In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Summary

MicroScale Thermoforese (MST) is een gevoelige technologie voor het karakteriseren van aptameer-doelinteracties. Dit manuscript beschrijft een MST-protocol voor het karakteriseren van aptameer-kleine molecuulinteracties.

Abstract

Karakterisering van moleculaire interacties in termen van fundamentele bindingsparameters zoals bindingsaffiniteit, stoichiometrie en thermodynamica is een essentiële stap in de fundamentele en toegepaste wetenschap. MicroScale Thermophoresis (MST) is een gevoelige biofysische methode om deze belangrijke informatie te verkrijgen. Deze technologie, die zich baseert op een fysisch effect genaamd thermoforese, dat de beweging van moleculen door temperatuurgradiënten beschrijft, maakt een snelle en nauwkeurige bepaling van bindingsparameters in oplossing mogelijk en biedt de vrije keuze van buffercondities (van buffer tot lysaten/sera). MST maakt gebruik van het feit dat een vrije molecuul een ander thermoforetisch bewegingspatroon vertoont dan een molecuul dat in complex is met een bindingspartner. De thermoforetische beweging verandert op het moment van moleculaire interactie als gevolg van veranderingen in grootte, lading en hydratatieomhulsel. Door de bewegingsprofielen van verschillende moleculaire verhoudingen van de twee bindingspartners te vergelijken, kan kwantitatieve informatie zoals bindingsaffiniteit (pM tot mM) worden bepaald. Zelfs uitdagende interacties tussen moleculen van kleine afmetingen, zoals aptameren en kleine verbindingen, kunnen worden bestudeerd met behulp van MST. Aan de hand van de goed bestudeerde modelinteractie tussen de DH25.42 DNA aptamer en ATP, biedt dit manuscript een protocol om aptamer-kleine molecuulinteracties te karakteriseren. Deze studie toont aan dat MST zeer gevoelig is en het mogelijk maakt om de bindingsplaats van de 7,9 kDa DNA aptamer op de adenine van ATP in kaart te brengen.

Introduction

Interactie tussen moleculen is de basis van de natuur. Vandaar dat wetenschappers op vele terreinen van fundamenteel en toegepast onderzoek proberen om de fundamentele principes van de moleculaire interacties van verschillende soorten te begrijpen. Microschaal Thermophoresis (MST) kunnen wetenschappers de snelle, nauwkeurige, kostenefficiënte en op kwaliteit gecontroleerde karakterisering van moleculaire interacties uit te voeren in een oplossing, met een vrije keuze van buffers. Er zijn al meer dan 1.000 publicaties met behulp van MST, van 2016 alleen al, de beschrijving van verschillende soorten analyses, met inbegrip van de bibliotheek screenings, bindende event validaties, de concurrentie assays, en experimenten met meerdere bindende partners ^1-8. Over het algemeen MST maakt de studie van de klassieke bindingsparameters, zoals bindingsaffiniteit (pM tot mM), stoichiometrie en thermodynamica, van elke soort moleculaire interactie. Een groot voordeel van MST is het vermogen binding gebeurtenissen onafhankelijk van de grootte van de interactiepartners bestuderen. zelfs challenging interacties tussen kleine nucleïnezuur aptameren (15-30 nt) en targets zoals kleine moleculen, geneesmiddelen, antibiotica, of metabolieten kunnen worden gekwantificeerd.

De huidige state-of-the-art technologieën te karakteriseren aptameer-target interacties ofwel lab-intense en zeer complexe of niet te kwantificeren aptameer-klein molecuul interacties ^9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) gebaseerde assays ^11,12 en echt label-free calorimetrische benaderingen, zoals Isotherme Titratie Calorimetrie (ITC) ^13-15, isocratische elutie ^16, evenwicht filtratie ^17,18, in-line sonderen ^19, gel- shift assays, stoppunt fl ow fluorescentie-spectroscopie ^20,21, fluorescentie anisotropie (FA) ^22,23, single-molecule fluorescentie beeldvorming ^24,25, en Bio-layer interferometrie (BLI) ²⁶ zijn ook ofwel onnauwkeurig of niet verenigbaar met aptameer-klein molecuul interacties. andere principal vraagstukken van deze methoden zijn lage gevoeligheid, hoge monster verbruik, immobilisatie, massatransport beperkingen op oppervlakken, en / of buffer beperkingen. Slechts een paar van deze technologie te bieden geïntegreerde schakelaars voor aggregatie en adsorptie effecten.

MST is een krachtig hulpmiddel voor wetenschappers om deze beperking op de interactie tussen aptameren en kleine moleculen ^27-29, alsmede andere doelen zoals eiwitten ^30-33 bestuderen overwonnen. De technologie is gebaseerd op de beweging van moleculen door temperatuurgradiënten. Deze gerichte beweging, genaamd "thermophoresis," afhankelijk van de grootte, lading en hydratatie shell van het molecuul ^34,35. De binding van een ligand aan het molecuul direct ten minste één van deze parameters verandert, wat resulteert in een veranderde mobiliteit thermophoretic. Liganden met kleine maten kan geen aanzienlijke gevolgen in termen van grootte veranderen van de niet-gebonden aan de gebonden toestand, maar ze kunnen dr hebben amatic effecten op de hydratatie shell en / of kosten. De veranderingen in de thermophoretic beweging van moleculen na interactie met de bindende partner maakt de kwantificering van fundamentele bindingsparameters ^{2,7,34,36,37.}

Zoals weergegeven in figuur 1A, de MST inrichting bestaat uit een infrarood laser gefocust op het monster in de glazen capillairen met dezelfde optiek als voor fluorescentiedetectie. De thermophoretic beweging van eiwitten via de intrinsieke fluorescentie van tryptofaan ⁶ of een fluorescent gelabelde interactiepartner ^3,8 kan worden bewaakt terwijl de laser wordt een temperatuurgradiënt (AT van 2-6 ° C). Het resulterende temperatuurverschil in de ruimte, AT, leidt tot de uitputting of accumulatie van moleculen in het gebied van verhoogde temperatuur, die kan worden gekwantificeerd door de Soret coëfficiënt (S _T):

g "/>

c _hete geeft de concentratie in het verwarmde gebied, en c _koud de concentratie in de oorspronkelijke koud gebied.

Zoals getoond in figuur 1B, een typische MST experiment resulteert in een MST bewegingsprofiel (tijddiagram), bestaande uit verschillende fasen, die gescheiden kunnen worden door hun respectieve tijdschema. De initiële fluorescentie gemeten in de eerste 5 s bij afwezigheid van de temperatuurgradiënt de precieze start fluorescentie definiëren en controleren fotobleken of photoenhancement. De temperatuursprong (T-Jump) vertegenwoordigt de fase waarin de fluorescentieveranderingen voor thermophoretic beweging. Deze initiële afname in fluorescentie afhankelijk warmte-afhankelijke veranderingen van fl uorophore kwantumopbrengst. De thermophoresis fase volgt, waarbij de fluorescentie afneemt (of verhogingen) door de thermophoretic beweging van de molecules tot de steady-state verdeling wordt bereikt.Het omgekeerde TJump en gelijktijdige terugdiffusie van fluorescerende moleculen zoals aangegeven in figuur 1B nadat de laser is uitgeschakeld worden waargenomen. Om bij fundamentele bindingsparameters worden verschillende molaire verhoudingen van de interactiepartners geanalyseerd en vergeleken. Gewoonlijk worden 16 verschillende ratio's bestudeerd in een MST experiment, terwijl de optische zichtbaar molecuul constant wordt gehouden en wordt geleverd met een toenemende hoeveelheid van de niet-gelabelde ligand. De interactie tussen de twee bindingspartners induceert veranderingen in de thermophoresis, en dus de genormaliseerde fluorescentie, F _norm, die wordt berekend als volgt:

F _warme en _koude F vertegenwoordigen gemiddelde fluorescentie-intensiteiten in de gedefinieerde tijdstippen van het MST sporen. Bindende affiniteiten _(Kd of EC ₅₀ waarden) kan worden berekend door curve fitting (figuur 1C).

Over het geheel genomen MST is een krachtig hulpmiddel om de moleculaire interacties van welke aard dan ook te bestuderen. Dit manuscript biedt een protocol bij de uitdagende interactie te karakteriseren tussen de kleine molecule adenosine trifosfaat (ATP; 0,5 kDa) en de 25-nt korte ssDNA aptameer DH25.42 (7,9 kDa). In de loop van het manuscript wordt de bindingsplaats van de aptameer aan het ATP molecuul in kaart gebracht naar de adenine groep van ATP.

Protocol

1. Voorbereiding van de aptameer werken Stock

1. De instructies van de fabrikant en los het oligonucleotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sequentie uit referentie ¹⁸⁾ in water, tot een 100-uM eindconcentratie.
2. Bereid de aptameer werkende oplossing door verdunning van de oligonucleotide voorraad tot 200 nm met bindingsbuffer (20 mM Tris, pH 7,6, 300 mM NaCl, 5 mM _MgCl2, 0,01% Tween 20).
3. Incubeer het mengsel gedurende 2 minuten bij 90 ° C, laat het monster onmiddellijk afgekoeld op ijs, en gebruik het monster bij kamertemperatuur.

2. Bereiding van het ligand verdunningsreeks

1. Voor elk ligand (adenosine trifosfaat (ATP), adenosine difosfaat (ADP), adenosine monofosfaat (AMP), adenine, guanosine trifosfaat (GTP), cytosine trifosfaat (CTP) deoxyadenosinetrifosfaat (dATP) en S-adenosyl methionine (SAM) ; 10 mM voorraad elk) bereiden een 16-stap seriële dilutiop in 200 ul micro reageerbuizen.
   OPMERKING: Centrifugeren ligand bestanden 5 min bij 14.000 xg kunnen helpen om aggregaten te verwijderen. Klein volume worden lage bindingsreactie buizen aanbevolen adsorptie van moleculen voorkomen dat de buiswanden.
2. Begin met een maximale concentratie van ten minste 50 maal hoger dan de geschatte affiniteit en vermindering van de ligand concentratie 50% per verdunningsstap.
   LET OP: De concentratie finder instrument in de besturingssoftware geïmplementeerd simuleert binding data en helpt bij het vinden van de juiste concentratie bereik voor de verdunningsreeks.
3. Vul 20 ul van de ligand voorraad (10 mM) in buis 1. Voeg 10 ui bindingsbuffer aptameer in micro reactiebuizen 2-16.
4. Breng 10 pl van de buis 1 aan de buis 2 en meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen. Transfer 10 pi de volgende buis en herhaal deze verdunning voor de resterende buizen.
5. Gooi de 10 ul overtollige uit de laatste buis. Vermijd bUffer verwatering effecten. De buffer in de buis 1 en in tubes 2-16 moet identiek zijn.

3. Voorbereiding van de Final Reaction Mix

1. Bereid de individuele bindingsreacties met een volume van 20 pl (10 ui werkoplossing aptameer + 10 ul van de respectievelijke ligand verdunning) te pipetteren fouten te minimaliseren. Een volume van slechts 4 pi is die voldoende is om fi ll het capillair.
2. Voeg 10 ul van 200 nM aptameer werkoplossing 10 pi van elke verdunning ligand en meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen.
3. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en fi ll de monsters in standaard capillairen door dompelen de capillairen in het monster. Langere incubatietijden kunnen nodig zijn voor sommige interacties; echter 5 min is voldoende voor de meeste. Tik de capillairen alleen aan de zijkanten, niet op het middendeel, waarbij het optisch meting genomen.
4. Plaats de capillairen naar ee capillaire lade en start de MST-apparaat.

4. Het starten van de MST Device

OPMERKING: Het apparaat biedt twee vooraf geïnstalleerde software pakketten, de '' control 'software voor de technische opzet van de experimentele condities en de' 'analyse "software voor het interpretatie van de geproduceerde gegevens.

1. Voor het plaatsen van de capillaire lade in de MST-apparaat, start de besturingssoftware en de algehele gewenste temperatuur door '' in staat stellen handmatige controle van de temperatuur 'in de' 'temperatuurregeling "dropdown menu te selecteren aan te passen. Breng de temperatuur op 25 ° C die manier.
   OPMERKING: De MST instrumenten kunnen temperatuurgeregelde 22-45 ° C.
2. Wacht tot de temperatuur tot het verwachte niveau te bereiken en plaats dan de capillaire lade in de MST-apparaat.
3. Stel de LED-kanaal '' red 'voor Cy5 kleurstoffen en stel de LED power te winnen a fl uorescencsignaal e van 300 tot 1000 fluorescentie-eenheden op MST via een standaard sensor. 25% LED stroom wordt gebruikt in deze studie.
   LET OP: 6.000 tot 18.000 fluorescentie-eenheden worden aanbevolen voor de MST met een zeer gevoelige sensor.

5. Capillaire Scan

1. Voer een capillair scan om verschillende aspecten van het monster kwaliteit te controleren door te kiezen voor de capillaire positie op de "controle" software en te klikken op "start cap scan" vóór het begin van het MST meting.
2. Inspecteer de capillaire scan op fluorescentie verhoging / quenching en vasthouden effects (U-vormig of afgeplat pieken) in de software.
   OPMERKING: Meer details over de opsporing en behandeling van fluorescentie en plakken effecten zijn te vinden in de discussie.

6. MST Measurement

LET OP: Voordat u de MST meten, zorg ervoor om uit te sluiten plakken effecten, enhancement / blussen effecten, ofpipetteerfouten, en ervoor te zorgen dat het capillair scan geeft aan dat de fluorescentie-signaal die voldoende is. Voor meer informatie, zie de bespreking.

1. Wijs de ligand concentraties van de verdunningsreeks de respectieve positie in de capillaire ' "controle" programmatuur Beschouw de verdunningsstap van mengen van de aptameer en ligand. (1: 1).
2. Voer de hoogste concentratie van ligand (5 mm) voor capillaire # 1, selecteert u de juiste verdunning type (hier, 1: 1), klikt u op de maximale concentratie, en het gebruik van de functie sleep om de resterende concentraties in de haarvaten # 2- automatisch toe te wijzen 16. De laagste concentratie is 152,6 nM.
3. Voer de concentratie van het fluorescerende aptameer (hier, 100 nM) in het respectieve gedeelte van besturingssoftware.
4. Gebruik de standaardinstellingen, waarbij de fluorescentie gedurende 5 sec detecteren MST opnemen 30 seconden, en de fluorescentie gedurende nog 5 seconden op nadat de inactivering van de laser t o toezicht achter diffusie van moleculen.
5. Stel het laservermogen tot 20% in het betreffende deel van de besturingssoftware.
   Opmerking: Om de beste signaal-ruisverhouding ontvangen en niet-specifieke effecten te vermijden, wordt een laservermogen van 20-40% aanbevolen. In bepaalde gevallen kan een hogere laservermogen worden verplicht om een ​​goede scheiding van ongebonden en gebonden moleculen te krijgen.
6. Sla het experiment na het selecteren van de doelmap en start de MST meting door op de '' toets 'Start MST meting.
   NB: De .ntp bestand wordt in de doelmap worden gegenereerd. Met behulp van deze opstelling, één meting duurt 10-15 min.
7. Herhaal de experimentele procedure ten minste tweemaal voor een nauwkeurige bepaling van de EC ₅₀ waarde.
   meerdere malen Om de technische reproduceerbaarheid te testen, kan dezelfde capillairen worden gescand (technische herhalingen): Let.

7. MST Data Analysis

nt "> NB: De analyse software kan de analyse van gegevens over de fl y tijdens de meting De analyse software plot de MST tijd sporen en de veranderingen in de genormaliseerde fluorescentie (F _norm) ten opzichte van de ligand ^{concentratie. 37.}

1. Start de MST analyse software (MO.Affinity Analysis) en de .ntp bestand uit de doelmap te laden. Selecteer "MST", zoals het type analyse in de data selectie menu.
   OPMERKING: Bij ligand-afhankelijke fluorescentie effecten, kunnen de aanvankelijke fluorescentie wordt gekozen voor analyse.
2. Voeg de desbetreffende technische of biologische run (s) een nieuwe analyse door middel van drag-and-drop of door op de "+" knop onder de respectieve experimentele run.
3. Druk op de knop informatie onder de desbetreffende experimentele run om informatie over de eigenschappen van het experiment, MST sporen, capillaire-scan, capillaire vorm, aanvankelijk fluorescentie, en bleken tarief te verkrijgen.
   LET OP: Deze ruwe data kan alin latere stappen van de analyse worden gecontroleerd.
4. Inspecteer de MST sporen voor aggregatie en neerslag effecten zichtbaar als hobbels en spikes.
   LET OP: Voor meer informatie over de opsporing en behandeling van aggregatie effecten, lees de discussie.
5. Inspecteer de capillaire scan en de capillaire vorm overlay voor adsorptie effecten zichtbaar als afgeplatte of U-vormige pieken. Inspecteer de capillaire scan en de eerste fluorescentie voor fluorescentie-effecten. Visueel te inspecteren het bleken tarief voor fotobleken effecten.
6. Schakel de dosis-respons-modus en verander de analyse instelling in "expert" modus door op de bijbehorende knop. Selecteer "T-Jump" als het MST evaluatie strategie.
7. Selecteer de "Heuvel" model voor de curve fi tting. De bindende parameters wordt automatisch berekend. Normaliseren van de gegevens door te kiezen voor de respectievelijke soort normalisering in de "resultaten te vergelijken" menu. Exporteer dedata hetzij als een .xls of .pdf.
   NB: De tabel onder de bindende grafiek geeft een overzicht van de berekende bindende parameters.

Results

Bij deze studie werd MST aangebracht op de bindingsplaats van de DH25.42 DNA aptameer ¹⁸ karakteriseren op ATP. In tegenstelling tot andere studies karakteriseren van de interactie van ATP of ATP lijkende kleine moleculen eiwitten willekeurig gemerkt met één of meer fluoroforen ^38-40 Deze studie omvat een gemerkte versie van het 7,9 kDa ssDNA aptameer met een Cy5 molecuul op het 5'- uiteinde . Verschillende ATP derivaten en verwante moleculen, alle verschillend ...

Discussion

Kwaliteitscontroles:

Aspecifieke plakken / adsorptie van monstermateriaal op oppervlakken en aggregatie effecten, een wezenlijke invloed op de kwaliteit van de affiniteit gegevens. Slechts enkele state-of-the-art technologieën bieden een nauwkeurige en snelle opties te controleren en deze te vermijden. MST biedt geïntegreerde kwaliteitscontroles die detecteren en helpen om deze problemen te overwinnen, waardoor de stapsgewijze optimalisatie van de technische installatie. Belangrijke informatie ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aptamer binding buffer			20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer	IDT, Leuven, België		sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Duitsland	A2383	10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 °C
ADP	Sigma Aldrich, Duitsland	A2754	10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 °C
AMP	Sigma Aldrich, Duitsland	A2252	10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 °C
Adenine	Sigma Aldrich, Duitsland	A8626	10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 °C
SAM	Sigma Aldrich, Duitsland	A7007	10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 °C
dATP	Sigma Aldrich, Duitsland	11934511001	10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 °C
CTP	Sigma Aldrich, Duitsland	C1506	10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 °C
GTP	Sigma Aldrich, Duitsland	G8877	10 mM stockoplossingen bewaard bij - 20 °C
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies, München, Duitsland	MO-G008	Blue/Red Channel MST-apparaat met standaarddetector, Monolith NT115 pico is MST-apparaat met gevoelige detector
Monolith NT.115 capillaries Standard	NanoTemper Technologies, München, Duitsland	MO-K002
Eppendorf PCR tubes	Eppendorf, Duitsland	30124537
Monolith control software. 2.1.33, voorgeïnstalleerd op het apparaat	NanoTemper Technologies, München, Duitsland
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, München, Duitsland
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software