Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het activeren van Autofagie door Aerobic Oefening in Muizen

12.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55099

⸱

3 februari 2017

 , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University

In dit artikel

Samenvatting

Autofagie activatie is gunstig bij de preventie van een aantal ziekten. Een van de fysiologische technieken induceren autofagie in vivo lichaamsbeweging. Hier laten we zien hoe autofagie activeren door aërobe oefening en meet autofagie niveaus in muizen.

Samenvatting

Autophagie is een lysosomale afbraakroute die essentieel is voor celhomeostase, functie en differentiatie. Onder stressomstandigheden wordt autofagie geïnduceerd en richt zich op verschillende ladingen, zoals bulkcytosol, beschadigde organellen en verkeerd gevouwen eiwitten, voor afbraak in lysosomen. De resulterende nutriëntmoleculen worden teruggecycled naar het cytosol voor nieuwe eiwitsynthese en ATP-productie. Opregulatie van autofagie heeft gunstige effecten tegen de pathogenese van vele ziekten, en farmacologische en fysiologische strategieën om autofagie te activeren zijn gerapporteerd. Aërobe oefening is recent geïdentificeerd als een efficiënte autofagie-inductor in meerdere organen bij muizen, inclusief spier, lever, hart en hersenen. Hier tonen we procedures om autofagie in vivo te induceren door middel van geforceerde loopbandoefening of vrijwillig wiellopen. We demonstreren ook microscopische en biochemische methoden om autofagieniveaus in muisweefsels kwantitatief te analyseren, met behulp van de markereiwitten LC3 en p62 die samen met autofagosomen naar de lysosomen worden getransporteerd en daar afgebroken worden.

Inleiding

Autofagie is een evolutionair geconserveerd afbraakroute, die wordt geïnduceerd in reactie op verschillende stress-aandoeningen zoals honger en hypoxie 1, 2. Tijdens autofagie, dubbel membraan blaasjes, genaamd autofagosomen, nemen onnodige of beschadigde subcellulaire componenten en vervoeren ze in lysosomen voor degradatie 3. Basale autofagie is essentieel voor cellulaire functie en organisme ontwikkeling en verminderde basale autofagie is betrokken bij vele stoornissen, waaronder neurodegeneratie, tumorigenese en type 2 diabetes 4, 5, 6.

De bekendste fysiologische autofagie inducer is de honger. Het heeft echter twee belangrijke beperkingen. Ten eerste, verhongering duurt een lange periode om autofagie effectief te veroorzaken bij dieren, bijvoorbeeld, 48 uur van voedsel beperking in muizenIn de meeste organen. Ten tweede, verhongering nauwelijks induceert hersenen autofagie, als gevolg van een relatief stabiele toevoer van voedingsstoffen in de hersenen. In feite is het ook moeilijk om autofagie detecteren van kleine moleculen inductoren, zoals veel geneesmiddelen de bloed-hersenbarrière niet kan passeren. Dus, om beter de functie van autofagie activering in pathogenese analyseren we onlangs ontdekt dat de oefening is een meer potente fysiologische methode autofagie induceren in een korte tijd 7, 8, 9. Vergeleken met hongersnood, wordt autofagie effectief geïnduceerd door loopband lopen zo snel als 30 min. Aldus oefening is een gemakkelijke en krachtige fysiologische benadering om het mechanisme van autofagie bestuderen mediëren gezondheidsvoordelen en voorkomen van ziekten.

Er zijn verschillende eiwit markers voor de detectie van autofagie activiteit, waaronder LC3 en p62. LC3 (microtubule-geassocieerde eiwit 1A / 1B-light chain 3) is een cytosolisch eiwit (LC3-I te vormen) dat is geconjugeerd aan PE (fosfatidylethanolamine) bij autofagie. PE-gelipideerde LC3 (LC3-II vorm) wordt gerekruteerd op autophagosomal membranen en kan worden gebruikt om autofagosomen zichtbaar wordt bij gelabeld met GFP. De translocatie van het cytoplasma naar structuren van autofagosomen punctata onder microscopie is een indicatie van autofagie. p62 is een lading receptor voor autofagie substraten (zoals ubiquitinatie eiwitten), en is opgenomen in autofagosomen ook. Omdat het eiwit wordt afgebroken in lysosomen met autofagosomen, kan het niveau worden gebruikt om de flux te meten autofagie. Hier laten we zien hoe deze markers te gebruiken om autofagie te kwantificeren in verschillende muis weefsels veroorzaakt door aërobe oefening, met inbegrip van gedwongen oefening (loopband) en vrijwillige inspanning (loopwielen). Dezelfde werkwijzen kunnen ook worden toegepast op in vivo meten van autofagie na behandeling van andere induceerders.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Northwestern University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd.

1. muismodellen

  1. Gebruik 8-12 weken oude muizen in de lichamelijke oefening. Om uitgeoefend geïnduceerde autofagie in vivo te detecteren, gebruik maken van de GFP-LC3 transgene muizen (C57BL / 6 achtergrond) voor de beeldvorming studies en C57BL / 6 muizen voor biochemische analyses.

2. Exercise-geïnduceerde Autofagie

  1. Loopband setup - gedwongen oefening
    1. Acclimatiseren en trainen de muizen op een 10 ° omhoog geopend loopband voor 2 dagen. Op dag 1, oefent de muizen gedurende 5 minuten bij 8 m / min, en op dag 2, oefenen de muizen gedurende 5 minuten bij 8 m / min gevolgd door nog 5 minuten bij 10 m / min 10. Moedigen de muizen om te draaien met zachte hand duwtje.
    2. Op de 3e dag, laat de muizen ondergaan een enkele aanval van running voor 90 min op 10 ° bergop loopband, starting met een snelheid van 10 m / min. Na 40 min, verhoging van de snelheid van de loopband met een snelheid van 1 m / min om de 10 min gedurende in totaal 30 min, en vervolgens de snelheid met een snelheid van 1 m / min elke 5 min, totdat zij tot 17 m / min, voor een totaal van 90 minuten van de oefening tijd en 1070 meter van het runnen van afstand.
    3. Stel de elektrische prikkel bij een lage intensiteit bereik (1,2 Hz), en de muizen aan te moedigen om te lopen op voet herhaalde schokken te voorkomen.
    4. Voor weefsel collectie, euthanaseren de muizen door isofluraan inademing, gevolgd door cervicale dislocatie direct na het sporten. Andere goedgekeurde euthanasie werkwijzen kunnen ook worden gebruikt, zoals CO2 of IP injectie van andere anesthetica. Het niveau van autofagie lijkt niet te worden beïnvloed door werkwijzen van euthanasie.
  2. Loopwiel setup - vrijwillige uitoefening
    1. Plaats een muis loopwiel (11,4 cm diameter) in een kooi met een afzonderlijk gehuisveste muis.
    2. Controleer de lopende capaciteit met behulp van een fiets kilometerteller.Stel de parameter wiel [afstand (in mm) per volledige omwenteling van het wiel] bij 358 (11.4 * π). Meet de afgelegde afstand na 24 uur.
    3. Laat de muis lopen vrijwillig voor 2 weken met het loopwiel. Voor weefsel collectie, offeren de muis in de ochtend na de lopende periode.

3. Autofagie Flux Evaluatie

  1. Om de autophagic flux onder rust en uitoefenvoorwaarden te meten, te behandelen muizen met de autofagie-remmer chloroquine voor drie dagen en ze te vergelijken met muizen behandeld met PBS.
    1. Chloroquine oplossen in PBS (5 mg / ml), en injecteer chloroquine in muizen intraperitoneaal in een dosis van 50 mg / kg / dag gedurende drie opeenvolgende dagen. Offer muizen en het verzamelen van weefsels 3 uur na de laatste injectie.
    2. Voor uitgeoefend muizen voorbehandelen ze met chloroquine gedurende twee opeenvolgende dagen in een dosis van 50 mg / kg / dag. Op de derde dag, injecteren muizen met dezelfde concentratie chloroquine en na90 min laat ze lopen op de loopband voor nog eens 90 min.
    3. Euthanaseren de muizen met isofluraan inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie. Verzamel weefsel onmiddellijk na het uitvoeren, zodat de totale incubatietijd van chloroquine is hetzelfde als controle (rust) muizen (3 uur).
      LET OP: U kunt ook gebruik maken van een enkele injectie van chloroquine de autofagie flux in de muis weefsels te bepalen.

4. Tissue Harvest en Fixation

  1. Voorafgaand aan weefsel oogsten bereiden fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en vers 4% paraformaldehyde (PFA, voorzichtig: persoonlijke beschermingsmiddelen vereist) in PBS bij een uiteindelijke pH van 7,4. Bewaar beide oplossingen bij 4 ° C.
  2. Vul 30 ml spuit met 15-20 ml van 4% PFA (voor GFP-LC3 muizen). Sluit de spuit met een 20 G catheter naald.
  3. Na de oefening, euthanaseren de muizen met isofluraan inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie.
  4. Leg het dier op een schoon werkvlak op zijn back. Knip en open de borstholte door het snijden van het membraan naar het hart bloot te leggen.
  5. Maak een kleine incisie op de lever te laten het bloed naar buiten komen, en injecteer een totaal van 15 ml 4% PFA langzaam in de rechterkamer van het hart via de katheter, totdat de longen en de lever draai helemaal bleek. Perfuseren de muis direct na de trainingssessie, met een injectiespuit pomp met een constante stroomsnelheid van 90 ml / uur.
  6. Na perfusie, verwijder de naald en het verzamelen van weefsels van belang (bijvoorbeeld de hersenen 11 en skeletspieren). Voor skeletspieren, ontleden de vastus lateralis. Kort samengevat, trek de huid van het been naar achteren om de spieren bloot lokaliseren quadriceps femoris 12 en ontleden vastus lateralis, dat de uitwendige spier bevestigd aan het bovenste gedeelte van het dijbeen.
  7. Voor verdere fixatie en dehydratatie, plaats de weefsels van GFP-LC3 muizen in 4% PFA gedurende 24 uur bij 4 ° C, en vervolgens overbrengen naar 15%sucrose-PBS bij 4 ° C geïncubeerd of totdat de weefsels zijn opgelost en daarna 30% sucrose-PBS bij 4 ° C overnacht of voor langere opslag. Houd de monsters in het donker zoveel mogelijk ze gevoelig voor fel licht kan zijn.
  8. Voor western blot analyse snap bevriezen weefsel van C57BL / 6 muizen direct in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 ° C.

5. Imaging Analyse van GFP-LC3 Puncta

  1. tissue proces
    1. Pre-behandeling van de weefsels (voorheen vast in PFA en opgeslagen in 30% sucrose) in de inbedding medium zoals "Optimal Cutting Temperatuur verbinding" (oktober) voor een paar minuten in een gemerkte kleine petrischaal.
    2. Breng het weefsel in een gemerkte cryomold met voldoende frisse oktober om het weefsel te dekken. Orient het snijden oppervlak in de richting van de onderkant van de cryomold (doorsnede voor de vastus lateralis spier en sagittale sectie voor de hemi-hersenen). Vermijd de vorming van bellen.
    3. FreEze de monsters door het plaatsen van de cryomold voor een paar minuten in een overdekte schuim koeler gevuld met droog ijs, totdat de oktober wordt wit. Wikkel individuele monsters in geëtiketteerde folies, verzegelen ze in een plastic zak, en bewaar ze bij -80 ° C gedurende de nacht of langer.
    4. Met een cryostaat monster coupes met een dikte van 10 urn, en zet de delen op de glijbaan. Bewaar de objectglaasjes bij -20 ° C, en altijd de objectglaasjes tegen licht waar mogelijk.
  2. Slide voorbereiding
    1. Verwijderen dia's uit de vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur. Bedek de weefselsectie met een druppel fixeermiddelen met DAPI. Plaats een dekglaasje van geschikte grootte op de top en te voorkomen dat belvorming.
    2. Gebruik nagellak aan de randen van het dekglaasje af te dichten, laat nagellak te drogen in het donker bij kamertemperatuur, en vervolgens de dia's in een lichtdichte container op te slaan bij 4 ° C, of ​​doorgaan met beeldvorming capture van GFP-LC3 puncta.
  3. Kwantificering van GFP - LC3 puncta met behulp van fluorescentie microscopie
    1. Voer epifluorescentie microscopie, het vastleggen van foto's in dezelfde staat (belichting en instellingen) voor alle monsters. Voor GFP, gebruik dan een emissie golflengte van 525 nm; voor DAPI, gebruikt 490 nm. Verwerven minstens tien beelden per monster met een 60X objectief voor vastus lateralis en de frontale cortex gebied van de hersenen.
    2. Kwantificeren van het aantal GFP-LC3 puncta in een weefsel oppervlakte van 2500 um 2 in elk beeld voor statistische analyse, verblind voor experimentele groepen. Bereken het gemiddelde aantal van 10 beelden van elk monster, met behulp van de automatische meting functie van "Object Count". Instellingen voor de vastus lateralis spier zijn: Threshold L = 10, H = 200; 2X glad; 1X schoon, en de instellingen voor de hersenen frontale cortex zijn: Threshold L = 11, H = 200; 2X glad; 1X schoon.

6. Western Blot analyse over Autofagie Markers

  1. Tissue proces
    1. Bereid de lysis buffer: 50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; proteaseremmer en fosfatase-inhibitor (vers toegevoegd).
    2. Verwijder het weefsel van C57BL / 6-muizen van -80 ° C bewaren. Snijd het spierweefsel in kleine stukjes met een scheermesje vóór het volgende proces. Voeg 800 pl (voor hemi-hersenen) of 500 pl (voor vastus lateralis) koude lysisbuffer aan het monster. Homogeniseer het monster bij 4 ° C met een homogenisator bij een gemiddelde snelheid.
    3. Volledig lyseren het gehomogeniseerde mengsel nog eens 30 minuten tot 1 uur bij 4 ° C met rotatie.
    4. Spin down het homogenaat bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, gooi de pellet en verzamel de supernatant in een nieuwe buis.
  2. autofagie analyse
    1. Bepaal de eiwitconcentratie weefsel lysaten met behulp van de BCA Protein Assay Kit volgens specificaties van de fabrikant. Normaliseren elk monsterdezelfde concentratie.
    2. Combineer het monster met de 2x Laemmli monsterbuffer bij een 1: 1 verhouding, kook het bij 95 ° C gedurende 5-10 min, en verder met western blot analyse autofagie markeringen 13, 14, zoals p62 (anti-p62-antilichaam, 1: 500 verdunning) en LC3 (anti-LC3 antilichaam, 1: 500 verdunning). Kook de monsters onmiddellijk na toevoeging van monsterbuffer zoals langere incubatie op ijs meerdere aangetaste banden van LC3 kan genereren.
    3. Kwantificeren p62 en LC3 bands door densitometrie analyse met behulp van ImageJ, en normaliseren van de waarde voor de overeenkomstige actine band.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol beschrijft twee verschillende methodes om autofagie te induceren in de muis weefsels door aërobe oefening: een totaal van 90 min van gedwongen oefening op een multi-lane loopband voorafgegaan door twee dagen van acclimatisatie; of twee weken van de vrijwillige oefening op een loopwiel gebruikt door single-gehuisvest muizen. Iedere testprotocol, kunnen we de autophagy flux door fluorescentie microscopie en western blot analyse in verschillende organen te meten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Autofagie is een katabool proces dat energie levert en vermindert cytotoxiciteit door lysosomale afbraak van cytoplasma onderdelen of beschadigde organellen. Bestuderen autofagie belangrijk voor de regulatie van cellulaire homeostase en de mechanismen van stress respons begrijpen. Nieuwe modellen en methodieken zijn in opkomst op het gebied van onderzoek 15, om te bestuderen hoe verstoorde autofagie bijdraagt aan tal van pathologische processen 16,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

We danken het Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratory voor technische ondersteuning en assistentie, en Noboru Mizushima (University of Tokyo) voor het verstrekken van GFP-LC3 transgene muizen. A. R. en C. H. werden ondersteund door de opstartfondsen van Northwestern University en de subsidie van National Institutes of Health (DK094980).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
LoopbandColumbus Instruments150-RM Exer 3/6
MuisloopwielSuper Pet100079365diameter 11,4 cm
KilometertellerBellDASHBOARD 100
InjectiepompKD ScientificKDS100
FluorescentiemicroscoopNikonModel: omgekeerde microscoop ECLIPSE
CryostatLeicaCM 1850UV
HomogenisatorIKA003737001 / Model: T10 Basic S1
ChloroquineCAYMAN CHEMICAL COMPANY14194
ParafolmaldehyeSIGMA-ALDRICHP6148Persoonlijke beschermingsmiddelen vereist. Dit product kan formaldehydegas afgeven, een chemische stof waarvan bekend is dat het kanker veroorzaakt.
MontagemediaVector LaboratoriesH-1200
p62 antilichaamBD Biosciences610833
LC3 antilichaamNovus BiologicalsNB100-2220
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad Laboratories161-0737
ImageJNIH

Referenties

  1. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
  2. Tracy, K., et al. BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy. Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).
  3. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  4. Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system. Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).
  5. Rocchi, A., He, C. Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders. Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).
  6. Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. Role of autophagy in cancer. Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).
  7. He, C., et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 481, 511-515 (2012).
  8. He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain. Autophagy. 8, 4(2012).
  9. Kuramoto, K., et al. Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids. Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).
  10. Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse. JoVE. , (2016).
  11. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).
  12. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  14. Bjørkøy, G., et al. Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1. Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).
  15. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, 1-222 (2016).
  16. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
  17. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  18. Fang, Y., et al. Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice. Cell Metab. 17, 456-462 (2013).
  19. Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).
  20. Miller, R. A., et al. Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction. Aging Cell. 13, 10(2014).
  21. Grumati, P., et al. Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles. Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).
  22. Lira, V. A., et al. Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).
  23. Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity. Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).
  24. Kregel, K. C., et al. Resource book for the design of animal exercise protocols. American Physiological Society. , 152(2006).
  25. Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med Sci Sports Exerc. 33, 5(2001).
  26. Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running. The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).
  27. Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver. European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).
  28. Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle. J Appl Physiol. 84, 4(1998).
  29. Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol. 71, 4(1993).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Activering van autofagieloopband voor muizenvrijwillig loopradrennenGFP LC3 reporterbehandeling met chloroquinewestern blot analyseLC3 II conversiep62 degradatieweefselfixatie
Het activeren van Autofagie door Aerobic Oefening in Muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.