Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een muizen orthotope Blaas Tumor Model en Tumor Detection System

14.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55078

⸱

12 januari 2017

 ,  , 
1Department of Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, National University Health System, 2Department of Urology, National University Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de generatie van muizen orthotope blaastumoren bij vrouwelijke C57BL / 6J muizen en de monitoring van tumorgroei.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de vorming van blaastumoren bij vrouwelijke C57BL / 6J muizen, waarbij de muis blaaskanker cellijn MB49, dat gemodificeerd menselijk Prostaat Specifiek Antigeen (PSA) scheiden, en de procedure voor de bevestiging van tumor implantatie. In het kort worden muizen verdoofd met behulp van injecteerbare geneesmiddelen en zijn gemaakt te leggen in de dorsale positie. Urine wordt vrijgemaakt uit de blaas en 50 pl poly-L-lysine (PLL) wordt langzaam gedruppeld met een debiet van 10 ul / 20 s onder toepassing van een 24 G IV katheter. Het wordt in de blaas gedurende 20 min door stoppering de katheter. De katheter wordt verwijderd en PLL hebben verlaten lichte druk op de blaas. Dit wordt gevolgd door instillatie van het muizen blaaskanker cellijn (1 x 10 5 cellen / 50 ul) met een snelheid van 10 pl / 20 s. De katheter wordt afgesloten om voortijdige afvoer voorkomen. Na 1 uur worden de muizen herleven een ommekeer geneesmiddel en de blaas wordt ontruimd. De langzame indruppeling snelheid is belangrijk,aangezien er minder vesico-ureterale reflux, wat kan leiden tot tumoren kunnen optreden in het bovenste urinewegen en de nieren. De cellijn moet goed worden geresuspendeerd tot samenklontering van cellen te verminderen, aangezien dit kan leiden tot ongelijke tumorgrootten na implantatie.

Deze techniek veroorzaakt tumoren met hoog rendement. De tumorgroei wordt gevolgd door PSA urinaire uitscheiding. PSA marker monitoring betrouwbaarder dan echografie of fluorescentie ter detectie van de aanwezigheid van tumoren in de blaas. Tumoren bij muizen in het algemeen te bereiken van een maximale grootte die een negatieve invloed op de gezondheid van ongeveer 3-4 weken indien onbehandeld. Door het monitoren tumorgroei, is het mogelijk om muizen die waren genezen van degenen die niet succesvol werden geïmplanteerd met tumoren onderscheiden. Met slechts eindpunt analyse, kan deze ten onrechte worden geacht te zijn genezen door therapie.

Inleiding

Het doel van deze methode is het murine orthotope blaastumoren genereren en de geïmplanteerde tumoren zo goed mogelijk te bewaken, zodat muizen zonder tumor implantatie niet worden verondersteld te zijn gehard bij eindpunt analyse. Kortom, de methode getoond wordt de behoefte aan grote aantallen muizenmaagjes experimentele analyse verlagen en een grotere nauwkeurigheid bij het bepalen van therapeutische resultaten.

De ontwikkeling van een orthotopic model voor kanker is belangrijk omdat het implanteren van tumorcellen subcutaan niet het milieu van de klinische ziekte recapituleren of schakelen de ontwikkeling van therapeutische strategieën. De architectuur van de blaas maakt de instillatie van blaaskanker behandelingen direct in de blaas met minimale systemische effecten. Aldus diermodellen dat deze omgeving recapituleren, zoals een orthotope model, zijn belangrijk om nieuwe therapieën te evalueren. De conclusies van een experimentele opstelling worden dependent op de beperkingen van het model.

Verscheidene technieken zijn ontwikkeld voor de productie van orthotope blaas tumoren in muizen. Deze steunen op beschadiging van de glycosaminoglycan laag van de blaas, waardoor tumorcellen te implanteren. De toegepaste technieken zijn elektrocauterisatie waardoor één schadepunt in de blaaswand, waardoor tumorontwikkeling op een locatie in de blaas 1,2. Echter, het succes van tumor implantatie gebruik elektrocauterisatie operator afhankelijk variërend van 10 - 90%, en bevat het gevaar dat de blaaswand wordt doorboord, waardoor tumoren ontwikkelen in de peritoneale holte. Chemische brandijzer wordt uitgevoerd met behulp van zilvernitraat, die schade toebrengt aan de blaaswand 3. Evenzo is zuur gebruikt om de blaaswand 4 beschadigen. Trypsine is ook gebruikt om de blaas en 5 beschadigen. Deze werkwijzen kunnen leiden tot de ontwikkeling van meer dan één tumor in de blaas.Verder bestaat het gevaar voor vernieling van de blaas of de chemicaliën in contact gelaten met de blaaswand te lang. De werkwijze ontwikkeld door Ninalga et al. wordt de positief geladen poly-L-lysine (PLL) 6 moleculen het bekleden van de blaaswand; Dit maakt de negatief geladen tumorcellen te houden aan het glycosaminoglycan laag van de blaas. Deze werkwijze resulteert in het algemeen in meer dan één tumor ontwikkeling in de blaas, maar tumor implantatie bij 80-100% 4,7. Technisch is bovendien zeer eenvoudig uit te voeren procedure. Opdat de tumoren die ontstaan ​​zijn vrij gelijkmatige grootte, is het belangrijk dat de tumorcellen niet worden gegroepeerd in grote pollen voor implantatie.

Om therapeutische effectiviteit te evalueren, is het het beste om dit onderzoek bij muizen met relatief dezelfde grootte tumoren. Dus een goede detectiesysteem dat tumorgrootte snel kunnen kwantificeren na implantatie is belangrijk. Verschillende strategieën been gebruikt om tumoren te evalueren. Deze omvatten magnetische resonantie imaging (MRI) 8-10, 11 fluorescentie, bioluminescentie 12,13, ultrageluid 14 en enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) 15,16. Terwijl MRI en echografie geen modificaties van de tumorcellen vereist, is er behoefte aan gevoelige apparatuur en contrastmiddelen voor MRI. De fluorescentie-, luminescence- en ELISA-gebaseerde testen vereisen aanpassing van de tumorcellen merker eiwitten die door deze werkwijzen kan worden gedetecteerd uitdrukken. Voor luminescentie, is een substraat nodig voor de detectie van de luciferaseactiviteit; Er is dus een extra stap en hogere kosten. Zowel luminescentie en fluorescentie vereisen gespecialiseerde apparatuur. Fluorescentie produceert, groen fluorescerend eiwit (GFP) cyclisatie, die wordt gekatalyseerd door moleculaire zuurstof is vereist. Zo kan GFP expressie variabele binnen een tumor massa, afhankelijk van de toegang tot zuurstof, waardoor dit een nogal onbetrouwbaar marker 17. Modificatie van het muizen blaaskanker cellijn MB49 mens prostaatspecifiek antigeen (PSA) 15,16 scheiden als een surrogaat marker andere strategie. Deze markers ook een alternatieve manier bevestigt aanwezigheid tumor bij de beëindiging van het experiment, waardoor ze een alternatief voor immunohistochemie. Deze studie toont de PLL werkwijze orthotope tumor implantatie en wordt een vergelijking van tumor detectiesystemen, namelijk ELISA, fluorescentie en echografie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke werk gehandeld op grond van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtsnoeren voor dieren gebruik en verwerking (Protocol nummer 084/12) aan de National University of Singapore.

1. Groeiende MB49-PSA in vitro en meten PSA secretie

  1. Onderhouden murine blaaskankercellen MB49-PSA 15 volledig Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mmol / L L-glutamine en 0,05 mg / ml penicilline-streptomycine in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Voeg 200 gg / ml hygromycine B de selectiedruk van PSA-uitscheidende cellen te handhaven.
  2. PSA secretie plaat 1 x 10 6 cellen in een 6-well kweekplaat bepalen en incubeer deze bij 37 ° C in aanwezigheid van 5% CO2 gedurende 48 uur.
  3. Twee dagen later, verzamel de supernatant van de PSA meting.
    1. Met behulp van een Pasteur pipet de supernatant een 15 ml centrifugebuis.
    2. Centrifugeer 5 min bij 250 x g om drijvende cellen en resten te verwijderen. Als de PSA-test uitgevoerd op een andere dag wordt uitgevoerd, bewaar het supernatant bij - 30 ° C in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Zo niet, dan gaat u naar de volgende stap onmiddellijk.
    3. Bepaal de concentratie PSA met een humaan-vrij PSA ELISA kit 7.
  4. Inventariseer de vergulde cellen.
    1. Met een Pasteur-pipet, was de cellen voorzichtig met 1 ml DMEM. Zuig en volledig verwijderen van de media.
    2. Voeg 1 ml vers medium en schraap voorzichtig met een celschraper om de cellen los te maken uit de put.
    3. Overdracht van de cellen naar een microcentrifugebuis en resuspendeer grondig een eencellige suspensie blijft.
    4. Meng gelijke volumes van de celsuspensie en 0,4% trypan blauwe oplossing. Tel de levende cellen (die niet het nemen van de kleurstof) met behulp van een hemocytometer.
  5. Bereken de PSA uitdrukking als ngPSA / ml medium / 10 6 cellen. De expressie van PSA MB49-PSA cellen voor implantatie in muizen is 80-120 ng / ml / 10 6 cellen.

2. Het bepalen van de gevoeligheid van PSA metingen door ELISA en real-time PCR-analyse

  1. Plaat MB49-PSA cellen in compleet DMEM medium in een 6-well kweekplaat met verschillende hoeveelheden ouderlijke MB49 cellen zodanig dat er maximaal 1 x 10 6 cellen per putje (dwz, 10 0, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 of 10 6 MB49-PSA cellen worden gekweekt met 10 6, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, 10 of 0 MB49 cellen respectievelijk 10 5,).
  2. Eén dag later, verzamel de supernatant PSA meting, zoals beschreven in stap 1.3. Bepaal de concentratie PSA met een humaan-vrij PSA ELISA kit 7.
  3. Pak het RNA uit de cellen.
    1. Lyse decellen direct in de plaat door toevoeging van 1 ml RNA-extractie reagens.
    2. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en overbrengen van de cellysaat een microcentrifugebuis. Voeg 0,2 ml chloroform en vortex de monsters krachtig gedurende 15 s. Incubeer ze gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Centrifugeer de monsters bij 12.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Breng voorzichtig de bovenste waterfase (0,5 ml) naar een nieuwe buis zonder interfase verstoren.
    4. Voeg 0,5 ml isopropylalcohol. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof volledig, zonder aan de onderkant van de buis verstoren het RNA neerslag.
    5. Was de pellet eenmaal met 1 ml 75% ethanol. Centrifugeer bij 7500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder alle ethanol en laat de pellet aan de lucht drogen gedurende 10 min.
    6. Los het RNA in 30 ul nuclease-vrij water. Incubeer gedurende 5 minuten bij 60 ° C om het zo vergrotenlubility.
    7. Kwantificeren het RNA door de absorptie voor ultraviolet (UV) spectroscopie bij 260 nm (A260). RNA zuiverheid te bepalen, meet de absorptie bij 280 nm (A280) en bereken de A260 / A280-verhouding die moet boven 1,6.
  4. Reverse transcriberen-cDNA van 2 ug RNA.
    1. Bereid het reactiemengsel op ijs en overgebracht naar 0,2 ml buisjes.
    2. Kort centrifuge de buizen om spin down de inhoud en om luchtbellen te verwijderen.
    3. Laad de buizen in de thermische cycler en voer reverse transcriptie onder de volgende omstandigheden: 60 min bij 37 ° C gevolgd door 5 min bij 95 ° C. Zodra de run is voltooid, houdt de cDNA monsters bij 4 ° C.
    4. Bewaar de monsters bij - 30 ° C voor langdurige opslag.
  5. Voer een real-time PCR-analyse voor PSA en cytoplasmatische beta actine. Beta actine wordt gebruikt om de monsters te normaliseren. Voer de test op 100 ng reverse getranscribeerd RNA in een 96-well plate. Assay alle monsters in drievoud. Voer 40 cycli met de volgende parameters: 2 min bij 50 ° C, 10 min bij 95 ° C, 15 s bij 95 ° C voor denaturatie, en 1 min bij 60 ° C. Stel de laagste limiet van detectie bij een cyclus drempel (CT) van 35; Aldus wordt een monster met een CT-waarde boven 35 geacht niet aantoonbaar.

3. Handhaving van de tumorigeniciteit van de MB49-PSA Cell Line

OPMERKING: Langdurige groei in vitro leidt tot een verlies van tumorigeniciteit. Om tumorgeniciteit te behouden, wordt de MB49-PSA cellijn door passage door de muis ten minste eenmaal per 2 jaar.

  1. Cellen.
    1. Harvest exponentieel groeiende cellen door ze voorzichtig te schrapen met een steriele cel schraper. Meng gelijke volumes van de celsuspensie en 0,4% trypan blauwe oplossing. Tel de levende cellen met een hemocytometer. Implanteer indien meer dan 20% van de cellen dood zijn.
    2. Bereken de hoeveelheid levende cellen nodig (1 x 107 cellen / ml) en overbrengen naar een 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en werp de supernatant. Resuspendeer de celpellet in DMEM blanco media. Herhaal het wassen driemaal om alle sporen van FBS te verwijderen voor implantatie.
    3. Houd de celsuspensie op ijs tot de muizen zijn klaar voor implantatie.
  2. Implanteer de tumorcellen subcutaan in muizen op de dorsale flank.
    1. Verdoven een 4- tot 6-weken oude C57BL6 / J muizen met een mengsel van ketamine anesthesie en medetomidine (75 mg / kg en 1 mg / kg), intraperitoneaal geïnjecteerd in 0,1 ml per 10 g lichaamsgewicht.
    2. Scheer de rechter flank van de huid bloot te leggen.
    3. Met behulp van een tang, til de huid te scheiden van de onderliggende spieren en injecteer 0,1 ml van de celsuspensie (1 x 10 6 cellen) subcutaan met een 24 G naald. Het verwijderen van de naald, knijpen de injectieplaats gedurende 5 tot 10 s, zodat de tumorcellenniet lekken uit de injectieplaats.
    4. Herleven de muis met een subcutane injectie van atipamezol (1 mg / kg) in 0,1 ml per 10 g lichaamsgewicht.
  3. Monitor tumorgroei elke twee dagen door meting van de tumordiameter met behulp calipers. Het tumorvolume wordt berekend volgens de formule v = (ab 2) / 2, waarbij "a" de langste afmeting en "b" is de loodrechte breedte, beide in mm.
  4. Wanneer het tumorvolume ten minste 50 mm 3 (ongeveer 7 dagen), euthanaseren de muis met CO 2. Uitsnijden de tumormassa met een paar steriele pincet en schaar onder aseptische omstandigheden en plaats in DMEM.
  5. In een 6-well cultuur plaat, gehakt de tumor in kleine stukjes met behulp van steriele scalpels. Gebruik een 1 ml spuit zuiger als "stamper" naar de tumor verder splitsen.
  6. Voeg 3 ml compleet DMEM en onderhouden van de cellen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  7. Zodra de cellen zich aan het plate (tussen één en twee dagen), verwijder de media, puin, en niet-hechtende cellen door voorzichtig opzuigen met een steriele Pasteur pipet. Was tweemaal met DMEM. Zorg ervoor dat de cellen niet storen.
  8. Voeg 1 ml DMEM en oogst de cellen door te schrapen met een celschraper. Selecteren en afzonderlijke kolonies uit te breiden, tel de cellen met een hemocytometer en plaat 1 cel per putje in een 96-well kweekplaat. Kweekcellen in DMEM met 200 ug / ml hygromycine B bij 37 ° C en 5% CO2.
  9. Wijzig de media en antibiotica om de 4-5 dagen. Controleer de cellen tot ze ongeveer 80-90% confluent. Re-bord van de cellen op een 24-well kweekplaat door pipetteren om cellen los te maken uit de put.
  10. Zodra de cellen in de 24-well plaat cultuur confluent, verjagen ze door schrapen met een cel schraper en plaat ze in een 6-well cultuur plaat.
  11. Scherm de verschillende klonen voor PSA secretie, zoals beschreven in stap 1. Cryo-behoud van de kloon met de hoogste PSA geheimion en gebruiken voor toekomstige muis experimenten.

4. Implantatie van de Tumor

Opmerking: Elke muis wordt geïmplanteerd met 1 x 10 5 MB49-PSA cellen in 50 ui DMEM blanco media in de blaas. Door de dode ruimte in de katheter, altijd extra volume (minimaal 100 pl extra per muis) te bereiden. Een alternatieve benadering zou zijn om een lucht spuit gebruiken zoals beschreven door Kasman et al. 5 in plaats van een spuit.

  1. Cellen.
    1. Een dag voor de implantatie, wanneer de cellen ongeveer 80% confluent, passage de MB49-PSA tumorcellen in volledige DMEM medium (aangevuld met 10% FBS, 2 mmol / L L-glutamine, 0,05 mg / ml penicilline-streptomycine, en 200 gg / ml hygromycine B) bij 37 ° C en 5% CO 2 bij een splitsingsverhouding van 1: 2.
    2. Op de dag van de procedure oogst van de cellen door ze voorzichtig schrapen met een steriele celschraper. Meng gelijke volumes van de celsuspensie eneen 0,4% trypan blauwe oplossing. Tel de levende cellen met een hemocytometer. Implanteer indien meer dan 20% van de cellen dood zijn.
    3. Bereken de hoeveelheid levende cellen vereist (2 x 10 6 cellen / ml) en overbrengen naar een 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en werp de supernatant. Resuspendeer de celpellet in DMEM blanco media. Herhaal het wassen driemaal om alle sporen van FBS te verwijderen voor implantatie.
    4. Houd de celsuspensie op ijs tot de muizen zijn klaar voor implantatie.
  2. Laat de 4 tot 6 weken oude vrouwelijke C57BL / 6J muizen gedurende een week acclimatiseren voordat de procedure. Alle dieren moeten uitgevoerd worden in een biologisch veiligheidskabinet om steriele omstandigheden te handhaven.
    1. Weeg elke muis en injecteer anesthesie (75 mg / kg ketamine en 1 mg / kg medetomidine) intraperitoneaal in 0,1 ml per 10 g lichaamsgewicht. Bodyweights moet tussen 17 en 22 g. Bevestig verdoving door het observeren geen Response na een teen knijpen.
    2. Voor de identificatie, markeren het oor met behulp van een oor punch.
    3. Injecteer Hartmann's oplossing of samengestelde natriumlactaat intraperitoneaal in 0,1 ml per 10 g lichaamsgewicht elke 1-2 uur voor hydratatie.
    4. Toepassen steriele oogzalf beide ogen met een steriele katoenen bol, aangezien de knipperreflex verloren onder verdoving en de ogen uitdrogen. Opnieuw toe te passen als dat nodig is.
    5. Leg de muizen in rugligging op keukenpapier op een warmtepak (geactiveerd door contact met lucht) tot lichaamstemperatuur te handhaven en tape de achterpoten naar beneden.
  3. Met een vinger druk zachtjes op de onderbuik en laat urine vanuit de blaas naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Dit voorbeeld dient als basiswaarde van urine PSA.
  4. Trekken steriele poly-L-lysine (PLL) in een 1 ml spuit en voeg een 24-gauge IV katheter, met de naald stilet verwijderd. Breng smeermiddel aan het uiteinde van de katheter en insert de katheter via de urethra in de blaas behulp van een tang om de catheterisatie geleiden. Stop wanneer weerstand wordt gevoeld. OPMERKING: De onderzoekers moeten hun veterinair personeel over de noodzaak van het gebruik van een glijmiddel met anestheticum voor intravesicale instillatie en het gebruik van post-procedure analgetica bespreken.
  5. Druppelen 50 ul van PLL langzaam met een snelheid van 10 ul per 20 s, om vesico-ureterale reflux 18 voorkomen. Laat de katheter in de blaas gedurende 20 min met een stop om stroming te voorkomen.
  6. Na 20 minuten, verwijder de katheter en verlaten de blaas van enige inhoud door zachtjes te drukken op de onderbuik. Met behulp van een lege 1 ml spuit, spoel de resterende inhoud van de katheter.
  7. Meng MB49-PSA cellen grondig door pipetteren en ze in een 1 ml spuit. Bevestig de katheter en smeermiddel toe te passen. Inboezemen 50 ul van 1 x 10 5 cellen in een traag tempo van 10 pi om de 20 s. Vervang de stop opde katheter. Geef controlemuizen 50 uL zoutoplossing.
  8. Na 1 uur, verwijder de katheters en verlaten de blaas van enige inhoud. Verwijder de tape op de achterpoten en plaats de muizen op de ventrale zijde. Herleven de muizen door subcutaan injecteren van de omkering geneesmiddel (1 mg / kg atipamezole) bij 0,1 ml per 10 g lichaamsgewicht.
  9. Bewaken van de muizen tot beweeglijkheid wordt waargenomen. Zet de muizen om hun kooien.
  10. Na voltooiing van een tumor detectie-protocol (hoofdstukken 5, 7 of 8), euthanaseren de muizen met behulp van CO 2. Post-mortem tumor detectie wordt beschreven in hoofdstuk 6.

5. Toezicht tumorgroei met ELISA

OPMERKING: Tumor aanwezigheid en groei in muizen gevolgd door het meten van PSA secretie in de urine. Onderzoekers moeten overleggen met hun veterinaire personeel over de controle op de diergezondheid en welzijn na de tumor implantatie en humane eindpunten.

  1. Er zijn twee methoden om urine te verzamelen van muizen.
    1. Verzamel urine nachts door een enkele muis per individuele metabolische kooi ontworpen om urine te scheiden van fecaal materiaal. Als de opstelling koeling heeft, voeg een proteaseremmer (100 ui) in de urine verzamelbuis afbraak van PSA overnacht voorkomen. Het aantal beschikbare metabolische kooien beperkt de bruikbaarheid van deze wijze van urineverzameling.
    2. Wanneer het logistiek onmogelijk metabole kooien (bijvoorbeeld in de ABSL2 kamers) gebruikt, verzamelen vlek urine door een vinger lichte druk uit te oefenen op de onderbuik terwijl de muizen verdoofd zoals beschreven in stap 4.2.1. Dit wordt gewoonlijk gedaan voordat de therapie wordt ingeprent. Vanuit onze ervaring, kan minstens 150 ul van de urine worden verzameld 1 uur na de anesthesie.
  2. Onmiddellijk plaats van de verzamelde urine op het ijs. Hematurie kan toegankelijk vanaf de tweede week na tumor implantatie. Sterk gehemolyseerde monsters kunnen ELISA analyse beïnvloeden. Daarom urinemoet op ijs geplaatst worden en snel verwerkt na de inzameling.
  3. Centrifugeer de urine buizen bij 6700 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om cellen en resten te verwijderen.
  4. Het verschil in urineproductie tussen de muizen normaliseren hoeveelheid urine in nieuwe buizen en opgeslagen bij -30 ° C totdat de analyses verricht PSA met een ELISA kit 7 en creatinine gebruik van een testkit 7. Alhoewel muizen niet PSA produceren, zijn er lage niveaus van niet-specifieke binding gedetecteerd met de ELISA. Voor monsters positief worden beschouwd, moet de drempel ingesteld op een waarde die groter is dan in normale muizen + 3 standaarddeviaties (SD) 15.

6. Opsporen Tumor Presence met Real-time PCR

  1. Bij beëindiging, ontleden de buikholte van de muis en zoek de blaas. Accijnzen de blaas en plaats deze in een cryovial. Bevriezen onmiddellijk in vloeibare stikstof.
  2. Extraheer het RNA door homogeniseren van de weefsels in een RNA extractie reagens.
  3. Voeren reverse transcriptie en real-time PCR-analyse voor PSA, zoals hierboven beschreven in paragraaf 2.

7. Monitoring tumorgroei met Fluorescence Imaging

  1. Label 1 x 10 7 MB49-PSA cellen met een infrarood fluorescerende kleurstof 19.
  2. Re-platen en oogst de gelabelde cellen op dag 4, 7, 11, 14, 18 en 21 om te controleren of cellen over levensvatbaarheid en fluorescentie door flowcytometrie 20.
  3. Implanteer het gemerkte MB49-PSA-cellen bij muizen blazen, zoals hierboven in hoofdstuk 4.
  4. Controleer de tumorgroei met fluorescentie- beeldvormingssysteem om de twee dagen.
  5. Op de dag van beeldvorming, wegen en verdoven de muizen met een mengsel van ketamine anesthesie en medetomidine (75 mg / kg en 1 mg / kg), intraperitoneaal geïnjecteerd in 0,1 ml per 10 g lichaamsgewicht.
  6. Scheer de buikstreek om de huid bloot te leggen.
  7. Plaats muizen in de beeldvorming kamer en het verwervenbeelden van het blazen met behulp van de software die bij het beeldvormingssysteem.
  8. Herleven de muizen door subcutane injectie van een geneesmiddel omkering (1 mg / kg atipamezole) bij 0,1 ml per 10 g lichaamsgewicht.

8. Monitoring tumorgroei met High-frequentie Ultrasound Imaging

  1. Implant tumoren in muizen, zoals hierboven in hoofdstuk 4.
  2. Om de twee dagen, te bewaken tumorgroei met behulp van echografie.
  3. Op de dag van beeldvorming, wegen en verdoven de muizen met een mengsel van ketamine anesthesie en medetomidine (75 mg / kg en 1 mg / kg), intraperitoneaal geïnjecteerd in 0,1 ml per 10 g lichaamsgewicht.
  4. Scheer de buikstreek om de huid bloot te leggen.
  5. Druppelen 100 pl steriele 0,9% zoutoplossing in de blaas via een 24-gauge IV katheter. Het zout zal de blaas uitzetten en het verbeteren van de zichtbaarheid tijdens de echografie.
  6. Plaats de muis op de echo-platform en geleidende gel van toepassing op de lower buik.
  7. Laat de handheld sonde op de huid en het verwerven van de B-modus beelden van de blaas op de imaging platform 21.
  8. Herleven de muizen door subcutane injecterende omkering geneesmiddel (1 mg / kg atipamezole) bij 0,1 ml per 10 g lichaamsgewicht.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

PSA secretie van MB49 cellen bleek te variëren met de groeimedia. MB49-PSA wordt gekweekt in DMEM media, omdat dit resulteert in verhoogde PSA uitscheiding (Figuur 1A). Om de gevoeligheid van de ELISA PSA en real-time PCR te bepalen, werden verschillende aantallen MB49-PSA-uitscheidende cellen gemengd met MB49 oudercellen. PSA ELISA detecteert minste 1 x 10 5-PSA uitscheidende cellen / 1 x 10 6 cellen (Figuur 1B), en real-time PCR-a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De meest kritische stappen in het protocol zijn: 1) met succes het behoud van de tumorigeniciteit van de cellijn; 2) zorgen voor meetbare PSA uitscheiding voordat tumorcel implantatie bij muizen; 3) het genereren van een eencellige suspensie voor implantatie om variatie in tumorgrootte verminderen; en 4) het indruppelen cellen met een lage snelheid om vesico-ureterale reflux te voorkomen, waardoor tumorcel implantatie in de nier.

Na langdurig passage in vitro, kan MB49 / MB49-PSA ce...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de National Medical Research Council van Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) toegekend aan Professor Kesavan Esuvaranathan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MB49-PSA cellenN/AN/Aref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 mediaHyCloneSH30027.01 
Dulbecco's Gemodificeerd Eagles Medium (DMEM) mediaBiowestL0102
Foetaal Rund Serum (FBS) Zuid-AmerikaansBiowestS1810
Foetaal Rund Serum (FBS) Zuid-Amerikaans, PremiumBiowestS181B
Foetaal Rund Serum (FBS)HyCloneSH30088.03 
L-glutamineBiowestX0550
Penicilline-StreptomycineBiowestL0022
Hygromycine BInvitrogen10687-010
vrije PSA (Menselijke) ELISA kitAbnovaKA0209
TRIzol Reagens voor RNA extractie Ambion15596026
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit met RNase InhibitorApplied Biosystems4374967
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
TaqMan Gen Expressie Assay – Muis ActbApplied Biosystems4331182Mm00607939_s1
TaqMan Gen Expressie Assay – Menselijke KLK3Applied Biosystems4331182Hs00426859_g1
C57BL/6J vrouwelijke muizenIn Vivos4 - 6 weken oud
Anesthesie (75 mg/kg Ketamine en 1 mg/kg Medetomidine)Lokale apotheek
Omgekeerde drug (1 mg/kg Atipamezole)Lokale apotheek
Oor punchElectron Microscopy Sciences72893-01
Hartmann's oplossing of Compound sodium lactateB Braun
Oogzalf - Duratears steriele oculaire smeermiddel zalfAlcon
Warmte pak - HotHands handwarmersHeatmax Inc
Introcan Certo IV katheterB Braun425130024 G x 3/4″
Aquagel Smeermiddel gelLokale apotheek
Poly-L-lysine oplossing, 0,01%,SigmaP4707
cOmplete, Mini, EDTA-vrije Protease Inhibitor CocktailRoche4693159001
Quantichrom Creatinine Assay KitBioAssay SystemsDICT-50 
Fluorescente kleurstof - VivoTrack 680Perkin ElmerNEV12000 
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition SolutionAmbion4427575
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur en Software
7500 Realtime PCR SysteemApplied Biosystems
7500 Software v2.3Applied Biosystems
Metabolische KooiTecniplast Verticale type rek voor 12 kooien
BD FACSCanto I systeem BD Biosciences
BD FACSDiva software v7BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo beeldvormingssysteem Caliper Life Sciences 
Living Image Software v3.1Caliper Life Sciences 
Vevo 2100 beeldvormingssysteem VisualSonics 

Referenties

  1. Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
  2. Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  3. Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
  4. Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
  5. Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181(2013).
  6. Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
  7. Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684(2011).
  8. Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
  9. Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
  10. Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3(2016).
  11. Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
  12. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
  13. Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
  14. Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
  15. Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
  16. Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
  17. Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
  18. Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172(2012).
  19. Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075(2007).
  20. Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
  21. Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718(2015).
  22. Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
  23. Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
  24. Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
  25. Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
  26. Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
  27. Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
  28. Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
  29. Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Orthotope tumorimplantatieMB49 PSA cellenmonitoring van PSA in urineinstillatie van poly L lysineblaaskanker bij muizenevaluatie van intravesicale therapieflowcytometrische analyseELISA detectiemonitoring van tumorgroei
Een muizen orthotope Blaas Tumor Model en Tumor Detection System
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.