Hier presenteren we een uitgebreid capillaire zone-elektroforeseprotocol voor de beoordeling van intrinsieke fysisch-chemische heterogeniteit van monoklonale antilichamen als een kwaliteitskenmerk.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Capillaire Elektroforese Scheiding van monoklonaal antilichaam isovormen gebruiken een neutrale capillair
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Biotherapeutische eiwitten, zoals monoklonale antilichamen (mAbs), zijn haalbare alternatieven voor de behandeling van chronische-degeneratieve ziekten. De biologische activiteit van deze eiwitten hangt af van hun fysisch-chemische eigenschappen. Het gebruik van hoogwaardige technieken zoals chromatografie en capillaire elektroforese is beschreven voor de analyse van fysisch-chemische heterogeniteit van mAbs. Tegenwoordig vormt de capillaire zone-elektroforese (CZE) techniek een van de meest resolutieve en gevoelige analyses voor de analyse van biomoleculen. Bovendien wordt de elektro-gedreven scheiding in CZE beheerst door uitgebreide eigenschappen van materie en biedt het het voordeel van het analyseren van eiwitten in de buurt van hun natuurlijke toestand. Echter, de succesvolle implementatie van deze techniek voor routinematige analyse hangt af van de vaardigheden van de analist in de kritische stappen tijdens de voorbereiding van monsters en systemen. Het doel van deze tutorial is om de stappen te detailleren om te slagen in de CZE-analyse van mAbs. Verder kan dit protocol worden gebruikt voor de ontwikkeling en verbetering van de vaardigheden van het personeel dat betrokken is bij laboratoria voor analytische eiwitchemie.
Inleiding
Monoklonale antilichamen (mAbs) zijn biotherapeutic eiwitten met toenemende belangstelling als gevolg van hun vermogen om op te treden tegen verschillende chronische en degeneratieve ziekten 1. Net als andere biomoleculen, mAb's zijn gevoelig voor verschillende fysicochemische modificaties ondergaan in alle stadia van hun levenscyclus (dat wil zeggen, van biosynthese het eindproduct). Dergelijke modificaties omvatten, maar zijn niet beperkt tot: deamidatie, glycosylering, oxidatie, cyclisatie, isomerisatie, aggregatie en proteolytische splitsing 2. Vandaar, analytische technieken in staat om intrinsieke isovormen op te lossen zijn n....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van de Solutions
- Bereid de BGE-oplossing.
- Bereid 100 ml van een oplossing bestaande uit 0,05% (m / v) hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), 200 mM ε-amino n-capronzuur (EACA) en 30 mM lithium acetaat.
OPMERKING: HPMC is een veerkrachtig polymeer, giet het poeder in een glazen beker, voeg 80 ml water en tenslotte de voeg roerstaaf. Ga door het toevoegen van de resterende reagentia als normaal. Draag een veiligheidsbril bij het hanteren van lithium-acetaat als het irritatie van de ogen kan veroorzaken. - Breng de pH waarde 4,8 ± 0,1 met 50% (v / v) azijnzuur. Laat de oplossing stabiliseren 5 min en ind....
- Bereid 100 ml van een oplossing bestaande uit 0,05% (m / v) hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), 200 mM ε-amino n-capronzuur (EACA) en 30 mM lithium acetaat.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 2 toont de typische elektrische stroom profiel van een 200 mM EACA, 30 mM lithium acetaat, pH 4,8 BGE met anti-TNFa mAb monster verdund met Tris buffer (50 mM, pH 8,0). Zoals kan worden waargenomen, de huidige is stabiel tijdens de analyse en kan oscilleren tussen waarden van 30 tot 35 uA. Figuur 3 toont de CZE elektroferogram van een blanco monster waarin de gedetecteerde piek overeenkomt met de histamine interne standaard. Het wordt verwacht voo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze tutorial, benadrukken we het belang van goede praktijken bij het uitvoeren van CZE analyses van mAb's om de kans te vergroten om te slagen. Echter, wanneer CZE wordt gebruikt op een routine-basis, problemen ontstaan onvermijdelijk 12.
Voor het beste resultaat, is het belangrijk om de noten die in het hele protocol werden opgenomen te volgen, omdat ze de analist om te overwinnen en het oplossen van moeilijke stappen zal helpen. Een belangrijke overweging om optimale res.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz en Emilio Medina-Rivero zijn werknemers van Probiomed S.A. de C.V., dat biosimilare producten ontwikkelt, produceert en op de markt brengt. Alle auteurs zijn betrokken bij de ontwikkeling van biosimilare producten voor Probiomed.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Wiley voor de toegestane toestemming om de concepten van de volgende publicatie te gebruiken voor deze tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analyse van recombinante monoklonale antilichamen door capillaire zone-elektroforese. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Dit werk werd ondersteund door CONACyT, Mexico, subsidie 230551.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Glacial azijnzuur | Tecsiquim | AT0035-7 | |
| ACS-kwaliteit zoutzuur | J.T. Baker | 9535-05 | |
| Histamine dihydrochloride | Fluka | 53300 | |
| (Hydroxypropyl)methylcellulose | Fluka | 09963 | |
| Lithiumacetaat | Sigma-Aldrich | 517992 | |
| 6-aminocaproïnezuur | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| eCAP Tris Buffer, 50,0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 | |
| PA 800 Plus Farmaceutisch Analysesysteem | Beckman Coulter | A66528 | |
| eCAP Neutral capillair | Beckman Coulter | 477441 | |
| Vial, Micro, 200 µl | Beckman Coulter | 144709 | |
| Universele viaalkappen | Beckman Coulter | A62250 | |
| Universele vlaaskjes | Beckman Coulter | A62251 | |
| Kabel, optiek, UV/Vis | Beckman Coulter | 144093 | |
| UV/Vis Detector Module | Beckman Coulter | 144733 | |
| Cartridge Assembly Kit, Blank | Beckman Coulter | 144738 |
Referenties
- Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases. Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).
- Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of monoclonal antibodies. J. Pharm. Sci. 97<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
