Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult Drosophila Brains

Samenvatting

De volwassen Drosophila hersenen waardevol voor de studie van neuronale circuits, hogere hersenfuncties, en complexe aandoeningen. Een efficiënte methode om hele hersenweefsel van de kleine vlieg hoofd ontleden zal brain-based studies vergemakkelijken. Hier beschrijven we een eenvoudige, een-stap dissectie protocol van volwassen hersenen met goed bewaard gebleven morfologie.

Samenvatting

Er is een toenemende belangstelling voor het gebruik Drosophila tot menselijke hersenen degeneratieve ziekten te modelleren, kaart neuronale circuits in volwassen hersenen, en de studie van de moleculaire en cellulaire basis van de hogere hersenfuncties. Een hele-mount voorbereiding van de volwassen hersenen met goed bewaarde morfologie is van cruciaal belang voor een dergelijke hersenen als geheel op basis van studies, maar kan technisch uitdagende en tijdrovend zijn. Dit protocol beschrijft een eenvoudig te leren, een stap dissectie aanpak van een volwassen vliegen kop in minder dan 10 s, terwijl de intacte hersenen aan de rest van het lichaam om verdere verwerkingsstappen vergemakkelijkt. De procedure helpt bij het verwijderen van de meeste oog en tracheale weefsels die normaal zijn voor de hersenen die kunnen interfereren met de latere beeldvormingsstap en plaatst ook minder eisen aan de kwaliteit van het ontleden tang. Daarnaast beschrijven we een eenvoudige methode die gemakkelijk omkeren van de gemonteerde hersenmonsters maakt op een dekglaasje, wat belangrijk is voor het afbeelden van beide zijden van de bregens met gelijke signaalintensiteit en kwaliteit. Als voorbeeld van het protocol, een analyse van dopaminerge (DA) neuronen presenteren we volwassen hersenen van WT (w ¹¹¹⁸⁾ vliegt. De hoge werkzaamheid van de dissectie methode maakt het bijzonder nuttig voor grootschalige volwassen hersenen-gebaseerde studies in Drosophila.

Inleiding

De modelorganisme Drosophila, algemeen bekend als de fruitvlieg, is al lange tijd gewaardeerd om zijn elegante genetische instrumenten, korte reproductieve keer, en sterk geconserveerd moleculaire en cellulaire routes. De fruitvlieg is met succes toegepast om fundamentele signaalwegen, welke patroonvormende mechanismen van meercellige organismen, en de onderliggende mechanismen van neuronale ontwikkeling, functies en ziekten ^1,2 ontleden. Met recente ontwikkelingen in cel labeling en beeldvormende technieken, heeft Fruitvlieghersenen bijzonder krachtig in fine mapping van neuronale circuits en het ontleden van de moleculaire en cellulaire basis van hogere hersenfuncties, zoals leren en geheugen, en circadiane ritme ^{1,3 worden, 4,5,6,7,8.}

Een bijzonder voordeel van de Drosophila systeem is de relatief kleine omvang, waardoor whole-mount voorbereiding en onderzoek van de hersenen met behulp van een gewone verbinding of confocale microscoop. This functie maakt gedetailleerde anatomische en functionele analyse van neuronale circuits, wellicht slechts één neuron op cellulaire en subcellulaire niveaus, in de context van een hele hersenweefsel, waardoor zowel een holistische kijk op het onderzochte subject en de precieze geometrie in de hele hersenen. Echter, gezien de nogal miniatuur grootte van de hersenen, het presenteert ook een technische uitdaging in een intacte hersenweefsel efficiënt te ontleden uit de beschermende exoskelet hoofd geval in een volwassen vlieg. Verschillende effectieve en relatief eenvoudige dissectie werkwijzen zijn beschreven, die meestal betrekking voorzichtig en stapsgewijze verwijdering van de kop zaak en de omliggende weefsels zoals de ogen, de luchtpijp en vet van de hersenen juiste ^{9, 10.} Deze microchirurgische dissectie methoden plaats vaak nogal strenge eisen aan de kwaliteit van de dissectie pincet, met een beroep op de tang met fijne goed uitgelijnd tips die gemakkelijk kunnen worden beschadigd. Bovendien, zoals de hersenen ontleed zijn vaak separated van de rest van het lichaam, kan de hersenen gemakkelijk verloren tijdens de daaropvolgende kleuring en wasprocessen vanwege hun kleine afmetingen en de transparantie bij de verwerking buffer. Hier beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige en makkelijk te leren, éénfasige dissectie protocol voor volwassen hersenen die de hersenen ontleed aan de romp blijft. De dissectie proces is vaak gemakkelijk ruimt meeste van de hersenen weefsels zoals het oog en trachea en vermindert de vraag naar goede kwaliteit dissectie pincet.

Bovendien, bij beeldvorming van de hersenen onder de fluorescerende verbinding microscoop of confocale microscoop, de kant van de hersenen dat is verwijderd van de fluorescerende lichtbron levert vaak een zwakker signaal en minder heldere beelden doordat de dikte van de hele-mount hersenen. We beschrijven ook een eenvoudige montage methode die eenvoudig omkeren van de hersenmonsters toelaat, waardoor gemakkelijke beeldvorming aan beide zijden van de hersenen met gelijke signaal intensity en kwaliteit.

Als een proof-of-concept voor de toepassing van deze methode om de volwassen hersenen te bestuderen, we verder onderzocht op de aanwezigheid van DA neuronen in de hersenen van w ¹¹¹⁸ vliegt; een genotype dat vaak wordt gebruikt als ouderlijn voor transgene vliegen en wildtype controle in vele studies Drosophila.

Protocol

1. Oplossingen Gebruikt voor Brain Dissection en immunofluorescentiekleuring

1. Ontleden de volwassen hersenen vliegen kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF): 119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO _3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH _{2PO 4,} 1,3 mM _MgCl2 en 10 mM glucose. Voor gebruik gas de aCSF met _5% CO2 / 95% _O2 gedurende 10 - 15 min en piek met 2,5 mM _CaCl2. Steriliseer de aCSF oplossing door filtreren door een 0,22 urn membraanfilter.
   Opmerking: WINKEL aCSF bij 4 ° C om bacteriële contaminatie te voorkomen. hersenen vlieg kan worden ontleed in een fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing, hoewel Vergelijk de effecten van de twee oplossingen dissectie van de uiteindelijke beeldkwaliteit van de ontleed hersenen werden niet uitgevoerd.
2. Met 4% paraformaldehyde (PFA) bereid in 1x PBS als fixatief, die normaal in hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C.
   caution: PFA is giftig en bijtend en moet met zorg worden behandeld.
3. Gebruik 1x PBS om de PFA spoelen van de hersenen en na de laatste wasstap in de immunofluorescentie kleuring van de hersenen ontleed. Bereid de 1x PBS van PBS 10x voorraad-oplossing (1,37 M NaCl, 27 mM KCI, 100 mM Na ₂ HPO ₄ en 18 mm KH ₂ PO _4).
4. Met 0,3% Tween-20 in 1x PBS (1x PBT) voor alle volgende wasstappen tijdens immunofluorescentie kleuring van de hersenen ontleed.

2. Microchirurgie Dissectie van Adult Fly Heads

Opmerking: De dissectie procedure is geïllustreerd in figuur 1.

1. Verdoven de volwassen vliegen met CO _2. Met behulp van een tang, pick-up een vlieg en kort Dewax haar cuticula door dompelen in 70% ethanol gedurende 3-5 s. Dit zorgt ervoor dat er geen luchtbellen vast te houden aan de vlieg cuticula bij onderdompeling in de aCSF of 1X PBS dissectie oplossing.
2. Onder eenontleden microscoop met een lichtbron onder een hoek die niet zal worden geblokkeerd door de handen, stelt het objectief om een ​​duidelijk beeld van de vlieg (1,2X vergroting) te bereiken. Tang met de niet-dominante hand om het dier te immobiliseren en dompel de vliegen in de koude dissectie oplossing zijn buik naar boven, zoals weergegeven in figuur 1A.
3. Houd de tang op 160-170 ° hoek ten opzichte van de dissectie plaat, onder uitoefening van een kleine kracht op de buik van de vlieg (getoond als pijlen in Figuur 1A). Deze stap zal de vlieg immobiliseren en dwingen om het hoofd naar achteren te verplaatsen met 15 - 25 °, terwijl de uitbreiding van de slurf omhoog. In het proces, een zacht en doorschijnend gebied van de cuticula, onder de zuigorganen, moet blijken. Verhoog de vergroting en stel de focal plane op deze regio.
   Let op: Laat de tang niet te strak te houden, maar liever gewoon stevig genoeg te stabiliserende vlieg. Te veel kracht zorgt ervoor dat de binnenste organen scheuren in de oplossing.
4. Gebruik de dominante hand de tang ontleden zodat de uiteinden gesloten zijn, waarbij een milde weerstandskracht op de uiteinden van de tang genereren drukken, zodat de tang springt open wanneer de druk van de vasthoudende hand wordt losgelaten. Plaats de tang loodrecht op de tang met de vlieg, zie figuur 1B.
   1. Pierce de gesloten uiteinden van de dissectie forceps door het zachte en doorschijnende gebied van de cuticula onder de zuigorganen, zoals blijkt uit de rode pijl in figuur 1B. Het is belangrijk om niet te vergeten de tang te diep dat het de hersenen raakt dringen. De hersenen juiste moet zichtbaar worden. Zorg voor een stabiele greep van de vlieg met de nondominant de hand.
5. Snel maar gestaag, laat de uiteinden van de dissectie pincet door zijn eigen kracht en vertrouwen op het momentum van deze release om weg te scheuren tHij exoskelet rondom de vlieg hoofd. Een intactehersenen goede moet zichtbaar (wit weefsel onmiddellijk boven het uiteinde van de onderste tang in figuur 1C) Volg een denkbeeldige lijn om de dynamiek van de vrijgemaakte pincet tips (geïllustreerd als de uitwendige rode pijlen getoond in figuur 1C) te geleiden. Dit verwijder het exoskelet en de meeste van de hersenen geassocieerde ogen en luchtpijp uit de hersenen. De juiste timing en de kracht die wordt uitgeoefend om te openen het exoskelet zal afhankelijk zijn van de ervaring van de onderzoeker zijn.
   Let op: Dit is de meest kritische fase tijdens de dissectie. Het is belangrijk om te vertrouwen op de natuurlijke kracht gegenereerd door de dynamiek van de opening tang om het exoskelet te verwijderen terwijl de blootgestelde hersenen blijft bevestigd aan de rest van het lichaam.
6. Gebruik de tang in de dominante hand om verwijder voorzichtig het overblijfsel accessoire weefsels, zoals de tracheale dat verschijnt als witte fiber structuren remaining aan de hersenen. Wees voorzichtig niet te trekken of beschadiging van de hersenen juiste.

3. immunofluorescentiekleuring van de Brains

1. Bevestig de ontleedde hersenstalen met bijbehorende torso in ongeveer 1 ml 4% PFA gedurende 40 - 60 min.
   Opmerking: Bij deze en volgende stappen houdt de buizen of platen met monsters op een nutator om de monsters te mengen goed in de oplossing.
2. Spoelen met 1 mL 1 x PBS door pipetteren de oplossing en neer 3 keer. Wees niet naar de hersenen weg te zuigen.
3. Was 5 keer met 1x PBT gedurende 5 minuten elk. Houd de monsters op de nutator tijdens incubatie.
4. Incubeer met primaire antilichamen bij juiste verdunning O / N bij 4 ° C.
5. De volgende dag, verwijder de primaire antilichamen, en was de monsters 5 keer met 1x PBT. Laat de monsters voor 5-10 min in 1x PBT-oplossing tussen elke wasbeurt. Houd de monsters op de nutator tijdens incubatie.
6. Incubeer de gewassenmonsters in geschikte secundaire antilichamen met de voorgestelde verdunning en incubatietijd.
7. Was de monsters zes keer met 1x PBT met een 10 minuten incubatie tussen elke wasbeurt.
   Deze stap is essentieel voor het verwijderen van niet-specifiek gebonden secundaire antilichamen uit het monster.
8. Incubeer in een 1: 10.000 verdunning van 1 mg / ml 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in 1x PBT oplossing gedurende 30 min. DAPI is een DNA kleurstof die bindt aan de AT regio van DNA en kan worden gebruikt om de totale morfologie van de hersenen te onthullen.
9. Spoel driemaal met 1x PBS.
10. Transfer monsters naar een dissectie gerecht, en scheiden de hersenen uit de lichamen in een dissectie schotel met behulp van een tang.
11. Na de kleuring en wasstappen, zet de hersenen tussen twee dekglaasjes en plaats de dekglaasjes bovenop een montage dia. Op deze wijze kan de hersenstalen gemakkelijk worden omgedraaid zodat beide zijden van de hersenen kan worden afgebeeld met dezelfde signaalintensiteit.
    Opmerking: Het monteren van de hersenen op het dekglaasje plaats van direct op de montageplaat slide laat wegknippen van de oriëntatie van het monster vrij. Het montageproces wordt in meer detail beschreven.
    1. Plaats een 18 x 18 mm dekglaasje bovenop een montage dia. Verbreden van de opening van een pipetpunt met een mes en gebruiken om de hersenen overdragen 1x PBS oplossing op de 18 x 18 mm dekglaasje.
    2. Plaats de hersenen in het midden van het dekglaasje, verwijder de vloeistof rond de hersenen met een fijne pipet en voeg een 20 - 40 pl anti-fade montage medium (0,2% (w / v) n-propylgallaat in 99,5 % ACS niveau glycerol) over de hersenen.
       Opmerking: De hoeveelheid fixeermiddel toegevoegd is afhankelijk van het aantal hersenen onderzocht.
    3. Voorzichtig verspreid de hersenen tijdens het verplaatsen van de viskeuze montage medium naar buiten. Plaats een tweede 18 x 18 mm dekglaasje bovenop de hersenen door eerst de schuif verlagen van de ene kant tot deze tegen maakthet oppervlak van de montage slip, en dan langzaam verlagen van de andere kant van de hersenen contact met luchtbellen te minimaliseren.
       Opmerking: Het is niet nodig om een afstandhouder te gebruiken tussen de twee dekglaasjes, als het volume van het fixeermiddel en de hersenen moet een ruimte volstaat de twee dekglaasjes scheiden verschaffen.
    4. Laat de dia's om te settelen. Verwijder overmatige vloeistof die uit de zijkant van de glijstukken met een laboratorium tissue komen.
    5. Om te voorkomen dat de dekglaasjes met gemonteerde hersenen van het vallen van de montage-slide tijdens het transport, gebruik dan een klein stukje tape om de dekglaasjes hechten aan de montage dia.
       Opmerking: Hersenen tussen de schuiven kan onmiddellijk worden afgebeeld of bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal een week zonder significant verlies van fluorescerend signaal, zonder noodzaak om afdichtmiddel om de objectglaasjes dichten gemonteerd. Voor de lange termijn behoud van het lood hersenen, kan de zijkant van de twee slips worden verzegeld wet nagellak en opgeslagen in een -20 ° C vriezer, hoewel in lood hersenen hun signalen na verloop van tijd zou kunnen verliezen. Dit wordt niet aanbevolen.
12. Gebruik een geschikte verbinding fluorescentiemicroscoop of confocale microscoop om de afbeelding van de hersenen.
    1. Ten eerste, de afbeelding vanuit de kant van de hersenen dichter bij het doel, en dan voorzichtig flip de dekglaasjes naar de kern in het midden monsters. Deze stap vergemakkelijkt het ophalen van de afbeelding van de andere kant van dezelfde hersenen.
    2. Gebruik een rechtopstaande samengestelde fluorescentiemicroscoop en een 20X objectief het imago van de hele hersenen (voorbeelden in figuur 2) en een 40X objectief beeld kleinere gebieden van de hersenen, zoals DA neuronen in de gepaarde voorste Medial (PAM) cluster regio (voorbeelden in figuur 3).

Resultaten

Figuur 1 illustreert de belangrijkste procedures voor volwassen hersenen dissectie, zoals hierboven beschreven figuren 2 en 3 zijn representatief afbeeldingen 3 dagen oude WT. (Genotype: w ¹¹¹⁸⁾ adulte hersenen, die werden costained met een antilichaam tegen tyrosine hydroxylase vlieg (TH , gekleurd in rood in figuur 2 en wit in figuur 3), een marker vaak gebruikt voor DA neuronen

Discussie

Met een toenemend belang bij volwassen Drosophila hersenen menselijke hersenziekten, neuronale circuits en hogere hersenfuncties bestuderen, is het noodzakelijk om eenvoudig en snel te ontwikkelen tot intacte fly hersenen krijgen voor hele-mount analyses, wat vooral belangrijk voor grote- schalen brain-based schermen. Onze methode biedt een eenvoudige en makkelijk te leren aanpak te ontleden uit een vlieg hoofd (vaak in minder dan 10 s met ervaring) met goed bewaard gebleven morfologie, dat is grotendeels ontda...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1	Bloomington Drosophila Stock Center	51652	Balancer werd omgezet naar TM6B
PBac{WH}parkf01950	Exelixis at Harvard Medical School	f01950	Balancer werd omgezet naar TM6C
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Scientific	02-003-990
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-500
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3)	Fisher Scientific	02-004-198
Magnesium Chloride (MgCl2)	Fisher Scientific	02-003-265
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G	Vervangt glucose
Calcium chloride dihydrate (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22 µm Pore Size	Fisher Scientific	GVWP14250
Formalin Solution, 10% (Histological)	Fisher Scientific	SF98-20
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent	Fisher Scientific	02-003-823
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points	Fisher Scientific	17-456-055	Protocol vereist geen zeer fijne punten.
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody	Pel-Freez Biologicals	P40101
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav	The Developmental Studies Hybridoma Bank	Clone 7E8A10
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	ThermoFisher Scientific	A-21247
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	ThermoFisher Scientific	A-11037
DAPI Solution (1 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	62248
Propyl gallate powder	Sigma-Aldrich	P3130-100G
Glycerol ACS reagent, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	G7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1	Zeiss	Quote
Zeiss Apotome.2	Zeiss	Quote
Zen lite software		Quote