Methodenartikel

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

DOI:

10.3791/55094

⸱

17 januari 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University, 2Department of Physiology and Biophysics, Virginia Commonwealth University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit is een methode om een ​​3-dimensionale celcultuur scaffold aan pulmonale extracellulaire matrix te creëren. Intact long verwerkt tot hydrogelen die de groei van cellen in drie dimensies kan ondersteunen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een methode voor het vaststellen van meervoudige component celkweek hydrogels voor in vitro long celkweek. Beginnend met gezonde en bloc longweefsel van varkens, rat of muis, wordt het weefsel perfusie en ondergedompeld in daaropvolgende chemische reinigingsmiddelen om de celresten te verwijderen. Histologische vergelijking van het weefsel voor en na verwerking bevestigt verwijdering van meer dan 95% van dubbelstrengs DNA en alfa- galactosidase kleuring zien dat de meerderheid van cellulaire afval wordt verwijderd. Na decellularisatie, het weefsel gevriesdroogde en vervolgens cryomilled tot een poeder. De matrix poeder wordt gedigereerd gedurende 48 uur in een zure pepsine oplossing en daarna geneutraliseerd tot de pre-gel te vormen. Gelering van het pre-gel oplossing kan worden geïnduceerd door incubatie bij 37 ° C en kan worden gebruikt direct na neutralisatie of maximaal twee weken opgeslagen bij 4 ° C. Coatings kunnen worden gevormd met de pre-gel oplossing op niet-behandelde dienblad cell attachment. Cellen kunnen worden gesuspendeerd in de pre-gel voorafgaand aan zelfassemblage een 3D cultuur bereiken, uitgeplaat op het oppervlak van een gel gevormd waarvan de cellen kunnen migreren door het schavot, of bedekt op de bekledingen. Wijzigingen in de strategie gepresenteerd van invloed kan zijn geleringstemperatuur, kracht, of eiwit fragment maten. Beyond hydrogel formatie, kan de hydrogel stijfheid verhoogd door toepassing genipin.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vertalen van in vitro resultaten naar de klinische praktijk is een van de meest uitdagende problemen waarmee biomedische onderzoekers worden geconfronteerd. In vitro onderzoek op weefselkweekplastic is eenvoudiger, handiger en behoudt een hoge cellevensvatbaarheid.1 Deze aanpak is een redelijke start, maar de resultaten hebben een beperkte klinische toepasbaarheid. Steeds vaker gebruiken laboratoria driedimensionale constructies om de traditionele tweedimensionale methoden te vervangen. Er zijn reviews beschikbaar voor vele driedimensionale omgevingen, van biologische skeletten tot polymeerskeletten.2,3

Biologische structuren kunnen kenmerken van in vivo omgevingen nabootsen omdat ze veel van de eiwit- en glycosaminoglycaancomponenten van de natuurlijke matrix bevatten en bekende bindingsplaatsen bieden waaraan cellen zich kunnen hechten en herkennen. Het is aangetoond dat materialen afgeleid van de extracellulaire matrix (ECM) in staat zijn om skeletten te vormen voor celhechting en -proliferatie.4 Een uitdaging die de toepassing van ECM-hydrogelplatforms beperkt, komt voort uit hun inherent zwakke mechanische eigenschappen na gelering. Natuurlijk weefsel heeft vaak mechanische eigenschappen die veel hoger zijn dan die van hydrogels. Niet-toxische verknopingsmiddelen kunnen de mechanische eigenschappen van hydrogels verhogen om de natuurlijke weefselomgeving beter te nabootsen. Genipine is een niet-toxisch, natuurlijk verknopingsmiddel afgeleid van Gardenia-planten met de mogelijkheid om de mechanische eigenschappen van ECM nauwgezet aan te passen door veranderingen in de genipineconcentratie5,6.

Bijna alle cellen in het lichaam bestaan in en organiseren zich op ECM dat ze zelf produceren of onderhouden. Nieuwe aandacht voor de universele betekenis van ECM in de organisatie, toestand en functie in elk orgaan of systeem heeft geleid tot de productie van matrixgebaseerde platformen voor in vitro onderzoek. Varkenssubmucosa van de dunne darm is het meest uitgebreid bestudeerde natuurlijk afgeleide skelet en het is gebruikt om pezen, ligamenten, skeletspieren4 en zelfs bot7 te regenereren. Matrices uit andere organen en donordiersoorten hebben ook goed weefselregeneratiepotentieel aangetoond. Het gebruik van vreemde ECM-componenten veroorzaakt minimale problemen met immunomodulatie. Na eliminatie van hostcellulaire materie zal het resterende ECM qua aminozuurgehalte en organisatie vergelijkbaar zijn met die van alle andere zoogdiersoorten8. Er is een groeiende denkwijze dat de beste manier om cel-ECM-interacties in vitro te onderzoeken, is door orgaanspecifieke ECM-skeletten te gebruiken. Elk orgaan biedt een unieke samenstelling van eiwitten en proteoglycanen om cellulaire niches te creëren. Niches zorgen voor structurele, functionele en zelfs enzymatische afbraak van de extracellulaire matrix die bijdraagt aan biofysische signalering. Om een in vitro micro-omgeving te verkrijgen die het meest lijkt op de in vivo micro-omgeving, zou het gebruik van weefselspecifiek ECM de cellulaire niches voor onderzoek optimaliseren.

Het doel van dit protocol is om een methode te bieden voor het opzetten van een hydrogelskelet uniek voor de long-ECM. Deze methode biedt een platform voor in vitro onderzoek naar longcel-ECM-interacties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Oplossing steriele Filter Routebeschrijving
DIH 2 O Ja DIH 2 O; steriel gefiltreerd
0,1% Triton X-100 oplossing Ja Onder zuurkast voeg 100 ul Triton-X 100 Oplossing voor 100 ml Dih 2 O en schud totdat het is opgelost;
steriel filter.
2% deoxycholaat oplossing Ja Onder zuurkast voeg 2 g natriumdeoxycholaat oplossing
per 100 ml Dih 2 O en schud totdat het is opgelost; steriel filter
1 M NaCl Ja Voeg 58,44 g NaCl tot 1 L van Dih 2 O; schud totdat het is opgelost;
steriel filter
DNase oplossing Ja Voeg 12.000eenheden DNase 1 L Dih 2 O; Voeg 0,156 g MgSO4
(Watervrij), en 0,222 g CaCl2; schud totdat het is opgelost; steriel filter
PBS Ja Combineer 27,2 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (heptahydraat),
80 g NaCl en 2 g KCl met 10 L Dih 2 O; schud totdat het is opgelost; pH instellen op 7,4; steriel filter

Tabel 1: oplossingen die nodig zijn voor Tissue Decellularisatie. Maak de bovenstaande oplossingen voor de cellen ontdoen proces. Bewaren bij 4 ° C. Ongeveer 2,5 L is nodig voor een varken long.

1. Hydrogel Formation

  1. Porcine Lung Decellularisatie (overgenomen van referenties 9,10)
    1. Te verkrijgen, een en bloc normale varkens long, uit een slachthuis, met hart en Vasculature intact.
    2. Tissue schaar of scalpel weg ontleden het hart, bloedvaten snijden zo dicht mogelijk bij het hart, zal nog vaatstelsel worden gebruikt in latere stappen voor perfusie.
    3. ontleden zorgvuldig weg het bindweefsel rond de luchtpijp, bronchiën en vaatstelsel met behulp van een scalpel of schaar.
      OPMERKING: Bepaal de beste long gebruiken voor de rest van de procedure uitgesproken door een long zonder grote sneden of gaten door de pleura en grote hoeveelheden atelectase of vasculaire occlusie dat de effectiviteit van de decellularisatie proces kan belemmeren.
    4. Knip de suboptimale long verlaten zoveel bronchus gehecht aan de luchtpijp mogelijk (hart, bindweefsel en de lobben van de verwijderde longen kunnen worden afgestoten). Er moet één long bevestigd blijft aan de luchtpijp en vaatstelsel.
      NB: Behoud secties voor histologie indien gewenst. 9
    5. Sluit verbroken bronchiën met klemmen of hechting aan pRevent overtollige terugstroom.
    1. Bereid de cellen ontdoen oplossingen de koelkast bij 4 ° C totdat het nodig is (Tabel 1).
    2. Met behulp van een handpomp canule aan de longslagader passen, perfuseren het longweefsel 3 maal met DI water door middel van zowel de longslagader en de luchtpijp. Perfuseren het vaatstelsel eerst elke keer. Begin met ongeveer 1 L in het vaatstelsel en 1,5 L in trachea per perfusie, maar celresten verwijderd vloeibaarder kan worden geperfuseerd via het systeem.
    3. Perfuseren zowel vasculatuur en de luchtpijp met Triton X-100 oplossing.
    4. Onderdompelen longweefsel in Triton X-100 oplossing 24 uur bij 4 ° C.
    5. Perfuseren het vaatstelsel en de luchtpijp 3 keer met DI-water te spoelen.
    6. Perfuseren zowel vasculatuur en trachea met deoxycholaat oplossing.
    7. Dompel de weefselcoupes in deoxycholaat gedurende 24 uur bij 4 ° C.
    8. Perfuseren het vaatstelsel en de luchtpijp 3 keer met DI-water te spoelen.
    9. Perfuseren zowel vasculatuur en trachea met NaCl-oplossing.
    10. Onderdompelen weefsel in gefilterd NaCl oplossing gedurende 1 uur bij 4 ° C.
    11. Perfuseren het vaatstelsel en de luchtpijp 3 keer met DI-water te spoelen.
    12. Perfuseren zowel vasculatuur en trachea met DNase oplossing.
    13. Onderdompelen weefsel in gefilterd DNase oplossing 1 uur bij 4 ° C.
    14. Perfuseren zowel vasculatuur en trachea 5 maal met PBS.
    15. Ontleden weg merkbare kraakbeenweefsel, trachea en alle buisjes 2 mm of groter in diameter (vooral in de omgeving van de hilus en mediale gedeelten van de longen) vanaf geleidende luchtwegen, waardoor alleen respiratoire zones (voornamelijk randgebieden).
    16. Ontleden weefsel in 1 inch secties of kleiner. Oriëntatie van het weefsel niet van belang voor deze stap.
    17. Giet overtollige vloeistof af en plaats weefsel in 50 ml conische buizen. Bevries het weefsel bij -80 ° C.
      LET OP: Behoud secties voor histologie om de verwijdering van cellen en cellulaire debri verzekerens, indien gewenst. We gebruiken H & E, α-galactosidase, picogreen, hydroxyproline, ninhydrine, alcian blauw, SDS-PAGE en massaspectrometrie te karakteriseren. 9
  2. Lung Processing
    1. Verwijder deksels uit ingevroren buisjes die cellen ontdane longweefsel.
    2. Plaats de papieren filter over de buis opening en veilig met rubber band.
      OPMERKING: Buis en de inhoud moet nog steeds worden bevroren op enigerlei andere wijze in -80 ° C tot bevroren.
    3. Lyofiliseren het weefsel totdat alle overtollige vloeistof is verdwenen, met behulp van een vriesdroger volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Bewaar bij -80 ° C tot klaar te frezen.
    4. Voordat u begint toe te voegen vloeibare stikstof vriezer molen isolatie en interne onderdelen tot de arbeidsomstandigheden.
    5. Verwijder magnetische molen bar van molen buis en voeg weefsel naar beneden te dekken.
    6. Vervang de molen bar en voeg los verpakt weefsel. De molen bar moet nog steeds vrij te bewegen.
    7. Sluit de molen buis en place in de vriezer molen.
    8. Vul vloeibare stikstof tot max vullijn.
    9. Vriezer molen alle weefsels tot fijn poeder (ongeveer 5 min, impactie snelheid van ~ 600 min -1), in een polycarbonaat cilinder met een roestvrij stalen impactor evenals roestvrij staal einde stekkers met behulp van de vriezer molen volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Bewaren bij -80 ° C tot aan gebruik.
  3. Microporeuze gelvorming (8 mg / ml) (naar referenties 9,11)
    1. Voeg 1% (w / v) van het gedecellulariseerde poeder en 0,1% (w / v) pepsine tot 0,01 M HCl, onder constant roeren (moet kunnen stromen weergegeven boven vloeistofniveau), bij kamertemperatuur, 48 uur.
      Opmerking: Het poeder wordt statisch geladen, zodat het toevoegen van de HCl nadat het poeder in de gelegenheid om de overtollige wassen de buiswanden verschaft.
    2. Na digereren gedurende 48 uur, plaats de oplossing en reagentia op ijs gedurende 5 minuten.
    3. Middels gekoelde 10% (v / v) 0,1 M NaOH, eend 11,11% (v / v) 10x PBS (op de gehele oplossing brengen concentratie 1x), brengen de verteerde eiwitoplossing tot fysiologische pH van 7,4.
      NB: De oplossing kan nu maximaal een week bewaard bij 4 ° C. Voer geleren kinetiek met behulp van reometrie 9 indien gewenst.

2. Cross-linking Hydrogels om mechanische sterkte te verbeteren

  1. Oplossingen van 1%, 0,1% en 0,01% w / v genipin verknopingsoplossing werden bereid door oplossen van de noodzakelijke hoeveelheid genipin poeder in 10% DMSO.
  2. Vortex de oplossing elke 15 min gedurende 1 uur.
  3. Voeg genipin oplossing ECM hydrogels (100 ul per putje van een 96-well plaat) die eerder zijn geassembleerd gedeeltelijk 1.3.4 dekken.
  4. Leg elke ECM hydrogel verknopen gedurende 24 uur bij 37 ° C.
  5. Spoel de ECM hydrogel 3 maal met PBS totdat de wasvloeistof niet langer blauw. De verknoopte hydrogels zal dan klaar voor verdere karakterisering en cell cultuur studies.

3. Cultuur van de Cel met Microporeuze Gel

  1. Tweedimensionale coating
    1. Met oplossing van 1.3.3, voeg 20 ul van pre-gel oplossing in elk putje van een 96-well niet-behandelde weefselkweekplaat.
    2. Nacht in de koelkast bij 4 ° C te laten eiwit adsorptie tot op het bord.
    3. Zuig Pregel oplossing en spoel af met PBS.
    4. 9 passage cellen.
    5. Voeg 10.000 cellen / cm2 putjes.
    6. Verhoging media 100 pl per putje en incubeer bij 37 ° C.
  2. Driedimensionale celcultuur 9
    1. Gebruikt oplossing van 1.3.3, resuspendeer pellet celconcentratie van 1.000.000 cellen / ml Pregel oplossing.
    2. Snel afzien 16 pi pre-gel-celsuspensie in elk putje van een 96-wells plaat, een ~ 500 um dikke hydrogel 3D celkweek vormen.
    3. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30min voor gel te vormen.
    4. Voeg 100 ul van medium naar de top van hydrogelen en incubeer bij 37 ° C.
  3. Driedimensionale celcultuur op variabele stijfheid gels
    1. Gebruik van oplossing 1.3.3 Pipetteer 100 ul van pre-gel oplossing in elk putje van een 96-wells plaat.
    2. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten gel te vormen.
      Opmerking: Cross-linking stappen van deel 2 kan hier worden gebruikt.
    3. 9 passage cellen.
    4. Voeg 10.000 cellen / cm2 putjes.
    5. Verhoging media 100 pl per putje en incubeer bij 37 ° C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met deze methode, hebben we hydrogelen van normaal varken, rat, en muis longen (figuur 1) verkregen. Verwerkte longen geven respectievelijk een geschatte 5 mg, 40 mg en 10 g ECM poeder. Een overzicht van de werkwijze is weergegeven in figuur 2. Key visualisaties tijdens het proces zijn onder meer: ​​wit uiterlijk van de longen na het spoelen deoxycholaat; na de vorming Pregel dient de oplossing ondoorzichtig en de oplossing moet homogeen weergegeven voor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de integrale aspecten van de biologie is de zelforganisatie van moleculen in hiërarchische structuren die een specifieke taak uit te voeren. 13 In het laboratorium zelfassemblage afhankelijk van talrijke factoren zoals zoutconcentratie, pH en duur spijsvertering. Zoals getoond zelforganiserend hydrogel vormen wanneer opgeloste eiwitten weer een fysiologische temperatuur. De gevormde hydrogel kan bevorderen cellulaire hechting en proliferatie in vitro.

Cellulaire r...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen graag Smithfield boerderijen bedanken voor het doneren van het intacte varkens longweefsel. We willen ook graag bedanken Dr. Hu Yang, Dr. Christina Tang en de afdeling Heelkunde VCU Plastic voor het mogelijk maken om hun apparatuur te gebruiken. Hydrogel en weefselmonsters werden voorbereid voor SEM bij de VCU Afdeling Anatomie en Neurobiologie Microscopy Facility ondersteund, voor een deel, door de financiering van NIH-NINDS Center Core Grant 5 P30 NS047463 en, gedeeltelijk, door de financiering vorm NIH-NCI Cancer Center Ondersteuning Grant P30 CA016059. SEM beeldvorming van monsters bij de VCU Nanotechnologie Core karakterisering Facility (NCC). Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation, CMMI 1.351.162.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Triton X-100 Fisher ScientificBP151-100Gebruik in afzuigkap met oogbescherming en handschoenen.
Sodium DeoxycholateSigma-AldrichD6750-100gGebruik in kap met oogbescherming en handschoenen.
Magnesium SulfateSigma-AldrichM7506-500gGeen
Calcium ChlorideSigma-AldrichC1016-500gGeen
DNaseSigma-AldrichD5025-150KUGeen
HClSigma-Aldrich258148-500MLGebruik met oogbescherming en handschoenen.
PepsinSigma-AldrichP6887-5GGebruik in afzuigkap met oogbescherming en handschoenen.
Sodium HydroxideFisher ScientificBP359-500Gebruik met oogbescherming en handschoenen.
GenipinWako Chemicals078-03021Gebruik in afzuigkap met oogbescherming en handschoenen.
PBS 10xQuality Biological119-069-151Geen
PBSVWR45000-448Geen
Filter PaperWhatman8519N/A
Hand pumpFisher Scientific10-239-1N/A
Graduate BeakerVitLab445941N/A
CryomillSPEX6700Gebruik cryohandschoenen en oogbescherming.
LyophilizerFTS FlexiDryGebruik handschoenen.
RheometerDiscoveryHR-2Gebruik handschoenen en oogbescherming.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).
  2. Haycock, J. W. 3D Cell Culture. , Humana Press. (2011).
  3. Walker, J. M., Ed, Epithelial cell culture protocols. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).
  4. Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).
  5. Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin. J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).
  6. Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
  7. Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa. J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).
  8. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).
  9. Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. J.Biomed.Mater.Res.A. , (2016).
  10. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
  11. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  12. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS One. 5 (9), e12905(2010).
  13. Ratner, B. D., Bryant, S. J. Biomaterials: where we have been and where we are going. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).
  14. Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).
  15. Zhang, W. -J., et al. The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro. J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).
  16. Booth, A. J., et al. Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).
  17. Matsuda, A., et al. Evidence for human lung stem cells. N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).
  18. Zuo, W., et al. p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).
  19. Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
  20. Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hydrogelvormingdecellularisatietechniek3D celkweekpepsineverteringgenipine crosslinkingrheologische testencelhechtingsassayvriesdrogingsprotocolcryomalingproces

Gerelateerde artikelen