbindingen

Samenvatting

We beschrijven een eenvoudige methode voor het screenen van bacterieculturen op de productie van verbindingen die remmend werken op andere bacteriën.

Samenvatting

De soft-agar overlay techniek werd oorspronkelijk meer dan 70 jaar geleden ontwikkeld en is op grote schaal gebruikt in verschillende gebieden van microbiologisch onderzoek, met inbegrip van het werk met bacteriofagen en bacteriocinen, eiwitachtige antibacteriële middelen. Deze werkwijze is relatief goedkoop, met minimale benodigde middelen. Deze techniek bestaat uit het spotten supernatant van een donor stam (potentieel herbergt een toxische verbinding (en)) op een gestold zachte agar overlay die is geënt met een bacteriële teststam (potentieel gevoelig voor de toxische verbinding (en)). We gebruik gemaakt van deze techniek voor het screenen van een bibliotheek van Pseudomonas syringae stammen voor intraspecifieke doden. Door het combineren van deze benadering met een precipitatiestap en doelgen deleties kunnen meerdere toxische stoffen door dezelfde stam te onderscheiden. De twee antagonistische agenten meestal hersteld met behulp van deze techniek zijn bacteriofagen en bacteriocinen. Deze twee middelen kunnen worden onderscheiden met behulp vantwee eenvoudige aanvullende tests. Het uitvoeren van een seriële verdunning op een supernatant die bacteriofaag zal resulteren in individuele plaques steeds minder in aantal met een grotere verdunning, terwijl seriële verdunning van een supernatant die bacteriocineproductie zal resulteren een clearing zone die wordt gelijkmatig troebeler met een grotere verdunning. Daarnaast zal een bacteriofaag een clearing zone produceren wanneer gespot op een nieuwe zachte agar overlay geënt met dezelfde stam, terwijl een bacteriocine een clearing zone niet zal produceren wanneer overgebracht naar een verse zachte agar gazon, vanwege de verdunning van het bacteriocine.

Inleiding

Onlangs is er aanzienlijke belangstelling voor het verdiepen ons begrip van microbiële ecologie (met name het microbiomes van verschillende omgevingen), evenals nieuwe antibacteriële stoffen voor gebruik bij de bestrijding van antibioticaresistente pathogenen ^1,2. Een tussendeur thema tussen deze belangen is het begrijpen van antagonistische interacties tussen bacteriestammen in hun natuurlijke omgeving. Er zijn tal van manieren waarop bacteriën tegenwerken concurrenten ^3. Bacteriocinen, een diverse groep van eiwitachtige, antibacteriële stoffen, zijn lang bestudeerd voor hun rol bij het mediëren interbacterial antagonisme, met twee van de meest bestudeerde soort zijn Pseudomonas aeruginosa en Escherichia coli ^{4,5 6} belangrijke humane pathogenen. Naast bacteriocins, kunnen geïnduceerde prophages ook fungeren als anticompetitor agenten, waardoor een stam binnen te vallen in een niche die al wordt gekoloniseerd ^7. Pseudomonas syringae is een plant pathogeen bekend dankzij haar antibacteriële middelen, waaronder enkel eiwit bacteriocins ^8, bacteriofaag-tail afgeleide bacteriocinen ⁹ (aangeduid tailocins), alsmede niet-eiwitachtige secundaire metabolieten ¹⁰ produceren. Onlangs is er interesse is in het begrijpen hoe deze antimicrobiële middelen invloed op de ecologie van dit organisme, maar ook hoe ze kunnen worden ingezet om plantenziekte ¹¹ beheersen.

Een veel gebruikte werkwijze voor het bestuderen van zowel bacteriocinen en bacteriofaag het soft-agar overlay techniek. Deze methode werd voor het eerst beschreven door Gratia in 1936 op staatssteun in het opsommen van bacteriofaag ^12,13.

Hierbij wordt de toepassing van de soft-agar overlay werkwijze beschrijven we, in combinatie met gerichte genetische manipulatie en polyethyleenglycol (PEG) precipitatie, onderscheiden drie verschillende antimicrobiële middelen (een bacteriofaag, een hoogmoleculaire bact moleculaireriocin en een gering gewicht bacteriocine molecuulgewicht) bij eenmalige bacteriestam. Het voordeel van deze aanpak is dat het relatief eenvoudig en goedkoop, en daarom, ondanks dat beslist 'low-tech', nu nog steeds veel toegepast.

Protocol

1. Voorbereiding van de Supernatant te worden getest Activity

1. Bereid een 0,5 mg / ml voorraadoplossing van mitomycine C door oplossen van de geschikte hoeveelheid in steriele 0,1 M _MgSO4 buffer (bijvoorbeeld 1 mg mitomycine C / 2 ml buffer). Store voorraad bij 4 ° C in een lichte beschermde container (mitomycine C is lichtgevoelig).
2. Inoculeer een enkele kolonie van P. syringae in 3 ml medium B King's (KB) bouillon ^14. Incubeer overnacht onder schudden (200 opm) bij kamertemperatuur (21-25 ° C).
3. De volgende ochtend, verdunnen de bouillon cultuur 1/100 in 3 ml vers KB bouillon. Incubeer gedurende 3-4 uur onder schudden bij kamertemperatuur. Voeg mitomycine C (0,5 ug / ml, eindconcentratie). Incubeer de kweek gedurende de nacht onder schudden bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: mitomycine C veroorzaakt dubbelstrengs DNA breuken, waardoor de cel SOS-reactie stimuleren, wat leidt tot de productie van zowel bacteriofaag en bacteriocinen.
4. Pellet 1-2 ml mitomycine C geïnduceerde kweken door centrifugeren bij 20.000 xg gedurende 5 minuten in een tafelmodel microcentrifuge.
5. Verwijderen en steriliseren kweeksupernatanten hetzij door het passeren van het supernatant door een 0,22 um poriegrootte filter of door behandeling van het supernatant met chloroform (100 ui chloroform per 1 ml supernatant).
   1. Bij gebruik van chloroform, vortex het mengsel gedurende 15 seconden en laat incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Na incubatie gecentrifugeerd mengsel bij 20.000 xg gedurende 5 minuten.
      OPMERKING: Chloroform efficiënt doodt cellen door solubiliseren hun membranen. Het voordeel van chloroform scheidingsfilter sterilisatie is dat het goedkoper en gemakkelijker opschalen als verwerking vele (> 20) monsters tegelijk. Er kan een mogelijkheid dat een bepaalde dodende activiteit verloren na chloroform behandeld ten gevolge van verdeling in de organische fase.
   2. Verwijder de bovenste, waterige fase met een 1 ml pipet een nieuwe, steriele 1,5 of 2,0 mlmicrofugebuis. Zorg ervoor dat u een van de lagere chloroformlaag over te dragen (het is beter om minder van de waterfase te verwijderen om overdracht te voorkomen).
   3. Incubeer de overgedragen bovenstaande afgetopte in een zuurkast om de resterende chloroform te verdampen (enkele uren). WINKEL supernatanten bij 4 ° C.

2. Scheiding en concentratie van hoog molecuulgewicht bactericide verbindingen met polyethyleenglycol (PEG) Neerslag

1. Om de steriele supernatant, voeg NaCl en PEG 8000-1 M en 10% eindconcentraties respectievelijk. Herhaaldelijk keren de steekproef totdat zowel het NaCl en PEG volledig is opgelost. Incubeer monsters in een ijsbad gedurende 1 uur of overnacht bij 4 ° C.
2. Centrifugeer monsters bij 16.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Een pellet moet onder in de centrifugebuis vormen. Decanteer het supernatant en resuspendeer de pellet in gewenste volume (zoals 1/10 of 1/100 van het oorspronkelijke volume supernatantume) buffer (10 mM Tris, 10 mM _MgSO4, pH 7,0) door herhaaldelijk pipetteren.
3. Resten PEG door twee achtereenvolgende extracties met een gelijk volume chloroform.
   1. Combineer chloroform met de geresuspendeerde pellet en vortex gedurende 10 tot 15 sec, centrifugeer het mengsel bij 20.000 xg gedurende 5 minuten. Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe microfugebuis. Herhaal deze extractie totdat geen wit interface tussen de waterige en organische fase zichtbaar (gewoonlijk 2 extracties in totaal). Laat resterende chloroform te verdampen uit gehaald supernatanten in een zuurkast.

3. Voorbereiding van Overlay en testen Supernatanten voor Activity

1. Inoculeer een enkele kolonie van P. syringae stam te testen op gevoeligheid in 3 ml KB, incubeer overnacht onder schudden bij kamertemperatuur.
2. De volgende ochtend, terug te verdunnen van de cultuur 1/100 in de frisse KB. Incubeer 3-4 uur onder schudden bij kamertemperatuur temperatuopnieuw.
3. Bereid gesteriliseerd water agar door autoclaaf een suspensie 0,35-0,7% (w / v) agar in ultrapuur water.
   LET OP: Een voorraad van zacht water agar kan worden gesmolten in een magnetron en herhaaldelijk hergebruikt, is vers overlay niet moeten worden voorbereid voor elk experiment. Als er water agar wordt hergebruikt, is het essentieel om ervoor te zorgen dat volledig gesmolten is na de magnetron. Zo niet, dan zal de overlay een korrelige structuur op stollende dat de interpretatie moeilijk zal maken te hebben. Als dit gebeurt, smelt de agar gedurende enkele minuten langer in de magnetron dan voorheen gedaan.
4. Handhaaf de gesmolten zachte agar in een 60 ° C waterbad voor gebruik. Met behulp van een steriele serologische pipet, overdracht 3 ml zachte agar in een steriele cultuur buis. Zet de cultuur buis waterbad te handhaven in een gesmolten toestand.
5. Om de overlay giet, eerst laat de gesmolten agar afkoelen (het moet warm maar niet heet om aan te raken voelen), maar niet laten stollen.
6. In een steriele kap, enten 100 pide tester stam cultuur in de zachte agar en vortex te mengen. Draai cultuur met de hand gedurende 10-15 sec, en giet op een bodem agar (KB agar). Tilt de plaat in alle richtingen te zorgen voor de zachte agar gelijkmatig bedekt de bodem agar.
   NB: De onderste agar kan elk gestold (1,5% agar) medium waarop de test stam groeit krachtig zijn. Voor een standaard 100 mm petrischaal Gebruik ~ 20 ml gesmolten medium. De bodem agar kan van tevoren worden bereid enkele weken (als bij 4 ° C gehouden zonder drogen) of kan op dezelfde dag worden voorbereid. Indien bereid op dezelfde dag als het uitvoeren van de overlay, het beste tot vóór stap 3,4 te doen.
7. Bedek de plaat en laat deze 20-30 minuten stollen. Wees voorzichtig niet om de plaat te storen tijdens het stollen.
8. Eenmaal verhard, spot 2-5 ul van supernatant (gegenereerd in de punten 1 en 2, boven) op de overlay. Laat de platen incubeer overnacht bij kamertemperatuur geroerd. Observeren en recordresultaten de volgende ochtend.
   Noteer hetkan nuttig zijn uitgevoerd en ter plaatse van een seriële verdunning van de supernatant worden. Hierdoor kunnen de onderzoekers een onderscheid te maken tussen de bacteriofaag en bacteriocineproducerende clearing activiteiten. In dit geval is het raadzaam om 1 uit te voeren: 5 of 1:10 verdunningen.

Resultaten

De combinatie van de zachte agar overlay en PEG-precipitatie kunnen worden gebruikt om verschillende antimicrobiële middelen door dezelfde stam te identificeren en te karakteriseren. Figuur 1 toont twee stammen van P. syringae (A en B) die worden geremd door een derde stam van dezelfde soort. De twee stammen zijn echter geremd door verschillende bacteriocinen. De clearing zone op stam A vertoont een scherpe rand, terwijl de clearing zone op stam B groter is, en vertoont een niet-scherpe grens. Genetische manipulatie in de producerende stam die specifiek hetzij de tailocin (tailocin deficiënt) of laag molecuulgewicht inactiveren bacteriocine (bacteriocineproductie deficiënt) bevestigen dat de types A en B zijn gevoelig voor verschillende bacteriocins. Figuur 2 toont dat bacteriofaag-gemedieerde doding te onderscheiden is van andere niet-replicatieve antimicrobiële middelen door het vergelijken van een verdunningsreeks. Omdat zowel bacteriocinen enprofaag kan worden geïnduceerd door mitomycine C behandeling, kunnen de activiteiten van deze twee middelen sterk op elkaar lijken (vooral als de geactiveerde faag overvloedig). Bij bacteriofaag-gemedieerde clearing zal verdunning van de supernatant oplossing in afzonderlijke plaques (heldere zones) terwijl bacteriocineproducer gemedieerde clearing niet oplost in dergelijke plaques.

Figuur 1: Fenotypische onderscheiding van meerdere antimicrobiële agentia door dezelfde stam. Stam A is gevoelig voor een hoog gewicht bacteriocineproductie moleculair (tailocin), maar geen alternatief met een laag molecuulgewicht bacteriocineproductie, zoals blijkt uit het ontbreken van het opruimen in de tailocin deficiënte stam, maar niet de bacteriocineproducerende deficiënte stam. Omgekeerd, stam B ongevoelig voor de tailocin, maar is gevoelig voor het lage gewicht bacteriocine molecuulgewicht. De tailocin is efficiently herstelde na PEG-neerslag, terwijl lagere molecuulgewicht bacteriocines niet. WT = wild type. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Het onderscheid tussen niet-replicatieve antimicrobiële stoffen en bacteriofagen. (A) verdunning van een hoge titer van bacteriofagen resultaten in individuele plaques die minder talrijk geworden (hoge titer top, lage titer onderaan). (B) Verdunning van bacteriocinen resultaten in uniform minder clearing dat niet is opgelost in afzonderlijke plaques. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De soft-agar overlay techniek die hier beschreven is op grote schaal toegepast voor vele decennia door onderzoekers geïnteresseerd in bacteriofagen of bacteriocinen. De belangrijkste voordelen van deze aanpak zijn dat het eenvoudig, goedkoop en relatief gemakkelijk te interpreteren. Door de zachte agar overlay met PEG-precipitatie en seriële verdunning kunnen antimicrobiële middelen worden gescheiden in hoge versus lage gewicht moleculair middelen en replicatieve versus niet-replicatieve agentia (bijvoorbeeld bacteriofaag vs. tailocin respectievelijk). Tenslotte incorporatie van gerichte genetische manipulatie (deletie en complementatie) van vermeende bacteriocineproductie of profaag loci kan stevig de overeenkomst van een bepaalde antagonistische verbinding stellen. We hebben onlangs gebruik gemaakt van deze methode om te beschrijven een nieuwe bacteriofaag afgeleid bacteriocineproductie voorkomt onder Pseudomonas syringae stammen ^9.

De groei van de media en de voorwaarden vermeld in dit protocol werken goed voor Pseudomonas syringae en waarschijnlijk voldoende voor andere Gram-negatieve bacteriën die krachtig groeien onder deze omstandigheden. Echter, de onderzoekers gebruik van deze methode wil je de timing, kweekmedium, inductie-methode, en de incubatie temperatuur voor hun systeem te optimaliseren. De kritische parameters omvatten het induceren van de productie van cultuur terwijl in de logaritmische groeifase en zaaien de soft-agar overlay voldoende logaritmische fase kweek een bacteriële gelijkmatige verdeling ontstaat, maar niet overdreven cultuur, die potentiële clearing zones verduisteren. Er zijn vele bacteriocinen die niet als onderdeel van de SOS respons geïnduceerd, maar worden geïnduceerd door middel van op peptide gebaseerde quorum sensing systemen (vooral Gram-positieve bacteriocines ^15), dus een onderzoeker zou willen verschillende inductie methoden screenen (zoals modificeren voedingswaarde van inducerend medium, of waardoor langere incubatie van de producerende stam).

Tijdens gebruikdeze techniek, moet de zachte agar overlay grondig gesmolten en gehandhaafd op 55-60 ° C vóór de toevoeging van de stam zaaien. We hebben verschillende experimenten waarbij de soft-agar werd niet grondig smolt (hoewel visueel bleek te zijn) en resulteerde in een overlay met een korrelige uitstraling gehad. Resultaten van een korrelig overlay kan nog interpreteerbaar algemeen, maar dit is afhankelijk van de sterkte van de remming (zwakkere remming zal moeilijker waar te nemen zijn). Een laatste verstorende variabele te overwegen bij het gebruik van deze techniek is dat de temperatuur van het gesmolten agar tijd afkoelen vóór inoculatie met het zaaien stam, om te voorkomen dat het doden van de seeding stam wordt toegestaan. Om dit probleem te voorkomen, we zorgen voor de soft-agar is warm, maar niet heet, aan te raken. Langs deze lijnen, hebben we ook opgemerkt dat, indien we geven onvoldoende tijd voor een seeding cultuur te acclimatiseren aan de gesmolten agar, voorafgaand aan het gieten van de overlay, we herstellen het algemeen slecht bacteriële gGROEI, waardoor de interpretatie van specifieke remming moeilijk of onmogelijk te interpreteren. Dit is waarom we toestaan ​​10-15 extra seconden incubatie tussen vortexen en het gieten van de overlay. De wisselwerking tussen het handhaven van de agar in een volledig gesmolten toestand (warmer is beter) maar niet dodelijk voor het zaaien stam (warmer is beter) één die waarschijnlijk zullen door een onderzoeker te bepalen door middel van trial and error.

Als een PEG precipitatie stap wordt gebruikt, zou het nuttig zijn om een ​​negatieve controle waarbij een steriel kweekmedium identiek is verwerkt om de kweeksupernatant worden omvatten. Dit garandeert dat dodende activiteit niet het gevolg van overblijvende PEG of chloroform in het monster supernatant.

Aangezien zowel bacteriofagen en bacteriocinen vaak zeer specifiek te zijn, is het niet ongewoon om geen duidelijke dodende activiteit problemen met een bepaalde combinatie van stammen. Dit kan resulteren uit verschillende stamspecifieke resistance mechanismen, een wezen dat de tester stam ofwel ontbreekt of heeft een onbekende versie van de receptor die nodig is voor het richten van een bepaalde bacteriocine of bacteriofaag.

Een alternatieve methode is bacteriocine screeningswerkwijze is beschreven door Kawai et al. , Maar lijdt aan nadelen en is niet op grote schaal aangenomen ^16. In het bijzonder, deze techniek vereist het observeren bouillon monsters op tijdstippen dat belastend kan zijn, en staat niet toe dat de discriminatie tussen bacteriofaag-afgeleide en bacteriocineproducer afgeleide doden activiteiten.

De belangrijkste beperkingen van deze techniek is dat deze niet goed geschikt is voor organismen die niet robuust doen toenemen (en dus zal gemakkelijk herkenbaar zones van klaring ontbreekt) of die de haven of prophages bacteriocinen die niet robuust worden geproduceerd onder laboratoriumomstandigheden. Aanpassing van deze techniek om bacteriocins geproduceerd in het milieu monsters zouden zowel uitbreiding van het hulpprogramma op te sporenvan deze techniek en de bevordering van het wederzijds inzicht in de rol van bacteriocines binnen de natuurlijke omgeving.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Mitomycin C	Santa Cruz Biotechnology	sc-3514	Carcinogeen. Gebruik passende PPE (d.w.z. handschoenen, oogbescherming en een mondkapje), vooral bij het bereiden van de stockoplossing.
Chloroform	Sigma-Aldrich	34854	Acute giftig, ademhalingsgevaar. Gebruik passende PPE (handschoenen en oogbescherming), behandel open containers in een chemisch afzuigkap.
Polyethyleen Glycol (PEG)	Amresco	0159
Bacteriologisch geclassificeerde agar	Genesee Scientific	20-274