Methodologie voor de studie van horizontale genoverdracht in Staphylococcus aureus

Summary

We beschrijven hier drie verschillende protocollen voor de in vitro onderzoek conjugatie, transductie en natuurlijke transformatie in Staphylococcus aureus.

Abstract

Een belangrijk kenmerk van de belangrijkste opportunistische humaan pathogeen Staphylococcus aureus is het buitengewone vermogen om snel resistent worden tegen antibiotica. Genomische studies blijkt dat S. aureus draagt vele virulentie en resistentiegenen in mobiele genetische elementen, wat suggereert dat horizontale genoverdracht (HGT) speelt een cruciale rol in S. aureus evolutie. Echter, een volledige en gedetailleerde beschrijving van de gebruikte HGT studeren in S. aureus ontbreekt nog, in het bijzonder met betrekking tot natuurlijke transformatie, die onlangs is gemeld in deze bacterie methodologie. Het beschrijft drie protocollen die bruikbaar zijn voor de in vitro onderzoek HGT in S. aureus conjugatie, faag transductie en natuurlijke transformatie. Om dit doel, de cfr-gen (chlooramfenicol / florfenicol weerstand), die de Phenicols verleent, Lincosamiden, oxazolidinonen, pleuromutilinen en Streptogramine A (PhLOPSA) resistentie fenotype, werd gebruikt. Het begrijpen van de mechanismen waarmee S. aureus overdraagt genetisch materiaal naar andere stammen is essentieel voor het begrijpen van de snelle verwerving van weerstand en helpt bij het vormen van verspreiding gerapporteerd bewakingsprogramma's of om verspreiding modus in de toekomst voorspellen verder verduidelijken.

Introduction

Staphylococcus aureus is een commensale Gram-positieve bacterie die van nature leeft in de huid en neusholte van mensen en dieren. Deze soorten bacteriën is de belangrijkste oorzaak van nosocomiale infecties in ziekenhuizen en instellingen voor gezondheidszorg. Bovendien is zijn vermogen om resistentie tegen andere antimicrobiële verbindingen aangaan het beheer van de infecties veroorzaakt door deze bacterie in een mondiaal probleem gemaakt.

Twee belangrijke routes betrokken bij de verspreiding van resistentie fenotypen bekend: de klonale verspreiding van resistente genotypes en de verspreiding van genetische determinanten van de bacteriële pool. Bij S. aureus, verschillende antibiotische resistentiegenen (en virulentie determinanten) werden in verband gebracht met mobiele genetische elementen (MGEs) ^1. De aanwezigheid van deze elementen in het genoom van S. aureus aan dat de verwerving en overdracht van geneTIC materiaal in de bacteriële populatie kan een belangrijke rol weggelegd voor S. aureus aanpassing en evolutie spelen.

Genetisch materiaal kan worden uitgewisseld via drie bekende mechanismen van HGT in Gram-positieve bacteriën: transformatie, conjugatie en faag transductie. Transformatie omvat de opname van vrije DNA. Om vreemd DNA te verwerven, moeten bacteriële cellen om een ​​bijzondere fysiologische fase te ontwikkelen: de competentie podium. Wanneer dit stadium is bereikt, competente cellen kunnen transporteren DNA in het cytoplasma, het verwerven van nieuwe genetische determinanten. Bij S. aureus, heeft het bestaan van natuurlijke transformatie onlangs aangetoond ^2. In lijn met deze, heeft onze fractie licht werpen op de relevantie van de expressie van de zucht factor (een cryptische secundaire transcriptiefactor sigma factor) in de bevoegdheid stadium van ontwikkeling en over de wijze waarop de constitutieve expressie maakt S. aureus in staat reaching bevoegd fase, waardoor het verkrijgen van resistente fenotypen door natuurlijke transformatie ^2.

Conjugatie is een proces dat de overdracht van DNA van een levende cel (donor) naar een andere (ontvanger). Beide cellen moeten in direct contact, waardoor het DNA te wisselen terwijl beschermd door speciale structuren, zoals buizen of poriën. De overdracht van DNA door deze werkwijze vereist de conjugatie machine. S. aureus, de prototype conjugatie plasmide PGO1, waarbij de conjugatie operon TRAA ³ herbergt.

Faag transductie omvat de overdracht van DNA tussen cellen met bacteriofaag infectie en impliceert het verpakken van bacterieel DNA, in plaats van viraal DNA in de faag capside. De meeste van S. aureus isolaten gelysogeniseerd door bacteriofagen ^1. Bij stressomstandigheden kan prophages worden uitgesneden uit het bacteriële genoome en verschuiving naar de lytische cyclus.

Dit zijn de drie bekende mechanismen voor DNA overdracht in S. aureus. Er zijn een aantal extra overdrachtmechanismen, zoals "pseudo-transformatie" ² en faag-achtige systemen op de overdracht van pathogeniteit eilanden ^4. Onlangs heeft één groep rapporteerde dat "nanobuisjes" betrokken zijn bij de overdracht van cellulaire materialen (waaronder plasmide-DNA) tussen naburige cellen ^{5, 6,} maar een vervolgonderzoek dusver niet gebleken van andere groepen.

Dit werk zorgt voor de nodige methodologie om HGT studeren in S. aureus door het aanpakken van de drie belangrijkste overdracht trajecten: conjugatie, transductie en natuurlijke transformatie. De verkregen met deze methoden resultaten werden gebruikt om de overdracht van de cfr-gen (chlooramfenicol / florfenicol weerstand) onderzoek onderS. aureus stammen ^7. Deze drie technieken zijn veelzijdig gereedschap voor het onderzoeken van MGE transmissie in S. aureus.

Protocol

OPMERKING: De stammen en waaruit dit werk worden in Tabel 1 en Tabel Materials, respectievelijk. In de transmissie-experimenten, N315 en COL cfr -positieve derivaten werden gebruikt als donoren van de cfr-gen (N315-45 en COL-45). Deze stammen werden voorheen verkregen door conjugatie, waarbij als donor klinisch cfr-positieve Staphylococcus epidermidis stam (ST2), na conjugatie standaard protocol (zie hieronder). Deze stam koesterde de cfr-gen op een pSCFS7-achtige plasmide ^7.

1. vervoeging met behulp van de Filter-paring Method

Opmerking: Een S. aureus N315 stam die het gen cfr (N315-45) ^{7 (CmR)} werd gebruikt als de donor. COL ⁸ of ⁹ MU50 stammen (Tet ^{R, S} Cm) werden gebruikt als ontvangers. Dubbele-resistente kolonies (Tet ^R, Cm ^R) kunnen groeien in aanwezigheid van 32 mg / l chlooramfenicol en 8 mg / l tetracycline werden beschouwd als vermeende transconjuganten en geanalyseerd om de aanwezigheid van CFR bepalen door kolonie PCR en het bepalen ontvanger gevoeligheid profiel.

1. Voer vervoeging naar aanleiding van een eerder beschreven protocol ¹⁰ met een paar aanpassingen:
   1. Bereid 5 ml overnacht cultuur van de donor en ontvanger Tryptic Soy kweekvloeistof (TSB) medium (met en zonder 32 mg / l chlooramfenicol, respectievelijk), onder schudden bij 37 ° C.
   2. Pas de optische dichtheid (OD ₆₀₀₎ van de overnacht kweken tot 1 (OD ₆₀₀ = 1,0) met behulp van verse TSB medium. Mix 0,5 ml van de donor cultuur (N315-45) met 0,5 ml van de ontvangende cultuur (COL of MU50). Voeg 1 ml PBS aan het mengsel.
   3. Breng het mengsel van bacteriën op een 0,45 urn filtermembraan using van een vacuümpomp systeem.
   4. Zet de filter membranen op een schaap bloed agar plaat. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 dag.
      Opmerking: In deze stap verrijkt medium dient om de groei van dubbele-resistente cellen mogelijk.
   5. Haal de filter membraan van de plaat en op te schorten in 10 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Vortex goed om alle bacteriën bevestigd aan het membraan verzamelen.
   6. Maak een seriële 10-voudige verdunning van de bacteriële schorsing door het gebruik van verse TSB. Plaat 100 ul van de verdunde monsters 0-10 ^-4 on TSB agar (TSA) platen gesupplementeerd met 32 mg / l chlooramfenicol en 8 mg / L tetracycline voor selectie van transconjuganten. Plaat 100 ul van de verdunde suspensie (10 -10 ^{-5 -6)} op TSA platen met alleen 8 mg / l tetracycline aan het totale aantal ontvangers tellen. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 18-24 uur.
   7. Analyseer dubbel-resistente kolonies (veronderstelde transconjuganten) op de aanwezigheid van de cfr-gen door kolonie PCR ⁷ en hun gevoeligheid profielen (antibiogram).
   8. Bepaal het antibiogram door meting van de minimale remmende concentraties (MIC's) van geschikte antibiotica volgens de standaard methode of microverdunningsplaten schijf diffusiemethode ^11. De vatbaarheid profiel van de transconjuganten moet tot de ontvanger, met uitzondering van chlooramfenicol (en andere verbindingen die door de cfr gen). Deze vaststelling is van essentieel belang om uit te sluiten tetracycline resistentie ontwikkeld door de donor stam.

2. Fagen Transductie

OPMERKING: De bacteriofaag MR83a behorende tot de familie Siphoviridae (laboratorium stock) werd bij de transductie experimenten. N315-45 werd gebruikt als cfr donor voor faaginfectie. N315, COL, of MU50 stammen werden gebruikt als de ontvangers. De overname van CFR werd bepaald door de abiliteit van de ontvangende stam te groeien in aanwezigheid van 32 mg / L chlooramfenicol. Kolonies groeien onder deze voorwaarde werden geanalyseerd om de aanwezigheid van CFR (door kolonie PCR) te bepalen en de gevoeligheid profiel bepalen uitsluiten mogelijke besmetting.

1. Faag versterking van de donor
   1. Bereid een nachtkweek van N315-45 in 5 ml nutriënt bouillon aangevuld met 3,6 mM Ca2 ⁺ (NBCaCl ₂₎ bij 37 ° C onder schudden (180 rpm).
      OPMERKING: Calcium is nodig voor faaginfectie. Zie de tabel Materials. Nutriënt bouillon van andere bedrijven misschien kwesties, zoals calcium neerslag hebben.
   2. Bereid subculturen door verdunning van de overnachtkweek 1: 1000 in een eindvolume van 10 ml NBCaCl ₂ in 50 ml glazen kolven of glazen flesjes. Groeien de bacteriën gedurende 1 uur bij 37 ° C onder schudden (180 rpm).
   3. Bereid een reeks van verdunde faag MR83a in NBCaCl ₂ medium (10 ^-2, 10 ^-3, 10 ^{-4, -5} 10, 10 en ^-6). Voeg 20 ul van de verdunde faag in de bacteriecultuur. Tevens worden een controlecultuur zonder faaginfectie, die als positieve controle voor bacteriële celgroei en kan worden gebruikt om de faag titer bepalen de volgende dag.
   4. Groeien de kweken bij 37 ° C onder zachtjes schudden (100 rpm) gedurende de nacht.
      OPMERKING: De cellen groeien enigszins wanneer het infecterende fagen niet hoger; dan zullen zij in lysis fase in door de faag amplificatie door de lytische cyclus. De cultuur zonder faag zal volle groei zien, terwijl culturen met faag verschillende tarieven van de transparantie zal laten zien.
   5. Selecteer een of twee kweekflesjes vereffend met de hoogste verdunning van toegevoegde faag.
   6. Breng de culturen in 15 ml centrifugebuizen. Voeg 250 pl chloroform en meng door omkeren van de buizen.
   7. Centrifugeer de buizen bij 5000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
   8. Breng de supernatanten verse buizen en bewaar ze bij 4 ° C tot gebruik.
      OPMERKING: De faag gedurende ten minste een paar maanden, maar het opslaan van de faagbereiding te lang vermindert de titer en transductie efficiëntie.
2. Meten van de faag titer (faag plaque assay)
   1. Bereid nutriënt bouillon agar (1,5% agar) medium; houd het warm in een waterbad bij 55 ° C. Voeg geautoclaveerd 0,5 M CaCl _2-oplossing aan het medium tot een eindconcentratie van 3,6 mM. Giet het in 90 mm petrischalen (NBCaCl ₂ platen).
   2. Bereid een nachtkweek van N315 in 5 ml NBCaCl ₂ bij 37 ° C onder schudden; Deze kan worden vervangen door de controlecultuur hierboven beschreven (stap 2.1.3).
   3. Voeg 10 ul van de kweek van een nacht in 200 ul van NBCaCl ₂ en gelijkmatig verspreid het op de NBCaCl ₂ plaat. Stop de verspreiding wanneer het oppervlak vande plaat is bedekt met vloeistof. Laat de plaat drogen.
   4. Maak een seriële 1:10 verdunning (van 10 ^-5 -10 ^-10) van vooraf bereide faag (stap 2.1.8) met behulp van NBCaCl ₂ medium.
   5. Spot 3 pi van elke verdunning faag op de plaat bedekt met bacteriën.
   6. Incubeer de plaat overnacht bij 30 ° C.
   7. Tel de aantallen plaque en bereken de faag titer met de volgende formule: plaquevormende eenheid (pfu) / ml = aantal plaques x Verdunningsfactor / bevlekte volume (3 x 10 ^-3 ml)
3. faag transductie
   OPMERKING: De faag pool bereid in de vorige stap (2.1.8) wordt gebruikt om de transductie van de cfr gen testen in de S. aureus-stammen. In dit experiment stammen N315, COL of MU50 worden gebruikt als de ontvangers.
   1. Bereid de nachtkweek van N315, COL of MU50 in 5 ml NBCaCl ₂ bij 37 ° C onder schudden (180 rpm).
   2. Verdun tHij faag NBCaCl ₂ tot 10 ~ ⁹ pfu / ml.
   3. In een 50 ml glazen flesje, meng 500 pl overnachtkweek, 500 pl vers NBCaCl _2, en 1 ml faag (~ 10 ⁹ pfu / ml); de verwachte multipliciteit van infectie (MOI) niet hoger 1. Incubeer het mengsel bij 37 ° C onder zachtjes schudden (100 rpm) gedurende 30 min.
      OPMERKING: Thermische ontvangende cellen vlak voor de toevoeging van faag (52 ° C gedurende 2 minuten om de endogene restrictie-enzymen te inactiveren) kan de efficiëntie ¹² te verhogen.
   4. Voeg 50 ul van 20% _Na3-citraat. Blijven zacht schudden gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
      LET OP: Na ₃ citraat fungeert als een gematigde chelator van calcium.
   5. Bereid gesmolten hersen-hart infusie (BHI) agar (1,5% agar) medium en bewaar het in een waterbad bij 55 ° C.
   6. Breng de bacterie faag-mengsel aan een 100 ml kolf, voeg 50 ml warm BHI agar gesupplementeerd met 32 ​​mg / l chloramphenicol en meng goed. Giet het mengsel in de 90 mm petrischalen.
      OPMERKING: deze methode kan de detectie van een klein aantal van de groeiende kolonies (vermeende transductanten).
   7. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 24-48 uur.
   8. Verder de gegenereerde kolonies (transductanten) voor resistentie testen door overdracht van de kolonies naar nieuwe BHI-agarplaten gesupplementeerd met 32 ​​mg / L chlooramfenicol. Bevestigen de aanwezigheid van de cfr-gen door kolonie PCR ^7.

3. Natural Transformation

LET OP: De natuurlijke transformatie test in S. aureus werd naar aanleiding van de in onze vorige studie ² beschreven methode uitgevoerd. De N315 derivaat, N2-2.1 ^{2, 7,} werd gebruikt als ontvanger. In deze stam werd de zucht locus gedupliceerd om constitutief uitdrukkelijke zucht ^2. voor detscheelde procedures over hoe te isoleren-zucht uitdrukken competentie varianten, zie een eerdere beschrijving ^2. Als de weerstand marker over te dragen is niet chlooramfenicol, kunnen Prit-zuchten (Cm ^R) worden gebruikt om uit te drukken zucht, zoals eerder ² beschreven. Gezuiverd plasmide-DNA of volledige uittreksel uit cfr -acquired S. aureus COL-45 ⁷ wordt gebruikt als het donor-DNA voor transformatie.

1. Bereiding van donor-DNA
   1. Cultiveren COL-45 gedurende de nacht onder schudden bij 37 ° C in een kolf van 300 ml die 50 ml TSB aangevuld met 32 ​​mg / L chlooramfenicol. Cultuur E. coli HST04 dragen pHY300 plasmide ^{(Tet R)} van het plasmide voor de controleproef extraheren.
      LET OP: HST04 (dam ^- / DCM ^-) ontbreekt het DNA methylase genen ^13. Andere gebruikelijke stammen met DNA methylases kunnen ook gebruikd de donor DNA te bereiden, omdat de DNA methyleringstaat beïnvloedt de transformatie-efficiëntie. Alternatief pT181 plasmide gezuiverd uit de S. aureus-stam COL kan ook worden gebruikt als een positieve controle voor de transformatie test ^2.
   2. Verzamel de cellen door centrifugeren (8000 x g gedurende 10 min bij 4 ° C).
   3. Extraheer de plasmiden met behulp van een plasmide DNA extractie kit of een conventionele DNA zuiveringswerkwijze de gehele DNA te zuiveren.
   4. Kwantificeren van de gezuiverde DNA door spectrometer en houd het bij 4 ° C tot gebruik.
      OPMERKING: Gebruik een nieuw DNA preparaat voor de transformatie assay, gewoonlijk minder dan een week oud. Oude DNA preparaten verminderen de efficiëntie van de transformatie.
2. transformatie assay
   1. Cultuur de ontvangende cel (N2-2.1) overnacht in 5 ml TSB bij 37 ° C onder schudden.
   2. Transfer 0,5 ml overnacht cultuur in een 1,5 ml buis. Precipitate de cellen door centrifugatie (10.000 x g gedurende 1 min bij 4 ° C).
   3. Suspendeer de cellen met 10 ml CS2 medium in een 50 ml buis.
      LET OP: CS2 medium is een volledig synthetisch medium dat de bevoegdheid induceert voor natuurlijke transformatie in S. aureus ² (zie het medium samenstelling in de Material tabel). Andere standaard laboratorium media, zoals TSB of BHI, zijn niet geschikt voor transformatie ^{2, 13.}
   4. Groeien de kiemen bij 37 ° C onder schudden (180 rpm) tot de late exponentiële fase (ongeveer 8 uur).
   5. Oogst de cellen door centrifugatie (5000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C).
   6. Resuspendeer de cellen in 10 ml vers medium CS2.
   7. Voeg 10 ug van gezuiverd plasmide of genoom DNA (stap 3.1.4) aan de celsuspensie. Schudden bij 37 ° C en 180 rpm gedurende 2,5 uur.
      LET OP: Kortere incubatietijd met DNA (<2,5 uur) resulteren in een lagere transformatie frequenties.
   8. Verzamel cellen door centrifugeren (5000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C).
   9. Resuspendeer de cellen in 10 ml BHI medium. Meng de celsuspensie met 90 ml gesmolten BHI-agar (55 ° C) supplement met 32 ​​mg / l chlooramfenicol (of 5 mg / l tetracycline in de controleproef). Giet het mengsel in de 90 mm petrischalen. Snel afkoelen en laat de agar stollen.
   10. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 2 dagen.
   11. Repliceren gegenereerde kolonies (transformanten) in door de kolonies (met tandenstokers) nieuwe BHI agarplaten die de geschikte antibiotica hun resistentiekenmerken bevestigen. Bevestig de verworven resistentie-gen (cfr of tetM) door kolonie PCR ^7.

Results

De resultaten hier vertegenwoordigd zijn eerder gepubliceerd (aangepast uit referentie ⁷ met toestemming van de uitgever). We bestudeerden de mogelijke stralingsroutes van de cfr gen dat linezolid lage weerstand en de expressie van de PhLOPSA-fenotype ^{14, 15} in S. aureus stammen veroorzaakt, door het onderzoeken van drie mechanismen HGT.

Discussion

Dit werk beschrijft de drie belangrijkste methoden om de HGT van genetische determinanten in S. aureus te bestuderen. Hoewel transductie en vervoeging zijn onderzocht voor tientallen jaren, werd het bestaan van natuurlijke transformatie pas onlangs erkend ^2. Aldus S. aureus is uitgerust met alle drie belangrijkste takken van HGT en testen allemaal nodig is om de mogelijke verspreiding paden van genetische determinanten verduidelijken. Het doel van dit werk is om volledige ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)	Becton Dickinson	211825
Brain Heart Infusion (BHI)	Becton Dickinson	211059
Nutrient Broth No. 2	Oxoid	CM0067
Sheep blood agar	Eiken Chemical Co.,Ltd.	E-MR96	Tryptic soy agar toegevoegd met 5% (v/v) schapenbloed volgens de fabrikant.
Agar poeder	Wako Pure Chemical Industries	010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)	Wako Pure Chemical Industries	191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter	Merck Milipore	HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit	QIAGEN	12243