Methodenartikel

Analyse van Cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan Physiological Oxygen Voorwaarden

DOI:

10.3791/55112

⸱

28 december 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we protocollen voor humane celcultuur om factoren voor translatie-initiatie te analyseren die zich binden aan de 5' dop van mRNA tijdens fysiologische zuurstofcondities. Deze methode maakt gebruik van een agarose-gekoppelde m7GTP dop-analogon en is geschikt om dop-bindende factoren en hun interacterende partners te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Translationeel controle is een brandpunt van gen-regulatie, vooral tijdens perioden van cellulaire stress. Cap-afhankelijke translatie via het eIF4F complex is verreweg de meest voorkomende route om eiwitsynthese in eukaryote cellen te initiëren, maar stress-specifieke variaties van dit complex worden nu zichtbaar. Het zuiveren van cap-bindende eiwitten met een affiniteitshars samengesteld uit Agarose-gekoppeld m7GTP (een 5' mRNA cap analoog) is een nuttig hulpmiddel om factoren te identificeren die betrokken zijn bij de regulatie van translatie-initiatie. Hypoxie (lage zuurstof) is een cellulaire stress die wordt aangetroffen tijdens de foetale ontwikkeling en tumorprogressie, en is sterk afhankelijk van translatie-regulatie. Bovendien werd onlangs gemeld dat menselijke volwassen organen een lagere zuurstofgehalte (physioxia 1-9% zuurstof) hebben die dichter bij hypoxie ligt dan de omgevingslucht waar cellen routinematig worden gekweekt. Met de voortdurende karakterisering van een hypoxisch eIF4F complex (eIF4FH), is er een toenemende interesse in het begrijpen van zuurstof-afhankelijke translatie-initiatie door de 5' mRNA cap. We hebben onlangs een methode voor humane celcultuur ontwikkeld om cap-bindende eiwitten te analyseren die worden gereguleerd door de beschikbaarheid van zuurstof. Dit protocol benadrukt dat celcultuur en lysis moeten worden uitgevoerd in een hypoxie werkstation om blootstelling aan zuurstof te elimineren. Cellen moeten gedurende ten minste 24 uur worden geïncubeerd voordat het vloeibare medium in evenwicht komt met de atmosfeer in de werkruimte. Om deze beperking te vermijden, kan voorgeconditioneerd medium (zuurstofvrij) aan cellen worden toegevoegd als kortere tijdstippen vereist zijn. Bepaalde cap-bindende eiwitten vereisen interacties met een tweede base of kunnen de m7GTP hydrolyseren, daarom kunnen sommige cap-interactors in het zuiveringsproces worden gemist. Agarose-gekoppeld aan enzymatisch resistente cap analogen kunnen in dit protocol worden vervangen. Deze methode stelt de gebruiker in staat om nieuwe zuurstof-gereguleerde translatiefactoren te identificeren die betrokken zijn bij cap-afhankelijke translatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Translationele controle is in opkomst als een even belangrijke stap om gentranscriptieregulatie in genexpressie, vooral in perioden van cellulaire stress 1. Een brandpunt van de vertaling controle is op de snelheidsbeperkende stap van initiatie, waar de eerste stappen van de eiwitsynthese betrekking hebben op de binding van de eukaryote initiatie factor 4E (eIF4E) naar de 7-methylguanosine (m 7 GTP) 5 'cap van mRNA 2 . eIF4E maakt deel uit van een trimere complex genaamd eIF4F dat eIF4A, een RNA-helicase en eIF4G, een steiger eiwit nodig is voor de indienstneming van andere vertaling factoren en de 40S ribosoom 3 bevat. Onder normale fysiologische omstandigheden, de meeste mRNA vertaald door een cap-afhankelijk mechanisme, maar onder perioden van cellulaire stress ongeveer 10% van humane mRNAs bevatten 5 'UTR die cap-onafhankelijke translatie waardoor inwijding 1,4. Cap-afhankelijke vertaling is van oudsher synoniemlende met eIF4F echter, stress-specifieke variaties van eIF4F hebben een trending topic 5-8 geworden.

Verschillende cellulaire stress veroorzaken eIF4E activiteit die moet worden onderdrukt via de zoogdieren doelwit van rapamycine complex 1 (mTORC1). Dit kinase minder wordt onder stress, wat resulteert in de verhoogde activiteit van een van de doelstellingen, de 4E-bindend eiwit (4E-BP). Niet-gefosforyleerde 4E-BP bindt aan en blokkeert eIF4E zijn vermogen tot interactie met eIF4G waardoor de onderdrukking van cap-afhankelijke translatie 9,10. Interessant is dat een homoloog van genoemd eIF4E eIF4E2 (of 4EHP) een veel lagere affiniteit voor 4E-BP 11, waardoor het mogelijk stress gemedieerde repressie onttrekken. Inderdaad, aanvankelijk gekarakteriseerd als een repressor van translatie vanwege het gebrek aan interactie met eIF4G 12, eIF4E2 initieert de translatie van mRNAs die honderden RNA hypoxieresponselementen elementen in de 3 'UTR bevatten in hypoxische spanning 6,13. Deze activering is bereikt door interactie met eIF4G3, RNA bindend eiwit motief 4, en de hypoxia induceerbare factor (HIF) 2α een hypoxische eIF4F complex of eIF4F H 6,13 vormt. Als een repressor onder normale omstandigheden, eIF4E2 bindt met GIGYF2 en ZNF598 14. Deze complexen werden gedeeltelijk geïdentificeerd door middel van agarose-gekoppelde m 7 GTP affiniteitsharsen. Dit klassieke methode 15 is standaard op het gebied van vertaling en is de beste en meest gebruikte techniek om-cap bindende complexen te isoleren in pull-down en in vitro bindingstesten 16-19. Als de cap-afhankelijke translatie machinerie is in opkomst als flexibel en aanpasbaar met inter-wisselende delen 6-8,13, deze methode is een krachtig instrument om nieuwe-cap-bindende eiwitten die betrokken zijn bij de reactie op stress snel kan identificeren. Bovendien verschillen in eIF4F kan grote gevolgen hebben als een aantal eukaryote modelsystemen blijken een eIF4E2 homoloog voor stressreacties zoals gebruikenals A. thaliana 20, S. Pombe 21, D. melanogaster 22 en 23 C. elegans.

Er zijn aanwijzingen dat variaties in eIF4F niet strikt kan beperkt stresssituaties, maar worden in normale fysiologie 24. De zuurstoftoevoer naar weefsels (at capillair uiteinden) of binnen weefsels (gemeten met micro-elektroden) varieert van 2-6% in de hersenen 25, 3-12% in de longen 26, 3,5-6% in de darm 27, 4% in de lever 28, 7-12% in de nier 29, 4% in de spieren 30 en 6-7% in het beenmerg 31. Cellen en mitochondriën bevatten minder dan 1,3% zuurstof 32. Deze waarden zijn veel dichter bij hypoxie dan de omgevingslucht wanneer cellen worden routinematig gekweekt. Dit suggereert dat wat eerder werd gezien als hypoxie-specifieke cellulaire processen betrokken in een fysiologische omgeving zijn. Interessant, eIF4F en eIF4F H actief deelnemen aan de translatie-initiatie van verschillende zwembaden of klassen van mRNA in verschillende menselijke cellijnen blootgesteld aan fysiologische zuurstof of "physioxia" 24. Lage zuurstof rijdt ook een goede ontwikkeling van de foetus 33 en cellen hebben in het algemeen een hogere proliferatie tarieven, langere levensduur, minder DNA-schade en minder algemene stressreacties in physioxia 34. Daarom eIF4F H is waarschijnlijk een belangrijke factor in de expressie van geselecteerde genen onder fysiologische omstandigheden.

Hier bieden we een protocol om kweekcellen in vaste fysiologische zuurstofarme omstandigheden of in een dynamisch fluctuerende bereik dat waarschijnlijk meer representatief is voor het weefsel micro-omgevingen. Een voordeel van deze methode is dat de cellen worden gelyseerd in de hypoxie werkstation. Het is vaak niet duidelijk hoe de overgang van hypoxische celkweek cellysis wordt uitgevoerd in andere protocollen. De cellen worden vaak eerst verwijderd uit een klein hypoxie incubator wordenvoorgrond lysis, maar deze blootstelling aan zuurstof kunnen beïnvloeden biochemische pathways de cellulaire reactie op zuurstof snel (één of twee min) 35. Bepaalde-cap-bindende eiwitten nodig interacties met een tweede base of kan de m 7 GTP, daarom enkele cap interactors kan worden gemist in het zuiveringsproces te hydrolyseren. -Agarose gebonden enzymatisch resistente cap analoga kunnen worden gesubstitueerd in dit protocol. Het verkennen van de activiteit en de samenstelling van eIF4F H en andere variaties van eIF4F door middel van de hier beschreven methode zal licht werpen op de ingewikkelde genexpressie machines dat cellen gebruiken tijdens fysiologische omstandigheden of stressreacties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereidingen voor Cultuur van de Cel

  1. Schaf commercieel beschikbare voorraden van menselijke cellen.
    LET OP: Dit protocol maakt gebruik van HCT 116 colorectaal carcinoom en primaire menselijke nier proximale tubulaire epitheelcellen (HRPTEC).
  2. Voeg 500 ml medium voor kweek van HCT116: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / hoge glucose-medium aangevuld met 7,5% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (P / S).
  3. Voeg 500 ml medium voor kweek van HRPTEC: Epitheliale celmedium aangevuld met 5% FBS, 1% epitheelcel groei supplement, en 1% P / S.
  4. Bereid 500 ml 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS): 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 15 mM KH 2PO 4. PH instellen op 7,4 en steriliseren in de autoclaaf gedurende 40 minuten bij 121 ° C.

2. Opening van celkweek

  1. zuig het medium van een 80-90% confluent gerecht zorgvuldig zonder storende thij cellen.
  2. Aliquot 3-5 ml 1x PBS per cultuur schotel, schud elke kolf voor het bekleden van het oppervlak van de schaal, en zorgvuldig zuig het 1x PBS. Herhaal dit voor een tweede 1x PBS wassen.
  3. Aliquot 3 ml 0,05% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) in elke kweekschaal en schud gelijkmatig bekleden van de cellen met trypsine-EDTA. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-3 min.
  4. Breng de losgemaakte cellen in een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 4000 xg gedurende 90 sec.
  5. Hersuspenderen celpellet in 1 ml compleet DMEM.
  6. Aantal cellen met een hemocytometer. Berekenen hoeveel pyrogeenvrij en polystyreen 100 mm celcultuurschalen moeten een initiële zaaidichtheid van ongeveer 2.500-5.000 cellen per cm2 bereiken.
  7. Pre-warm compleet celkweekmedium in stappen 1.2 of 1.3 in een 37 ° C waterbad gedurende 30-45 min.
  8. Ontsmet het medium fles en mobiele flacon met 70% ethanol. Vanaf dit punt naar voren allesoperaties moet aseptisch worden uitgevoerd.
  9. Aliquot 6 ml volledig DMEM in maar 100 mm celcultuurschalen nodig om het gehele volume van bevroren cellen gebruiken in de in stap 2,6 genoemde zaaidichtheid.
  10. Breng de volume celsuspensie berekend in stap 2.6 voor elk van de 100 mm kweekschalen. Schud elke plaat handmatig om de cellen gelijkmatig te verdelen over het oppervlak van de plaat.
  11. Plaats de geënte 100 mm celkweek schaal in de incubator bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Een cel in staat om ten minste 24 uur incuberen voordat de volgende stappen.

3. Subkweken

  1. Bekijk elke celkweekschaal onder een microscoop om het percentage cellen confluentie (% cellen die het gebied van de schotel) te bepalen. Cellen terug in de incubator en voorverwarmen compleet medium en 1x PBS. Ga verder met de volgende stap als de cellen 80-100% confluent.
  2. zuig het verbruikte medium zorgvuldig zonder verstoring van decellen in elke kweekschaal.
  3. Aliquot 3-5 ml 1x PBS per cultuur schotel, schud elke kolf voor het bekleden van het oppervlak van de schaal, en zorgvuldig zuig het 1x PBS. Herhaal dit voor een tweede 1x PBS wassen.
  4. Aliquot 3 ml van 0,05% trypsine-EDTA in elke cultuur gerecht en schud gelijkmatig de vacht van de cellen met trypsine-EDTA. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-3 min.
  5. Tijdens deze incubatie aliquot 10 ml van compleet medium in zoveel kweekschalen moeten celdichtheid van 2.500-5.000 cellen per cm2 verkregen.
  6. Wanneer de cellen losgemaakt van de plaat snel voeg 3 ml 1x gedefinieerd trypsineremmer en voorzichtig zwenken de schaal gedurende 1 minuut om te verzekeren dat alle trypsine-EDTA werd geneutraliseerd.
  7. Breng de vrijstaande cellen in een steriele 15 ml centrifugebuis en zet apart. Voeg 3 ml 1x PBS om de schotel om eventuele resterende cellen te verzamelen, en geven dat dezelfde 15 ml centrifugebuis.
  8. Pellet de cellen door centrifugeren 150 xggedurende 5 min.
  9. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 3 ml compleet medium.
  10. Aantal cellen met een hemocytometer en zaden 150 mm kweekschalen met 15 ml compleet medium tot een celdichtheid van 2.500-5.000 cellen per cm2 verkregen. Gebruik twee 150 mm per-cap bindingstest.
    OPMERKING: Zuurstof diffusie cellen door vloeibare media is afhankelijk van het volume 36. Het wordt aanbevolen het volume van de media vergelijkbaar bij experimenten houden of hechtende cellen of cellen in suspensie gebruikt. Media kunnen vooraf geconditioneerd (geïncubeerd in het werkstation voor 24 uur zoals in Discussie) deze variabiliteit in diffusie te voorkomen.
  11. Plaats de geënte-kweekschalen in de incubator bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Laat cellen om ten minste 24 uur broeden alvorens tot de volgende stappen.

4. Physioxic Exposure

  1. Toon de cellen onder de microscoop. voor best resultaten zorgen dat cellen 70-80% confluent een 24 uur blootstelling, 50-60% confluente een 48 uur blootstelling en 40-50% confluent een 72 uur blootstelling.
  2. Plaats de cellen in een hypoxie werkstation voor de gewenste (24, 48, of 72 uur, afhankelijk van het experiment).
  3. Stel het werkstation naar de juiste physioxia.
    Opmerking: Zo zou een 3% O2 instelling vergezeld van 5% CO2 en 92% N2.
    LET OP: Als zuurstof fluctuaties binnen een dynamisch bereik gewenst zijn over een bepaalde tijdlijn, het programma van de planning in het instrument of handmatig de instellingen van zuurstof op de gewenste tijdstippen aan te passen.
  4. Stel de vochtigheid 60%. Het werkstation sfeer is erg droog toch, en de media zullen merkbaar verdampt tijdens lange experimenten (> 48 uur). Houd een media-reservaat in een celkweek kolf binnen het werkstation (zodat de media wordt in evenwicht gebracht met het werkstation atmosfeer) aan de media te vullen in de celkweek dishes.
    LET OP: Elke oplossing die interageren met de cellen voorafgaand aan lysis (zoals PBS en trypsine-EDTA) moet vooraf gedurende 24 uur voor gebruik binnen de hypoxie werkstation zodat de opgeloste zuurstof in evenwicht met de zuurstof in de lucht 36.
  5. Houd cellen in het werkstation tot lysis.

5. Voorbereiden Buffers voor Cap-bindende Assay

  1. Bereid 1x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS).
    1. In 800 ml dH 2 O, los 8,76 g NaCl en 6,05 g Tris Base.
    2. Breng de oplossing tot een uiteindelijke pH van 7,4 onder toepassing van 1 M HCl.
    3. Breng het uiteindelijke volume tot 1 L met behulp van dH 2 O.
  2. Bereid niet-denaturerende lysisbuffer. Bereid lysis buffer op de dag van de cap-bindingstest. Voeg extra lysisbuffer naar de lege agarose kralen en de γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose C10-gekoppelde bolletjes (stap 7,9 en 7,13) was.
    1. In 7 ml dH 2 O, voeg 160 ul 5 M NaCll, 160 ui 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 ui 200 mM NaF, 40 pl 1 M MgCl2 en 40 pl 1 mM natriumorthovanadaat.
    2. Voeg 40 ul van Igepal de 7 ml oplossing. Snijd de punt van de pipet om halen Igepal aangezien het zeer viskeus.
    3. Meng door op en neer pipetteren of vortex de oplossing 7 ml totdat alle Igepal is opgelost.
    4. Verhoog het eindvolume van de oplossing tot 8 ml en op ijs bewaren.
  3. Bereid 4x natriumdodecylsulfaat (SDS) -PAGE Sample Buffer.
    1. In een bekerglas combineren 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml glycerol en 8 ml dithiothreïtol (DTT).
    2. Voeg 3,2 g SDS en 0,16 g broomfenolblauw. Sta poeder volledig opgelost door mengen met een magnetische roerstaaf.
    3. Aliquot in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C.

6. Cel Lysis

  1. Bereid niet-denaturerende lysisbuffer en blijf op ijs de dag van the cap-bindingstest.
  2. Voorverwarmen 1x PBS en trypsine in een 37 ° C waterbad gedurende 30 minuten.
  3. Aliquot 980 ul lysis buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis per-cap bindingstest uitgevoerd.
  4. Voeg 10 ul van 4- (2-aminoethyl) benzeensulfonylfluoride-hydrochloride en 10 pl 100x proteaseremmer cocktail aan het 980 pi lysisbuffer. Houd op het ijs.
  5. Gooi de media uit elke 150 mm schotel in een afvalcontainer in de hypoxie werkstation.
  6. Was de cellen met 3-4 ml warm 1x PBS en alle vloeistof verwijderen.
  7. Voeg 1 ml warm 0,05% trypsine-EDTA bij elke schaal en laat zitten gedurende 2 minuten of totdat de cellen niet meer gehecht aan de plaat.
  8. Met behulp van een pipet de cellen van een bord met een 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhalen als nodig, zodat elke plaat van cellen in een afzonderlijke 1,5 ml microcentrifugebuis.
  9. Centrifugeer de 1,5 ml microcentrifuge buizen bij 6000 xg gedurende 90 sec to pellet van de cellen.
  10. Zuig het trypsine met een pipet zonder de pellet te verstoren. Indien de pellet wordt verstoord, opnieuw gecentrifugeerd 1,5 ml microcentrifugebuis bij 6000 xg gedurende 90 sec.
  11. Was de cellen met warme 1x PBS door voorzichtig pipetteren 200 ul PBS in de buis boven de pellet. Re-centrifuge wanneer de pellet wordt verstoord.
  12. Zuig het PBS zonder de pellet te verstoren.
  13. Pipetteer 500 ul van 1 ml lysisbuffer bereide oplossing op de eerste cellulaire pellet. Resuspendeer de pellet volledig door en neer te pipetteren.
  14. Combineer de geresuspendeerde cellen met de tweede cel pellet en resuspendeer de tweede pellet door en neer te pipetteren. Herhaal dit totdat alle pellets werden samengevoegd en geresuspendeerd voor elk monster.
  15. Combineer het lysaat met de resterende 500 ul lysis buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
  16. Verwijder monsters van de hypoxie werkstation.
    OPMERKING: Na het toevoegen lysisbuffer, eenll daaropvolgende stappen worden uitgevoerd in de lucht als hypoxie werkstation is ingesteld op 37 ° C en de volgende stappen worden uitgevoerd koud (4 ° C of op ijs).
  17. Lyseren de cellen met behulp zacht schudden door rotatie van de monsters bij 4 ° C gedurende 1,5-2 uur.
  18. Centrifugeer de gelyseerde cellen bij 12.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C om celresten te verwijderen.
  19. Breng het lysaat naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en gooi de pellet.
  20. Reserveren een deel (5-10%) van het supernatant te gebruiken als een totaal cellysaat ingangscontrole toekomstige western blot analyse.

7.-Cap bindingstest

  1. Voor elk monster, overdracht 50 ul van de blanco agarose kraal controle slurry en 50 pl van het γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose C10-gebonden kralen suspensie 1,5 ml microcentrifugebuizen scheiden. Gebruik een schaar om de punt van de pipet verwijderen om de inning van de kraal slurry te vergemakkelijken.
  2. Pellet de korrels by centrifugeren van de suspensie bij 500 xg gedurende 30 sec.
  3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de kralen in 500 pl TBS.
  4. Herhaal stap 7.2 en 7.3. Pellet de korrels bij 500 xg gedurende 30 seconden en de bovenstaande vloeistof.
  5. Breng de supernatant dat het lysaat van stap 6,19 naar 1,5 ml microcentrifugebuis met de blanco agarose korrels.
    OPMERKING: De lege agarose korrels fungeren als een pre-clearing stap eiwitten van het lysaat dat niet-specifieke interactie met de parel te verwijderen.
  6. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C onder zacht schudden.
  7. Pellet de lege agarose korrels door centrifugeren bij 500 g gedurende 30 sec.
  8. Breng de lysaat aan de microcentrifugebuis van 1,5 ml dat de γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose-C10 gekoppelde korrels.
  9. Was de lege agarose korrels door resuspenderen de kralen in 500 ul lysisbuffer, pelletiseren de kralen door centrifugeren bij 500 g gedurende 30 sec en gooi de Supernatant. Herhaal dit vier keer voor een totaal van vijf wassingen.
  10. Resuspendeer de blanco agarose korrels in 1 x SDS-PAGE monsterbuffer en kook de kralen voor 90 seconden bij 95 ° C. Bewaar bij -20 ° C voor toekomstig western blot analyse zien of het gewenste eiwit bindt niet-specifiek aan de korrel.
  11. Incubeer het lysaat met γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose C10-gebonden kralen onder zacht schudden gedurende 1 uur bij 4 ° C-cap-bindende eiwitten te vangen.
  12. Pellet de γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose-C10 gekoppelde korrels door centrifugeren bij 500 g gedurende 30 sec. Verwijder het supernatant.
  13. Was de γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose-C10 verbonden kralen door het herhalen van stap 7.9.
  14. Resuspendeer de kralen in 600 pi lysisbuffer.
  15. GTP aan een eindconcentratie van 1 mM.
  16. Incubeer de γ-aminofenyl-m 7 GTP-agarose parels gekoppeld C10 + 1 mM GTP onder zacht schudden gedurende 1 uur bij 4 ° C. Opmerking: dezezal distantiëren eiwitten die niet-specifiek interactie met m 7 GTP (dat wil zeggen, ook interactie met niet-gemethyleerd GTP).
  17. Pellet de γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose-C10 gekoppelde korrels door centrifugeren bij 500 g gedurende 30 sec.
  18. Breng de supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg 200 ul van 4x SDS-PAGE monsterbuffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% broomfenol blauw en 10% glycerol). Bewaar het GTP controlemonster bij -20 ° C voor toekomstig western blot analyse 37. Was de kralen door het herhalen van stap 7.9.
  19. Resuspendeer de kralen in 1 x SDS-PAGE monsterbuffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% broomfenol blauw en 10% glycerol), en kookt bij 95 ° C gedurende 90 sec. Bewaar de m 7 GTP-gebonden fractie bij -20 ° C voor toekomstig western blot analyse 37.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse van Cap-bindend vermogen in reactie op Oxygen van eIF4E en eIF4E2 in een m 7 GTP Affinity Column

Figuren 1 en 2 geven western blots typische m 7 GTP affiniteitszuivering van twee zware cap-bindende eiwitten in reactie op zuurstof fluctuaties in twee menselijke cellijnen: primaire humane renale proximale tubulaire epitheelcellen (HRPTEC) in F igure 1 ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De analyse van cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan fysiologische zuurstofarme omstandigheden kunnen zorgen voor de identificatie van nieuwe zuurstof gereguleerde translatie initiatie factoren. De affiniteit van deze factoren de 5 'cap van mRNA of andere cap geassocieerde eiwitten kunnen worden gemeten door de kracht van hun associatie met m 7 GTP-gekoppelde agarose parels. Een nadeel van deze techniek is dat het meet de dop bindende eiwitten potentieel van post-lysis, maar het word...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Council of Canada en het Ontario Ministry of Research and Innovation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
γ-aminofenyl-m7GTP agarose C10-gekoppelde korrelsJena BioscienceAC-1555Agarose-gekoppelde m7GTP
100 mm kweekschaalCorning87722210-cm kweekschaal
150 mm kweekschaalThermofisher13018315 cm kweekschaal
AEBSF HydrochlorideACROS OrganicsA0356829AEBSF
Agarose korrelsJena Bioscience AC-0015Agarose korrel controle
Bromofenol BlauwFisherBP112-25Component van SDS-PAGE laadbuffer
1,5 ml CentrifugeerbuisjesFroggaBio1210-00SGebruikt om kleine volumes te centrifugeren
15 ml Kegelvormige CentrifugeerbuisjesFisher1495970CGebruikt bij het kweken van primaire cellen
Gedefinieerde trypsine-remmerFisherR007100DTI
DithiothreitolFisherBP172-25DTT
Epitheelcelmedium (compleet pakket)ScienCell4101Omvat serum en groeifactor supplementen)
GlycerolFisherBP229-1Component van SDS-PAGE laadbuffer
100 mM Guanosine 5'-trifosfaat, 1 mlJena Bioscience272076-0251MGTP
HCT116 colorectale carcinoomATCCCCL-247Menselijke kankercellijn
Menselijke renale proximale tubulaire epitheelcellenATCCPCS-400-010HRPTEC
Hyclone DMEM/Hoge GlucoseGE Life SciencesSH30022.01Standaard media voor menselijke celkweek
Hyclone Penicilline-Streptomycine oplossingGE Life SciencesSV30010Antibioticumcomponent van DMEM
H35 HypOxystationHypoxygenN/AHypoxie werkstation
Igepal CA-630MP Biomedicals2198596Detergentcomponent van lysis buffer
MonokaliumfosfaatFisherP288-500KH2PO4
KaliumchlorideFisherP217-500KCl
MagnesiumchlorideFisherM33-500MgCl2
NatriumchlorideFisherBP358-10NaCl
NatriumfluorideFisher5299-100NaF (fosfatase-remmer component van lysis buffer)
DinatriumfosfaatFisher5369-500Na2HPO4
Premium Grade Foetale RundserumSeradigm1500-500FBS
Protease Inhibitor Cocktail (100x)Cell Signalling58715Component van lysis buffer
NatriumdodecylsulfaatFisherBP166-100SDS
NatriumorthovanadateSigma56508Na3VO4
Tris BaseFisherBP152-5Component van buffers
0,05% Trypsine-EDTA (1x)Life Technologies2500-067Trypsine gebruikt om aderente cellen los te maken

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  3. Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
  4. Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
  5. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90(2015).
  6. Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
  7. Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
  8. Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
  9. Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
  10. Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
  11. Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
  12. Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
  13. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
  14. Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
  15. Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).
  16. Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
  17. Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
  18. Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
  19. Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
  20. Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
  21. Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
  22. Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
  23. Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
  24. Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
  25. Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
  26. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
  27. Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
  28. Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
  29. Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
  30. Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
  31. Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394(2002).
  32. Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
  33. Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
  34. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
  35. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
  36. Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
  39. Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
  40. Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
  41. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
  42. Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
  43. Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
  44. Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Oxygen RegulationHypoxia Workstationm7GTP Agarose BeadsAffinity PurificationWestern Blot AnalysisCell Lysis ProtocolTranslation Initiation FactorsGTP Wash Specificity

Gerelateerde artikelen