Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Productie en toediening van therapeutische mesenchymale stamcellen / Stromal Cell (MSC) sferoïden primer in 3-D Cultures Onder Xeno-free Voorwaarden

11.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55126

⸱

18 maart 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mary Hardin-Baylor, 2Department of Pediatrics, University of Texas Medical Branch, 3Multi-Organ Support Technology Task Area, U.S. Army Institute of Surgical Research, 4Internal Medicine, Texas A&M University Health Science Center

In dit artikel

Samenvatting

Het therapeutische potentieel van mesenchymale stam-/stromacellen (MSC's) is goed gedocumenteerd, maar de beste methode om de cellen voor patiënten voor te bereiden blijft controversieel. Hierin communiceren we protocollen om efficiënt therapeutische sferische aggregaten of 'sferoïden' van MSC's te genereren en toe te dienen, die onder xeno-vrije omstandigheden zijn voorbereid voor experimentele en klinische toepassingen.

Samenvatting

Mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) houdt een grote belofte in biotechnologie en regeneratieve geneeskunde. MSC's kunnen uit verschillende volwassen weefsels worden geïsoleerd door hun sterke hechting aan weefselkweek plastic en vervolgens verder uitgebreid in vitro, meestal via foetaal runderserum (FBS). Omdat FBS kunnen veroorzaken MSCs op immunogene worden, zijn aanwezigheid in MSC kweken beperkt zowel klinische en experimentele toepassingen van de cellen. Daarom is het in dienst hebben studies chemisch gedefinieerde xeno-vrij (XF) media voor MSC culturen zijn zeer waardevol. Vele gunstige effecten van MSC's zijn toegeschreven aan hun vermogen om ontsteking en immuniteit regelen, vooral door secretie van immunomodulerende factoren zoals tumor necrosis factor-gestimuleerde gen 6 (TSG6) en prostaglandine E2 (PGE2). Echter, MSC's moeten worden geactiveerd om deze factoren produceren en omdat het effect van MSCs dikwijls voorbijgaande, grote belangstelling ontstaan ​​om manieren pre-activering van de cellen prio ontdekkenr het gebruik ervan, zodat het niet langer de vertragingstijd voor activering in vivo. Hier presenteren we protocollen om efficiënt te activeren of prime MSC's in de driedimensionale (3D) culturen onder chemisch welbepaald XF voorwaarden en deze pre-geactiveerde MSC's in vivo toe te dienen. In het bijzonder, we eerst beschrijven methoden om sferische MSC micro-weefsels of 'bolletjes' in opknoping druppels gebruik XF medium te genereren en laten zien hoe de sferen en geconditioneerd medium (CM) voor verschillende toepassingen kunnen worden geoogst. Ten tweede, beschrijven we genexpressie schermen en in vitro functionele testen om snel het niveau van MSC activering in sferoïden beoordelen, met nadruk op de anti-inflammatoire en anti-kanker potentieel van de cellen. Ten derde, beschrijven we een nieuwe methode om intacte MSC sferoïden injecteren in de peritoneale holte muis in vivo testen. Over het geheel genomen de protocollen hierin te overwinnen grote uitdagingen van het verkrijgen van pre-geactiveerde MSC onder chemisch welbepaald XF convoorwaarden en een flexibel systeem MSC sferoïden administreren therapieën.

Inleiding

Mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) hebben laten zien een groot potentieel voor diverse regeneratieve geneeskunde benaderingen. MSCs werden aanvankelijk geïsoleerd als een stromale component van beenmerg maar zijn inmiddels verkregen zoveel andere volwassen weefsels, zoals vetweefsel 1, 2, 3. Interessant is dat de belangrijkste isolatiewerkwijze omarmt de opmerkelijke eigenschap van MSCs strak hechten aan weefselkweek kunststof in de aanwezigheid van foetaal runderserum (FBS). Hoewel dit traditionele isolatietechniek maakt gemakkelijke en snelle expansie van MSCs in tweedimensionale (2D) cultuur, is ook erg kunstmatige en voorbij betekenis van de natieve driedimensionale (3D) omgeving waarvoor eventueel verlies van belangrijke cellulaire elementen 4, 5 , 6. Daarom is de studie van MSCs in 3D culturen, diezijn meer fysiologische dan de traditionele 2D-culturen, is ontstaan ​​in de zoektocht naar "verloren / verminderd" MSC kenmerken. Bovendien heeft grote belangstelling gestegen tot xeno-vrij (XF) chemisch welbepaalde voorwaarden te identificeren voor MSC cultuur en activering, en zodoende de cellen meer vatbaar voor klinische toepassingen.

Veel studies zijn gepubliceerd waaruit de 3D cultuur van MSC's zowel in biomaterialen en als bolvormige aggregaten of sferoïden. MSCs in biomaterialen werden oorspronkelijk ontworpen voor weefselengineering om beschadigde weefsels te vervangen cel geplaatste steigers, terwijl sferoïde culturen van MSC's werden als manier om MSC gedrag in vivo na toediening van de cellen voor therapieën in preklinische of klinische proeven begrijpen 4, 5, 7. Interessant is dat MSC vorm bolletjes spontaan bij hechting aan weefselkweek plastic is niet toegestaan8, 9, 10. Traditioneel werd celaggregatie vergemakkelijkt door centrifugekolf methoden of vloeibare overlaytechnieken, die aanvankelijk zijn gebruikt in kankerbiologie bij pogingen om te proberen de tumor micro-omgeving nabootsen. Meer recent zijn andere methoden opgedoken die aantonen celaggregatie in kweekschalen vooraf gecoat met specifieke chemicaliën om cel-adhesie kunststof 4, 5, 6 voorkomen. Een van de eenvoudigste en goedkoopste methode MSC sferoïden te genereren is om ze in cultuur opknoping druppels, een techniek die vaak werd gebruikt om embryoiden organen uit embryonale stamcellen. Met opknoping druppel cultuur techniek wordt celhechting de weefselkweekkunststof voorkomen door suspenderen van de cellen in een medium druppel op de onderkant van een weefselkweekplaat deksel en waardoor zwaartekracht cel vergemakkelijken aggregatie in de top van de druppel. De sferoïde grootte kan gemakkelijk worden gemanipuleerd door het veranderen van de celconcentratie of druppelvolume, waardoor hangende druppel culturen bijzonder eenvoudig te bedienen.

Vroege studies op de 3D cultuur van MSC's aangetoond radicale verschillen in de eigenschappen van de cellen in 3D vergelijking met hun tegenhangers 2D 6, 8, 9. Tegelijkertijd, rapporten aangetoond dat de gunstige effecten van MSC's in vivo gesteund op hun vermogen om geactiveerd door micro-omgevingsfactoren en in reactie worden, produceren anti-inflammatoire en immunomodulerende factoren 11. Interessant, veel van deze factoren, zoals prostaglandine E2 (PGE2), tumornecrose-factor gestimuleerde gen 6 (TSG6) en hepatocyt groeifactor (HGF) werden geproduceerd in veel grotere hoeveelheden door MSC sferoïden dan traditionele 2D MSC weg vrijmaakt voor de idee vangebruiken 3D culturen naar cellen 8, 12, 13 te activeren. Bovendien genactivering in 3D culturen bleek mechanismen herhalen, ten minste gedeeltelijk, van celactivering na injectie in muizen 12. Door het activeren van MSCs vóór hun gebruik in experimenten kunnen effecten van de cellen verlengd en prominent als de traditionele MSC effect in vivo vaak vertraagd en voorbijgaand en kan worden omschreven als "hit and run". Gedurende de afgelopen jaren belangrijke onderbouwd met MSC sferoïden hebben aangetoond dat zij ontstekingsreacties kunnen onderdrukken en moduleren immuniteit in vivo door beïnvloeding effectorcellen zoals macrofagen, dendritische cellen, neutrofielen, en T-cellen die sferoïden een aantrekkelijke vorm van geprimede MSCs 2 , 3. Bovendien productie van anti-kanker moleculen, zoals interleukin-24 (IL-24) en tumor necrosis factor-gerelateerde apoptose inducerende ligand (TRAIL), zijn verhoogd bij 3D culturen van MSC's ten opzichte van MSC monolaag, een fenomeen dat kan worden benut voor gerichte kankertherapieën 8, 10, 14.

Aangezien de traditionele cultuur MSC vereist niet alleen het gebruik van weefselkweek plastic maar FBS, andere hindernis MSC sferoïden ontvankelijker te maken voor klinisch gebruik moesten worden overwonnen. Om deze hindernis te pakken, hebben we onlangs toonde vorming van MSC sferoïden onder specifieke omstandigheden chemisch gedefinieerde XF en vastgesteld dat de verkregen MSC sferoïden werden geactiveerd met dezelfde anti-inflammatoire en anti-kanker moleculen als sferoïden gegenereerd onder omstandigheden met FBS 14 produceren. Hier worden deze bevindingen in een aantal gedetailleerde protocollen die de generatie van de pre-geactiveerde MSC's te tonen in 3D culturen met behulp XFmedia. Daarnaast zijn protocollen geleverd dat manieren om het activeringsniveaus van de MSC's met betrekking tot hun ontstekingsremmende, immunomodulerende en anti-kanker effecten te evalueren, alsmede een praktische methode om de intacte bolletjes geven in muizen beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. MSC Isolatie en uitbreiding

  1. Verkrijgen vroege passage MSC's van Centrum voor de bereiding en verdeling van volwassen stamcellen ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) 15 als bevroren flesjes. Als alternatief, isoleren MSCs uit beenmerg zuigt na een routine-protocol 14 en op te slaan als bevroren flesjes.
  2. Bereid compleet cultuurmedium (CCM), die minimaal essentieel medium alfa (aMEM) gesupplementeerd met 15-20% premium selecteren FBS, 2 mM L-glutamine, en 1 x penicilline-streptomycine. Steriliseer het medium door filtratie.
  3. Breng 30 ml CCM in een 150 mm kweekschaal cellen en incubeer de schaal gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
  4. Incubeer de bevroren flacon ongeveer 10 6 MSCs gedurende 2 min in een 37 ° C waterbad.
  5. De inhoud van de ampul aan de kweekschaal met een 5 ml serologische pipet en was de cuvette enkele malen met 1-2 ml CCM van de schotel om achtergebleven cellen te vangen. Zet de schaal 's nachts in een geschikt incubator.
  6. Was de cultuur tweemaal met kamertemperatuur fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en maak de MSC's met 3 ml voorverwarmde / ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing van 0,25% trypsine. Detachment duurt meestal ongeveer 3-4 min in de incubator.
  7. Neutraliseer de trypsine in de schaal met 6 ml CCM voorverwarmd tot 37 ° C en breng de celsuspensie in een 50 ml conische buis. Combineer met wasbeurten PBS naar cel opbrengst te maximaliseren.
  8. Centrifugeer de cellen (450 x g) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en zuig de supernatant.
  9. Resuspendeer de cellen in een klein volume CCM en tel de levensvatbare cellen met een hemocytometer en trypan blauw.
  10. Zaad een geschikt aantal van 150 mm schalen bij 100 cellen / cm2 In 30 ml warm CCM en incubeer de culturen tot ongeveer 70-80% confluent, meestal 7 dagen met medium verandert elke 2-3 dagen en 24-48 uur voorafgaand aan het oogsten.
  11. Oogst de cellen zoals hierboven beschreven met trypsine / EDTA en combineren alle cellen in een conische buis met het geschikte medium. Centrifugeer opnieuw en resuspendeer de cellen in een klein volume van hetzelfde medium voor celtellingen. Gebruik standaard CCM (bevattende FBS) of diverse commercieel verkrijgbare XF mediumformuleringen, hier aangeduid als XF middellange-1 (XFM-1) en XF gemiddeld-2 (XFM-2), zowel met als zonder menselijke serumalbumine (HSA, 13 mg / ml) suppletie.

2. Voorbereiding van de geactiveerde MSC sferoïden in 3-D Opknoping Drop culturen onder XF Voorwaarden

  1. Om sferoïden van ongeveer 25.000 cellen te verdunnen geoogst MSC's in CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 mg / ml), XFM-2 of XFM-2 + HSA (13 mg / ml) en 714 cellen / ul.
  2. Pipetteer 35 ul / dalingen van de cellen opde onderkant van een omgekeerde kweekschaal deksel 150 mm. Meerdere druppels kunnen gemakkelijk worden gepipetteerd met behulp van een multichannel pipet.
    LET OP: Als groter of kleiner sferoïden gewenst zijn, verandert de cel concentratie of de daling van volume (25-45 pi) op ​​de juiste wijze.
  3. Transfer 20 ml PBS kamertemperatuur in de basis van de schotel en in een continue en constante beweging draai de deksel met de druppels, waardoor de druppel toppen naar beneden wijst. Plaats het deksel voorzichtig op de bodem van de kweekschaal.
  4. Breng het gerecht in de incubator voor 3 dagen zonder te storen passende sfeer montage mogelijk te maken.
  5. Na 72 uur, beginnen de bolvormige oogst door voorzichtig het deksel te verwijderen en om te klappen, zodat de druppels opnieuw bovenzijde bevinden.
  6. Hoek het deksel tot ongeveer 10-20 ° en duw de druppels, die de bolletjes, aan de plaat rand met behulp van een cel lifter.
  7. Breng de bollen en medium in een 15 ml conische buis met een 1.000 III pijptte. Gebruik kamertemperatuur PBS en de pipet met dezelfde tip om de plaat te wassen en te zorgen voor een maximale herstel van de bolletjes.
  8. Voor real-time PCR assays (protocol 3) Centrifugeer de bol suspensie bij 450 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuig de supernatant. Was de sferoïden met PBS en herhaal zowel de centrifugering en aspiratie stappen. Voor levering in dieren (protocol 8), laat bollen om zich te vestigen in de bodem van de buis (~ 3-4 min) zonder centrifugeren.

3. Realtime PCR of anti-inflammatoire en anti-kanker Markers

  1. Met de RNA extractie kit met homogenisator kolommen en RNase-vrije DNase set DNA-vrij totaal RNA uit monolaag MSC's (Protocol 1) en MSC sferoïden (protocol 2) die werden gewassen met PBS en gecentrifugeerd isoleren.
  2. Lyse tenminste 100.000 monolaag MSC en 20 sferoïden van elke conditie in afzonderlijke 15 ml conische buizen met RLT buffer die β-mercaptoethanol (1: 100).
  3. Transfer de lysaten grondig gemengd in 1,5 ml RNase-vrij buizen en plaats in een vriezer (-80 ° C) gedurende ten minste 3 uur te helpen bij bolvormige lysis.
  4. Ontdooi de lysaten op ijs, kort vortexen, en de instructies van de fabrikant voor RNA-isolatie met een algemeen verkrijgbare zoogdierlijke totale RNA isolatie kit.
  5. Kwantificeren en de kwaliteit van het geïsoleerde RNA met een spectrofotometer te bepalen.
  6. Met de hoge capaciteit cDNA Reverse Transcription Kit of gelijkwaardig volgens de instructies van de fabrikant om cDNA te genereren van real-time PCR.
  7. Plaats cDNA monsters, commercieel gemaakt real-time PCR-primers / probes (Gene Expression Assays) en PCR Master Mix op ijs. Gebruik primers / probes voor GAPDH (controle), PTGS2 (COX-2, anti-inflammatoire), TNFAIP6 (TSG6, ontstekingsremmend), TRAIL (anti-kanker), en IL-24 (anti-kanker).
  8. Bereid de real-time PCR reacties volgens de instructies van de fabrikant Gene Expression Assays en Fast Universal Master Mix.
  9. Volg de richtlijnen voor de real-time PCR-instrument voor het genereren van het experiment documenten en het uitvoeren van de vlucht.
  10. Analyseer de gegevens met de ΔΔC T-werkwijze door de relatieve veranderingen (belangrijkheid, RQ) in genexpressie via GAPDH als endogene controle en monolaag MSCs als basis 8, 14.

4. Het verzamelen van CM voor Testen van Immuunmodulerende en anti-kanker Potentiële

  1. Oogst de sferoïden en CM zoals hierboven beschreven in een 15 ml conische buis, met behulp van een cel lifter en een pipet, maar zonder de schotel deksels niet wassen met PBS omdat dit de CM verdunt.
  2. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, zorgvuldig verzamelen celvrije supernatant met een pipet, en breng het supernatans in 1,5 ml buizen.
  3. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur, zorgvuldig verzamelen clarified CM met een pipet, en breng de CM in nieuwe 1,5 ml buizen voor opslag in een vriezer (-80 ° C). Aliquots van de CM vóór het invriezen als deze voor meerdere assays.
    Opmerking: alvorens met de stroomafwaartse testen, PGE2 concentratie, een goede indicatie van anti-inflammatoire potentieel van CM, kan worden bepaald met een commerciële ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant. TSG6 concentratie kan worden bepaald onder toepassing van een gepubliceerde protocol 14.

5. macrofagen Assay aan de anti-inflammatoire potentieel van MSC-CM Assess

  1. Bereid macrofaag medium bestaande uit Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met L-alanyl-L-glutamine en aangevuld met 10% FBS premium selecteren en 1 x penicilline-streptomycine. Filter-steriliseren van het medium.
  2. Het verkrijgen van een bevroren flesje van ongeveer 10 6 J774 muis macrofagen en incubeer het flesje gedurende 2 minuten in een 37 ° C waterbad.
  3. De inhoud van de ampul in een 15 ml conische buis, voeg 9 ml macrofagen medium en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200-300 xg bij kamertemperatuur.
  4. Zuig het supernatant, schorten de macrofagen in 1 ml macrofaag medium, en de overdracht van de macrofagen in een 150 mm petrischaaltje met 30 ml van macrofagen medium.
  5. Verander het medium elke 2 dagen en incubeer de cellen in de incubator tot ongeveer 70-80% confluent.
    LET OP: De macrofagen niet strak houden aan de petrischaal, dus zorg mag niet worden genomen om cellen te verliezen met een gemiddelde verandering.
  6. Oogst de macrofagen door sproeien de macrofaag medium op de cellen met een pipet. Breng de cellen in een 50 ml conische buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200-300 xg en kamertemperatuur.
  7. Zuig het supernatant en suspendeer de cellen in een kleine hoeveelheid macrofaag medium voor celtellingen met een hemocytometer. Stel de concentratie tot 200.000 cellen / ml met macrofaag meDIUM.
  8. Om te beginnen met de set-up voor de macrofaag-test, voeg 480 ul van macrofagen medium in putjes van een 12-well plaat.
  9. Voeg 20 ul van macrofagen medium in niet-gestimuleerde controleputjes toegevoegd en 20 pl niet-geconditioneerde of MSC-geconditioneerd medium, hierboven bereid, in experimentele putjes. Meng het medium in de putjes van de plaat te tikken.
  10. Transfer 500 pi van de celsuspensie macrofaag de niet-gestimuleerde macrofaag controleputjes.
  11. Stimuleren van de resterende macrofagen onder toevoeging van 1: 500-1: 1000 van 0,1 mg / ml lipopolysaccharide (LPS) en incubeer 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
  12. Transfer 500 ul van de gestimuleerde macrofagen in de putjes met niet-voorziene of MSC-geconditioneerd medium. Meng de putten door gestaag meerdere malen het schommelen van de plaat.
  13. Breng de plaat naar een incubator voor 16-18 uur.
  14. Oogst de macrofaag geconditioneerde medium en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  15. Overdrachtde supernatant naar nieuwe buizen en analyse voor tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) en interleukine-10 (IL-10) bevat commerciële ELISA-kits volgens de instructies van de fabrikant.

6. splenocyten Assay aan de Immuunmodulerende potentieel van Sferoïde-CM Assess

  1. Bereid splenocyten compleet medium, bestaande uit Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd FBS, 1 x penicilline-streptomycine, en 2-mercaptoethanol. Filter-steriliseren van het medium.
  2. Oogst de milt van euthanized mannelijke BALB / c-muizen door een incisie opgesteld aan de linkerzijde van de buik via milt, ongeveer halverwege tussen de voor- en achterpoten 14. Breng de milt een 70 um cel zeef om de splenocyten 14 isoleren.
  3. Isoleer de splenocyten / lymfocyten door op de milt door de 70 urn zeef in een steriele petrischaal using het zachte rubber / plastic uiteinde van een zuiger van een 2-3 ml spuit 14. Gebruik een knarsend cirkelvormige beweging naar de milt distantiëren.
  4. Was de zeef cel enkele malen met koud PBS en cellen brengen van de petrischaal in een 50 ml conische buis. De buis met koude PBS en gecentrifugeerd (500 xg) bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
  5. Zuig het supernatant en duidelijk de cellen van erytrocyten door incubatie met 5-10 ml rode bloedcellen lysis oplossing (per milt) gedurende 5-10 min.
  6. Stop de lysis door het toevoegen van koud PBS aan de buis en centrifugeer gedurende 5-10 minuten bij 500 xg en 4 ° C.
  7. Hang de geïsoleerde cellen in volledige splenocyten medium, filteren door middel van een 40 pm zeef, en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Voeg splenocyten medium aan de celsuspensie tot een uiteindelijke celconcentratie van 10 6 cellen / ml bereiken
    LET OP: Deze techniek meestal levert ongeveer 3 x 10 7 splenocyten per muis milt.
  8. Stimuleer het juiste aantal splenocyten met 2 ug / ml anti-CD3e antilichaam gedurende 5 min.
    OPMERKING: De hoeveelheid splenocyten vereist afhankelijk van het aantal experimentele condities zoals bepaald door de onderzoeker (zie stap 6,9). Voor elke experimentele monster / goed, 10 6 splenocyten zijn vereist.
  9. Transfer 10 6 splenocyten (gestimuleerde of niet-gestimuleerde) in putjes van een 12-well plaat en voeg niet-geconditioneerde (controles) of MSC-CM in putjes uiteindelijke verdunning van 1: 10-1: 20.
  10. Oogst de splenocyten CM na 24 uur en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  11. Breng de bovenstaande in nieuwe buizen en analyse voor interferon gamma (IFN-γ) bevat commerciële ELISA kit volgens de instructies van de fabrikant.

7. Prostate Cancer Assay aan de anti-kanker potentieel van Sferoïde-CM Assess

  1. Bereid volledig RPMI groeimedium dat RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS, 1 x penicilline-streptomycine.
  2. Het verkrijgen van een bevroren flesje LNCaP prostaatkankercellen en incubeer het flesje gedurende 2 minuten in een 37 ° C waterbad.
  3. De inhoud van het flesje in een kweekschaal met 30 ml compleet RPMI groeimedium met een gemotoriseerde pipet en een 5 ml serologische pipet. Was de flacon meerdere malen met het medium van de schaal en zet de schaal in de incubator.
  4. Vlak voor de cellen confluentie bereiken, was de cultuur tweemaal met PBS kamertemperatuur en verwijder de LNCaP cellen met 3 ml voorverwarmde 0,25% trypsine / EDTA-oplossing.
  5. Neutraliseren van de trypsine in de schaal met de volledige RPMI groeimedium en de overdracht van de cellen samen met wast in een 50 ml conische buis.
  6. Centrifugeer de cellen bij 450 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur en zuig de supernatant.
  7. Resuspendeer de cellen in kleine volume van de volledige RPMI groeimedium en tel de kankercellen met behulp van een hemocytometer.
  8. Overdracht LNCaP cellen in een 96-putjes bij 5000 cellen / putje in 120 ul volledig RPMI groeimedium dat 25% van de niet-geconditioneerde of sferoïde-CM. Incubeer in de incubator gedurende 72 uur.
  9. Een celgroei assay gebruik van een celproliferatie assay kit voeren, zuig het medium uit de putjes en breng de plaat in een vriezer (-80 ° C) gedurende ten minste 3 uur.
    1. Ontdooi de plaat en lyseren de cellen in elk putje door het toevoegen van 100 ui lysis reagens dat 180 mM NaCl, 1 mM EDTA en 0,2 mg / ml RNase A.
    2. Een standaardcurve lyse bekende hoeveelheden LNCaP cellen zoals hierboven beschreven.
    3. Na 1 uur, voeg 100 gl van 1x cellysis buffer die 1: 100 verdunning van celproliferatie assay reagens en meet de fluorescentie in elk putje om de cellen tarief vast.

8. Intraperitoneale Levering van Intact sferoïden

  1. Bereid spheroïde MSC's zoals hierboven (protocol 2) en resuspendeer t beschrevenHij bollen in steriele Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), aangevuld met 0,2-0,5% HSA aan XF omstandigheden te handhaven. HSA in de oplossing maakt bol hechting aan kunststof bij injectie te voorkomen.
  2. Transfer 40-120 sferoïden in 15 ml conische buizen en was de cellen door toevoeging van 6 ml HBSS / HSA aan de buizen. Laat 3-4 min voor sferen af ​​te dalen. Bereid een onafhankelijke conische buis van sferoïden per dier. Ook bereiden extra buizen van sferoïden voor assays bepalen van sferoïde retentie (zie 8.18 hieronder) en de productie van therapeutische factoren na de overdracht (zie 8.19 hieronder) indien gewenst.
  3. Zuig het supernatant, bedekken de sferoïden 100-200 uit steriel HBSS aangevuld met 0,2-0,5% HSA en plaats de buizen op ijs.
  4. Kort verdoven van de dieren met 2% isofluraan in 100% zuurstof tot het verdwijnen van pinch-teen reflex ongeveer 2 min in de inductie kamer.
  5. Plaats het dier in de BSL-2 kabinet, dorsale aspect omlaag (ventrale zijde naar boven), met de continue stroom van 1,5% isofluraan / zuurstof mengsel via een neuskegel.
  6. Maak de onderste muis achterlijf met een antiseptisch middel, zoals 70% alcohol.
  7. Verwijder de dop van de 20 G intraveneuze (IV) katheter en het uitvoeren van de intraperitoneale injectie met de katheter-stiletto montage. Met één hand de muis huid wordt geplaatst en een andere voor de injectie uit te voeren. Zoek het punt van injectie ongeveer in het midden van een kunstmatige lijn tussen een gebogen kniegewricht en genitale gebied met de naald wijst naar de middellijn.
    LET OP: De katheter-stiletto samenstel heeft een hogere weerstand dan een gewone naald, dus zorg moet worden genomen als niet om de naald te diep injecteren in de buik, wat kan leiden tot letsel aan interne organen. Penetratie van de huid en spieren / peritoneale membraan kan worden gevoeld tijdens katheter.
  8. Verwijder voorzichtig de metalen stiletto / naald uit de katheter-stiletto montage. check de stiletto voor bloed, urine en ontlasting en gooi deze weg. Bloed op de naald wijst punctie van de interne organen (s).
  9. Houd de plastic katheter in de verticale positie staat de injecties om fluïdumstroom toe te staan.
  10. Bevestig de juiste plaatsing van de plastic katheter door injectie van ongeveer 100 gl steriel HBSS / HSA door de katheter met een pipet met een 100-200 pi tip. Het uiteinde van de pipetpunt in de katheter spuitadapter vormen van een afdichting. Injecteer langzaam de vloeistof in de peritoneale holte.
    OPMERKING: De vloeistof in een juiste positie katheter stroomt vrij in de peritoneale holte met slechts kleine aanpassing van de katheter. Onjuiste plaatsing van de katheter (subcutaan of intra-intestinale of wanneer de punt van de naald gewonden peritoneale organen zoals nieren) weerstand zal toenemen en stroom verminderen. Subcutane plaatsing resulteert in een vorming van een duidelijke "bubble" onder de huid.
  11. Verzamel tHij msc sferoïden, bereid in 100-200 ui HBSS / HSA (stap 8,3), met een 200 ul pipetpunt en dragen het gehele volume van bollen (40-120 bolletjes) in de buikholte door de katheter zoals hierboven beschreven.
  12. Was de buis met bollen met 100 pi HBSS / HSA met dezelfde tip als hierboven om eventuele sferoïden verzamelen en injecteren in de peritoneale holte.
  13. (Optioneel) Injecteer nog eens 100 ui HBSS / HSA in de peritoneale holte van de katheter te wassen.
  14. Plaats het gaasje gedrenkt in antiseptische over de katheter en langzaam verwijderen van de katheter uit de buikholte en gooi deze weg.
  15. Zachtjes masseren van de buikholte met de vingers om een ​​gelijkmatige verdeling van de sferoïden te waarborgen.
  16. Laat het dier te herstellen onder streng toezicht en kijk voor bloeden uit de injectieplaats.
  17. Inspecteer de katheter en 15 ml buis gedurende de resterende sferoïden. Het is normaal om een ​​paar gebieden in het observerenkatheter / buis.
    OPMERKING: De techniek beschreven MSC sferoïde levering kan voor normale dieren of in verschillende modellen schade vastgesteld. Deze techniek is met succes gebruikt om sferoïden bij muizen cornealetsel en endotoxemie modellen injecteren, en in een zymosan-geïnduceerde peritonitis model 8.
  18. Om het aantal van ingehouden sferoïden (optioneel) te kwantificeren, maken gebruik van een DNA-gebaseerde mobiele nummer kwantificering kit / reagens. Houd de gebruikte katheter via 15 ml buisje en heftig afgeven HBSS / HSA door de katheter om alle resterende gebieden terug in de 15 ml buis dwingen.
    1. Centrifugeer de 15 ml buis bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuig de supernatant. Breng de buis met het bolvormige pellet in een vriezer (-80 ° C) gedurende ten minste 3 uur.
    2. Ontdooi de buis en lyseren de sferen door toevoeging van 500 pl cellysis reagens dat 180 mM NaCl, 1 mM EDTA en 0,2 mg / ml RNase A.
    3. Voor een controle, freeze lyse en een bekende hoeveelheid sferoïden (bij voorkeur gelijk aan het aantal sferoïden voorbereid voor een enkele injectie) zoals hierboven beschreven.
    4. Na 1 uur werd 100 ul overdracht van het cellysaat, in duplo, in een 96-well microplaat toevoegen aan elk putje 100 pl 1x cellysis buffer met een 1:50 verdunning van celproliferatie assay reagens uit de set. Na 10 min, het meten van de fluorescentie van elk putje van het aantal sferen die niet geïnjecteerd door vergelijking van de experimentele monster (s) met het controle monster.
  19. Evalueer de activering niveau van sferoïden bereid voor injectie (optioneel) door het meten van de concentratie van PGE2 en TSG6 geproduceerd door overgedragen bollen. Overdracht 40-120 bollen door de katheter, zoals hierboven beschreven, in een 12-well of 6-putjes bevattende 1 of 2 ml aMEM gesupplementeerd met 2% FBS en 1 x penicilline / streptomycine. Plaats de platen in de incubator gedurende 6 uur.
    1. Transfer het mediumde putjes na 6 uur in 1,5 of 15 ml en centrifugeer de buizen bij 450 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Breng de celvrije supernatant aan verse 1,5 ml buisjes met een pipet en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Breng de geklaarde CM (supernatant) in nieuwe 1,5 ml buisjes en bepaling voor PGE2 concentratie (betekenis zijn anti-inflammatoire potentieel van CM) met een commerciële ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant. TSG6 concentratie kan worden bepaald onder toepassing van een gepubliceerde protocol 14.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In het huidige werk, waren opknoping druppel culturen gebruikt om compacte sferische micro-weefsels of 'bolletjes' geactiveerde MSC onder XF omstandigheden te genereren. Het onderzoek routekaart in figuur 1 toont dat MSCs worden aangemoedigd om zelfassemblage tot sferoïden bij suspensie in opknoping druppels gedurende 72 uur, waarna de sferoïden, of CM geladen met bol afgeleide therapeutische factoren, kan worden verzameld en mogelijk gebruikt in beide onderzoek ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De optimale MSC voor gebruik in sommige onderzoek en klinische toepassingen moet sterk worden geactiveerd om hun voordeel te maximaliseren, en bij voorkeur opgesteld onder chemisch gedefinieerde XF voorwaarden voor de afgifte van potentiële antigenen van xenogene mediumbestanddelen zoals FBS minimaliseren. In de hier beschreven protocollen hebben we aangetoond methoden 1) activeren MSCs in 3D cultuur door de vorming van sferoïden, 2) bereiken de 3D activatie van MSCs onder omstandigheden XF, 3) hoe de activering niveaus...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door grant P40RR17447 van het National Institute of Health en award RP150637 van het Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We willen Dr. Darwin J. Prockop bedanken voor zijn steun aan het project.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MEM-α (minimal essential medium alpha)ThermoFisher/Gibco12561049; 12561056; 12561072minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium selectAtlanta BiologicalsS11595; S11510; S11550; S11595-24component van complete kweekmedia voor alle soorten cellen
L-glutamineThermoFisher/Gibco25030081; 25030149; 25030164component van complete kweekmedia voor alle soorten cellen
Penicillin/StreptomycinThermoFisher/Gibco15070063component van complete kweekmedia voor alle soorten cellen
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membraneMilliporeSigmaSCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11REmedia sterilisatie
150 mm cell culture dishNuncD8554 SIGMAcelkweek
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubatorThermo FisherModel 3110incubatie van gekweekte cellen
Early passage MCSsCenter for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & WhiteNAvoorbereiding van 2D en 3D culturen van MSCs
water bathVWR89501-468media verwarmen tot 37 °C
PipettesEppendorf492000904manuele vloeistofverwerking
Pipete-AidDrummond Scientific Company4-000-300hantering van serologische pipetten
Costar steriele serologische pipet (5, 10, 25 en 50 ml)Corning4487; 4101; 4251; 4490vloeistofverwerking
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4ThermoFisher/Gibco10010023; 10010072; 10010031; 10010049celkweekverwerking
0.25% trypsin/EDTA solutionThermoFisher/Gibco25200056; 25200072; 25200114adherente cellen opnemen en celaggregaten verspreiden
15 ml conische buisCorning/BD Falcon352097celcentrifugeren
50 ml conische buisCorning/BD Falcon352098celcentrifugeren
Eppendor gekoelde centrifugeEppendorf/Fisher ScientificModel 5810Rcelcentrifugeren
hemocytometerFisher Scientific26716celtelling
trypan blauwSigma-AldrichT8154 SIGMAuitsluiting van dode cellen tijdens celtelling in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)ThermoFisher/GibcoA1067501Xeno-vrij media specifiek geformuleerd voor de groei en expansie van menselijke mesenchymatische stamcellen
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)Stem Cell Technologies5420Gedefinieerd, xeno-vrij medium voor menselijke mesenchymatische stamcellen
HSA (Human serum albumin)Gemini800-120Component van xeno-vrij MSC-medium
rHSA (recombinant Human serum albumin)Sigma-AldrichA9731 SIGMAComponent van xeno-vrij MSC-medium
Total RNA isolation Mini KitQiagen74104Totale RNA extractie
QiashredderQiagen79654Sample homogenisatie voorafgaand aan totale RNA extractie
RNAse-free DNase Set Qiagen79254On-column DNA eliminatie tijdens totale RNA extractie
β-mercaptoethanol Sigma-AldrichM6250 ALDRICHremming van RNAsen in RLT-buffer
VortexVWR97043-562meng monster
SpectrofotometerBioradNARNA concentratie en kwaliteit
High capacity cDNA Reverse Transcription KitThermoFisher/Applied Biosystems4368814transcriptie van totaal RNA in cDNA
Gene Expression AssaysThermoFisher/Applied Biosystemsvarieerdprimer/probe combinatie voor real-time PCR
Fast Universal PCR Master MixThermoFisher/Applied Biosystems4352042; 4364103; 4366073; 4367846master mix voor real-time PCR reactie
Real-time PCR systeem (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)ABI PrizmNAreal-time PCR
1.5 ml centrifugebuisEppendorf22364111celcentrifugeren, monsterverzameling en opslag
(-80 °C) vriezerThermo FisherModel Thermo Forma 8695monsteropslag
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA KitR&D SystemsKGE004Bschatting van cytokineconcentratie in het monster
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)ThermoFisher/Gibco10566-016; 10566-024;10566-032macrofaagkweekmedium
J774 muismacrofagenATCCTIB-67muismacrofaagcellijn
12-well plateCorning3513in vitro macrofaagstimulatie
LPS (lipopolysaccharide)Sigma-aldrichL4130in vitro macrofaagstimulatie
Mouse TNF-a ELISA kitR&D SystemsMTA00Bschatting van cytokineconcentratie in het monster
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kitR&D SystemsM1000Bschatting van cytokineconcentratie in het monster
RPMI-1640 mediumThermoFisher/Gibco11875-085spleencel kweekmedium
BALB/c muizenThe Jackson Laboratory651in vivo spheroid levering; spleencel bereiding
Anti-Mouse CD3e Functional Grade PurifiedeBioscience145-2C11

Referenties

  1. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  2. English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560(2013).
  3. Le Blanc, K., Mougiakakos, D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).
  4. Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).
  5. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 9176357(2016).
  6. Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).
  7. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).
  8. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  9. Potapova, I. A., et al. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  10. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  11. Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
  12. Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1). Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).
  13. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype. Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).
  14. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions. Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).
  15. Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White. , http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html (2016).
  16. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  17. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  18. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  19. Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells' Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).
  20. Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).
  21. Prockop, D. J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).
  22. Krampera, M. Mesenchymal stromal cell 'licensing': a multistep process. Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).
  23. Saleh, F. A., Genever, P. G. Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution? Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).
  24. Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
  25. Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  26. Lee, E. J., et al. Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction. Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Mesenchymale stamcellenhanging drop techniekoogsten van geconditioneerd mediumintraperitoneale injectiegenexpressiescreeningontstekingsremmende factorenPGE2 assayTSG6 expressie
Productie en toediening van therapeutische mesenchymale stamcellen / Stromal Cell (MSC) sferoïden primer in 3-D Cultures Onder Xeno-free Voorwaarden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.