Methodenartikel

Wild-blokkering van PCR In combinatie met Direct Sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor Low-Frequency somatische mutaties

DOI:

10.3791/55130

⸱

29 maart 2017

 ,  , 
1NeoGenomics Laboratories

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wild-type blocking PCR gevolgd door directe sequentiebepaling biedt een zeer gevoelige detectiemethode voor somatische mutaties met een lage frequentie in verschillende soorten monsters.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nauwkeurige detectie en identificatie van laagfrequente mutaties kan problematisch zijn bij de beoordeling residuele ziekte na therapie screenen op opkomende resistentie mutaties tijdens de therapie, of wanneer patiënten hebben weinig circulerende tumorcellen. Wildtype blokkerende PCR en sequentieanalyse biedt een hoge gevoeligheid, flexibiliteit en eenvoud een methode voor detecteren van deze laagfrequente mutaties. Door een speciaal ontworpen vergrendeld nucleïnezuur oligonucleotide een nieuwe of eerder vastgestelde conventionele PCR sequencing assay kan gevoeligheden van ongeveer 1 mutant allel in een achtergrond van 1000 WT allelen worden bereikt (1: 1000). Sequencing artefacten geassocieerd met deaminering gebeurtenissen die algemeen in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefsels kan gedeeltelijk verholpen door het gebruik van uracil DNA glycosylase gedurende extractiestappen. De geoptimaliseerde protocol hier specifiek is voor het detecteren MyD88 mutatie, maar kan als een sjabloon voor elk model te dienenWTB-PCR-bepaling. Eigenschappen WTB-PCR-test op andere gewoonlijk gebruikte bepalingen voor het detecteren van lage frequentie mutaties waaronder allelspecifieke PCR en real-time kwantitatieve PCR onder minder voorkomen van valse positieven, grotere flexibiliteit en gemak van implementatie en het vermogen zowel bekende detecteren en onbekende mutaties.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sanger sequencing is van oudsher de gouden standaard in het testen voor zowel bekende als onbekende somatische mutaties geweest. Een van de beperkingen van Sanger sequentiebepaling is de detectiegrens (~ 10-20% mutant allel in een achtergrond van WT) 1. Dit niveau van gevoeligheid is niet geschikt voor het detecteren van lage somatische mutaties die in de monsters aanwezig kan zijn van premaligne weefsels of patiënten met weinig circulerende tumorcellen, of wanneer beenmerg (BM) is fragmentarisch. Dit maakt het ook de beoordeling van residuele ziekte na de behandeling of het opsporen van opkomende resistentie mutaties tijdens de behandeling bemoeilijkt door alleen 2 conventionele sequencing. Door vervanging van conventionele PCR met gesloten nucleïnezuur (LNA) gemedieerde wildtype blokkerende PCR (WTB-PCR) Sanger sequentiebepaling, gevoeligheden van maximaal 0,1% mutante allel in een achtergrond van WT worden gerealiseerd 2, 3, 4. InWTB-PCR, verrijking van mutante allelen wordt bereikt door de toevoeging van een korte (~ 10-14 NT) blokkeren (LNA) oligonucleotide dat bij voorkeur bindt aan WT DNA waardoor voorkomen amplificatie van WT DNA. De mutant-verrijkte WTB PCR-product kan daarna worden gesequenst. Door het blokkeren WT DNA in plaats van het selecteren op mutaties WTB-PCR maakt verrijking van zowel bekende als onbekende mutaties aanwezig in minieme celfracties.

Meerdere methoden worden momenteel gebruikt voor het detecteren van mutaties in kleine cellen fracties. Dit omvat allelspecifieke PCR-amplificatie-refractaire mutatiesysteem (ARMS), denaturerende vloeistofchromatografie (DHPLC), korrels, emulsies, amplificatie en magnetisme (stralend), elektrisch veld geïnduceerde afgifte en meting (Efirm), hoge resolutie smeltpunt en anderen. Echter, de meeste van deze methoden zijn beperkt door vals-positieven en de mogelijkheid om slechts één mutatie dat de test is ontworpen voor 4 sporen . WTB-PCR, echter, kan de gebruiker sequencing sporen waarbij de detectie van verschillende types mutaties mogelijk maakt en kan helpen bij het uitsluiten van vals positieven als gevolg van artefacten of deaminering te visualiseren. Nieuwe generatie sequencing (NGS) kan een geschikt alternatief voor conventionele sequencing bieden echter aanzienlijk hogere kosten, complexiteit en langere analysetijd maken het onnodig optie voor veel soorten ziekte met enkele verschillende moleculaire merkers of controle van patiënten therapie voor opkomende resistentie mutaties. Verder hoge vals positieven bij het detecteren van varianten met gemuteerde allel een frequentie van minder dan 5% kan problemen opleveren voor amplicon gebaseerde NGS 5, 6.

Hier laten we zien de toename van de gevoeligheid verkregen door WTB-PCR screenen op mutaties in de myeloïde differentiatie factor 88 gen zoals beschreven door Albitar et al. 3 MyD88 mutations zijn belangrijke diagnostische en prognostische factoren in Waldenström Macroglobulinemia (WM), IgM monoclonale gammopathie van onbekende betekenis (IgM-MGUS), milt marginale zone lymfoom (SMZL) en diffuus grootcellig B-cellymfoom (DLBCL). MyD88 mutaties gevonden in bijna alle gevallen van WM en ongeveer 50% van de patiënten met immunoglobuline M (IgM) -secreting MGUS. Daartegenover zijn MyD88 mutaties gevonden in slechts 0-6% van de patiënten met SMZL en afwezig zijn bij multipel myeloom 7, 8. Omdat overlappende morfologische, immuunfenotypische, cytogenetische en klinische kenmerken tussen WM en SMZL of IgM-multiple myeloom vaak bemoeilijken differentiaaldiagnoses kan de aanwezigheid van een mutatie MyD88 een nuttig identificeren factor 9. MyD88 mutaties zijn ook geassocieerd met een grotere ziektelast bij patiënten met DLBCL en slechte algemene overleving na behandeling 7, 10. Bovendien, omdat MyD88 mutaties voorkomen bij geactiveerde B-cel-achtige (ABC) DLBCL dan kiemcentrum B-cel-achtige (GCB) DLBCL of primaire mediastinale B-cellymfoom (PMBL) kan MyD88 mutatiestatus als dienst surrogaat marker voor de ABC-subtype 11, 12.

De gedetailleerde protocol die hier als een matrijs waaruit nieuwe assays kunnen worden ontwikkeld en de meeste bestaande sequentie bepalingen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan laagfrequente mutaties in diverse soorten monsters nauwkeurig te detecteren. De benadering kan ook worden gebruikt voor het bewaken en detecteren van resistente mutaties die kunnen ontwikkelen tumoren of zelfs bacteriën die kan optreden terwijl patiënten behandeld met gerichte therapie of antibiotica. Verder behandelt het en rechtsmiddelen veel van de problemen in verband met mutatie verrijking, met name in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) weefsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethiek Verklaring: Alle testen van menselijke monsters werd uitgevoerd na het verkrijgen van Institutional Review Board (IRB) goedkeuring.

1. DNA-extractie uit FFPE weefsel, perifeer bloed en beenmergaspiraat

  1. Beenmerg FFPE weefsel met DNA FFPE extractiekit
    1. Beginnen FFPE weefsel van ongekleurd slides (5-10 secties 5-10 urn dikte).
      Opmerking: Als begin met weefsel spaanders, gebruik 3-6 secties 5-10 urn dikte en verder met stap 1.1.6.
    2. Plaats dia's in een dia mand en voor te bereiden vier wassen reservoirs (twee voor xyleen en twee voor 100% alcohol). Voeg een minimumvolume van 600 ml oplossing voor elke mand.
    3. Deparaffinize de objectglaasjes door het doen van een 5 min xyleen wassen in de eerste bak. Breng de objectglaasjes tweede xyleen wasreservoir gedurende nog 5 min.
    4. Na deparaffineren Was de dia's met 100% alcohol gedurende 5 minuten. Breng de dia's naar de tweedealcoholwassing reservoir gedurende nog 5 min.
    5. Laat de objectglaasjes volledig drogen in een zuurkast voor hen schrapen met een scheermesje in een microcentrifugebuis.
      OPMERKING: Indien een H & E dia met tumorgebied aangegeven beschikbaar is, verplaats de geleiders en schraap alleen tumorgebied.
    6. Ga verder met de instructies van de fabrikant handout opgenomen in de kit.
  2. Voor BM aspireren en perifere bloed
    1. Extract volgens de fabrikant instructies van hand-out met deze specificaties.
      LET OP: Er zijn tal van commercieel verkrijgbare kits en methoden voor DNA-extractie uit FFPE weefsels en cellen. Vrijwel alle kunnen worden gebruikt. Gebruik een methode die is vastgelegd in het laboratorium.
      1. Met 200 pi van perifeer bloed (PB) of 100 pl BM + 100 pi PBS.
      2. Met 4 pi RNase A voorraadoplossing.
      3. Elueer met 100 ul elutiebuffer.
  3. DNA kwantificering
    1. DNA concentraties meet met behulp van een spectrofotometer zorgen voor een 260 nm / 280 nm verhouding van ongeveer 1,8 (bij zuiver DNA). Wanneer de verhouding aanzienlijk lager is, kan de aanwezigheid van eiwitten, fenol of andere verontreinigingen die kunnen interfereren met verdere toepassingen geven.
    2. Passen DNA concentraties ongeveer 50-100 ng / ul met geschikte elutiebuffer.

2. wildtype blokkeren PCR

  1. primer ontwerp
    1. Ontwerpen verkrijgen primers voor genen van belang volgens de eerder beschreven algemene richtlijnen PCR primer ontwerp 13. Omvatten M13-voorwaartse en achterwaartse universele sequencing primers in PCR primers.
      OPMERKING: De MyD88 assay ontwikkeld tot exon 5 van MyD88 amplificeren (G259 - N291) en 110 nucleotiden in het 5' gebied intronische de splitsingsplaats en een deel van intron 4. De voorwaartse en achterwaartse primers bedekken ontworpen met een 5' -M13 sequentie (M13-forward: TGT aaa acg acg gcc agt; M13-omgekeerde: cag gaa ACA GCT ATG acc) mogelijk te maken voor hybridisatie van complementaire sequencing primers (zie Materials Table).
  2. Locked Nucleic Acid Oligonucleotide ontwerp
    1. Het ontwerp van de blokkerende oligonucleotide op ongeveer 10-15 basen lang en complementair met de WT matrijs waarin mutant verrijking gewenst.
      OPMERKING: Een kortere oligo zal mismatch discriminatie te verbeteren. Om een ​​hoge specificiteit te bereiken, is het belangrijk te veel blokkeren van nucleotiden niet te gebruiken, omdat dit kan leiden tot een zeer "sticky" oligonucleotide. De inhoud en de lengte en nucleotide blokkering moet worden geoptimaliseerd op basis van de specifieke nucleotide die moeten worden geblokkeerd. Het is belangrijk om hoge bindingsspecificiteit bereiken zonder afbreuk secondaire structuur en riskeren zelf-complementariteit.
    2. Ontwerp het blokkeerorgaan oligo een Tm hebben 10-15 ° C boven het verlengstuk temperature tijdens thermocycli. Pas de Tm door het toevoegen of verwijderen blokkerende basen of door vervanging blokkeren basen DNA met vermijding van lange stukken (3-4 basen) blokkeren G of C basen.
      1. Navigeer naar de oligo gereedschappen website (zie tabel van Materialen) en selecteer de "blokkerende Oligo Tm Prediction" tool.
      2. Plak de sequentie van het template WT die gewenst is geblokkeerd in het vak "Oligo Sequence". Add "+" voor bases te blocker bases aan te geven.
      3. Selecteer de "Bereken" knop om de geschatte Tm van de DNA-Blocker hybride te bepalen.
    3. Ontwerp de blokkerende oligo om de vorming van secundaire structuur of self-dimeren te vermijden.
      1. Navigeer naar de oligo gereedschappen website (zie tabel van Materialen) en selecteer de "blokkerende Oligo Optimizer" tool.
      2. Plak de sequentie van het template WT die gewenst is geblokkeerd in het vak. Add "+" voor bases aan te geven blokkeren bases.
      3. Selecteer de twee vakken voor "Secundaire structuur" en "Self Only". Druk op de knop Analyseren om de oligo voor potentieel lastige secundaire structuren of zelf-dimeren te herzien.
        LET OP: De scores vertegenwoordigen zeer ruwe schattingen van de T m 's van de secundaire structuren en zelf-dimeren. Lagere scores zijn dus optimaal en kan worden gerealiseerd door de blocker-blocker koppelen. De blokkerende oligonucleotide voor MyD88 [MYD88blocker (TCAGA AG + + C + G + A + C + G + T + A + T + CC / invdT /)] ontworpen aminozuren Q262-I266 bedekken en heeft een 3'-omgekeerde dT beide verlenging door DNA-polymerase en afbraak door 3'-exonuclease remmen. Deze specifieke blokkerende oligo is een 17-meer met 10 blokkerende basen die worden aangeduid als "+ N". De resterende 7 basen zijn normale DNA nucleotiden.
  3. WTB-PCR Setup en Thermocycling
    1. Bereid een WTB-PCR meester mix (MMX) met 2,5 ui PCR-reactiebuffer 10x w / 20 mM MgCl2, 250 uM dNTPs, 0,2 uM voorwaartse en reverse primer, 1,2 uM MYD88blocker en DNAse, RNAse-vrij, ultrazuivere H2O ter verkrijging van een uiteindelijke creëren oplossing volume van 21,75 gl per reactie.
      OPMERKING: Bedriifsconcentraties zijn voor het uiteindelijke reactievolume van 25 pl (na toevoeging van DNA template en polymerase). Conventionele PCR MMX wordt bereid door eenvoudig weglaten van de toevoeging van blokker. Alle stappen protocol blijft voor beide WTB en conventionele PCR. Dit kan worden gebruikt bij de validatie en het bepalen van de verrijking bereikt door toevoeging van blokker.
      1. Bij de berekening van MMX voorbereiding ervoor zorgen om rekening te houden met 3 extra reacties (positieve en negatieve controles en een niet-template controle om te controleren op contaminatie) en ten minste nog 1 reactiemengsel voor pipetteerfout.
    2. Vortex MMX grondig. De MMX kan worden opgeslagen bij -80 ° C tot ayoor.
    3. Voeg 0,25 ul Taq DNA polymerase per reactie op de MMX en zwenken om te mengen. Zodra de polymerase is toegevoegd aan de MMX, houd het op ijs.
    4. Plaats een nieuwe 96 well PCR plaat op een koude plaat en pipetteer 22 pl met MMX polymerase aan elk reactieputje.
    5. Voeg 3 ul genomisch DNA (50-100 ng / ul aan elk van de putjes die de MMX met polymerase.
    6. Dicht de platen en centrifuge kort te zorgen voor de oplossing de bodem van elke put bereikt.
    7. Laad de PCR plaat op een thermocycler.
      1. Stel de temperatuurrondvoercondities voor WTB-PCR-reactie als volgt: initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 6 min; 40 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 s, primer annealing bij 56 ° C gedurende 30 s en verlenging bij 72 ° C gedurende 1 min 20 s; laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
        OPMERKING: Best practice betreft het invullen van de rest van het protocol in een fysiek gescheiden ruimte om amplicon besmetting te voorkomen in toekomst setups.
  4. Voeren gelelektroforese volgens eerder beschreven protocollen 14 om te bepalen of WTB-PCR succesvol was en een gebrek aan amplificatie in de niet-matrijsstreng controle bevestigen.
  5. Zuivering van PCR product door magnetische beads
    1. Verwijder magnetische korrels bij 4 ° C en breng aan kamertemperatuur.
    2. Breng 10 pl PCR product aan een nieuwe PCR-plaat.
    3. Vortex de magnetische korrels krachtig volledig resuspenderen van de magnetische deeltjes.
    4. Voeg 18 ul magnetische bolletjes aan elk goed op de nieuwe plaat. Pipet mengen 10 keer.
    5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    6. Plaats de PCR-plaat op de zijde rokken magneetplaat gedurende 2 min te scheiden beads uit de oplossing.
    7. Zuig het supernatant met een meerkanaalspipet, vermijden de kraal pellet.
    8. Afzien 150 pl 70% ethanol in elk putje en incuberen bij kamertemperatuur for ten minste 30 s. Zuig het ethanol met een multichannel pipet en tips te verwijderen. Herhaal deze wasprocedure eens te meer.
    9. Toepassing van een 20 pi multikanaalspipet zuig het resterende ethanol uit elk putje en tips ontdoen.
    10. Zodra putjes droog (~ 10 min) verwijderen uit magneetplaat en voeg 40 ul nuclease-vrij water aan elk putje en pipet mix 15 keer of wervel voorzichtig.
    11. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
    12. Plaats de PCR-plaat op magneetplaat gedurende 1 min tot afzonderlijke korrels uit de oplossing.
    13. Overdracht 35 pi gezuiverd produkt een nieuwe PCR-plaat. Dit gezuiverde PCR-product kan nu doorgaan met bidirectionele sequentiebepaling of kan worden opgeslagen bij -20 ° C totdat het nodig is.
      OPMERKING: Bij de ontwikkeling van een nieuw assay kan kwantificatie van gezuiverde PCR-product vereist. 1-3 ng / ul amplicon DNA optimaal is voor bidirectionele sequentiebepaling. Indien concentratie constant laag verhogen PCR product en magnetische korrels proportionally (1: 1,8). Indien concentratie constant hoog, elueer met een groter volume water.

3. Sequencing van WTB-PCR-product

  1. Bi-Directional Sequencing
    OPMERKING: Het volgende protocol is een gemodificeerde vorm van de instructies van de fabrikant die is geoptimaliseerd om minder reagentia gebruiken.
    1. Bereid voorwaartse en omgekeerde sequentiereactie mengt met 0,25 gl Ready Reaction mix, 1,88 pl Sequencing Buffer, 1,78 uM M13-F of M13-R sequencing primers en voeg en DNAse, RNAse-vrij, ultrazuivere H2O ter verkrijging van een uiteindelijke oplossing te creëren volume van 9 pi per reactie. Deze sequentie reactiemengsel kan tot een jaar opgeslagen bij -20 ° C.
    2. Pipet 9 ul van de voorwaartse sequentie reactiemengsel in elk putje van een nieuwe 96-puts PCR platen voor de voorwaartse sequentie reactie. Herhaal op een afzonderlijke plaat voor de omgekeerde sequentiereactie.
    3. Voeg 1 ul van het gezuiverde PCR-product WTB to elk putje van zowel de voorwaartse en achterwaartse platen.
    4. Dicht de platen en centrifuge kort te zorgen voor de oplossing de bodem van elke put bereikt.
    5. Laad de PCR plaat op een thermocycler.
      1. Stel de temperatuurrondvoercondities de sequentie reactie als volgt: 96 ° C gedurende 1 min; 30 cycli van 96 ° C gedurende 10 s, 50 ° C gedurende 5 seconden, 60 ° C gedurende 4 min; houden op 4 ° C tot gereed voor zuivering.
  2. Zuiver Sequencing Producten
    1. Bereid een verse 1:25 oplossing van 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 100% ethanol.
    2. Bereid een verse 70% ethanol-oplossing.
    3. Voeg 30 ul natriumacetaat / 100% ethanol oplossing in elk putje van zowel de voorwaartse en teruggaande sequentie borden en pipet mengsel 5 maal.
    4. Bedek de plaat en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
    5. Centrifugeer de plaat bij 2250 xg gedurende 15 min.
    6. Verwijder het plaatafsluiter en zwenken over een verspillingcontainer.
      LET OP: Omkeren slechts één of de korrel kan los te maken uit de put bodems.
    7. Plaats de omgekeerde plaat op een schone papieren handdoek en centrifugeer bij 150 xg gedurende 1 minuut.
    8. Voeg 150 ul 70% ethanol aan elk putje.
    9. Bedek de plaat en draaien bij 2250 xg gedurende 5 minuten.
    10. Herhaal stap 3.2.6 en 3.2.7.
    11. Als de putten zijn niet helemaal droog, laat ze aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de monsters worden beschermd tegen het licht tijdens het drogen.
    12. Voeg 10 pi formamide aan elk putje en pipet mix 10 keer. Bedek de plaat.
    13. Denatureren op thermocycler bij 95 ° C gedurende 3 min gevolgd door 4 ° C gedurende 5 minuten.
    14. Na denaturering vervangen plaatafdichter met een septum en reeks aan sequentiebepaling platform volgens instructies van de fabrikant 15.

4. Analyse van sequentiebepalingsresultaten

  1. Visualiseren sequencing sporen met behulp van een sequentie DATeen analyse software volgens de instructies van de fabrikant en lijn 16 met de respectievelijke referentiesequenties. Uitlijnen MyD88 naar NCBI referentiesequentie "NM_002468".

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een conceptueel overzicht van WTB-PCR gedurende het doortrekken wordt in Figuur 1. Omdat een enkele nucleotide mismatch in de blocker-DNA-hybride aanzienlijk verlaagt de smelttemperatuur (ATm = 20-30 ° C), amplificatie van het WT allel geblokkeerd terwijl mutant template DNA vrij verlengstuk 17 te voltooien. Op deze wijze wordt mutant DNA exponentieel geamplificeerd terwijl WT DNA lineair geamplificeerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De WTB-PCR-test beschreven maakt gebruik van een generieke reeks primers met een blokkerende oligo ontworpen om amplificatie van WT DNA blokkeren tijdens verlenging (Figuur 1). De WTB-PCR-product wordt vervolgens gesequenced voor mutatie-analyse. De bruikbaarheid van WTB-PCR / Sanger ligt in de eenvoud, hoge gevoeligheid en hoge doorvoer. Met de hier beschreven richtlijnen kunnen de meeste bestaande Sanger gebaseerde testen eenvoudig gemodificeerd worden door de toevoeging van een blokkerend oligonucleo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen dankbetuigingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubesEppendorf05-402-25
100% alcoholVWR89370-084Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencerABIof equivalent
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Voor magnetische kraal PCR zuivering
Aluminum sealing foilsGeneMateT-2451-1Voor PCR en koude opslag
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kitLife Technologies4337455Voor bi-directionele sequencing. Met 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 SeriesEppendorfA-2-DWP rotor (voor PCR plate)
Cold plate for 96 well platesEppendorfZ606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100 mM)Invitrogen10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted MagnetThermo Fisher Scientific12027Voor gebruik in PCR zuivering.
Ethanol Absolute SigmaE7023200 proof, voor moleculaire biologie
Exiqon website Oligo Toolswww.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL)Roche12032937001Met10x geconcentreerde PCR reactie buffer, met 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit Qiagen180134Bevat uracil DNA glycosylase noodzakelijk voor het verminderen van sequencing artefacten
Hi-Di FormamideABI4311320Voor sequencing.
LNA oligonucleotideExiqon5001005'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA basen)
M13-F Sequencing PrimerABI5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing PrimerABI5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S ThermocyclerEppendorfE950030020
Microcentrifuge Model 5430EppendorfFA-45-30-11 rotor (voor 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermo Fisher Scientific
PCR forward primerIDT5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primerIDT5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR platesGeneMateT-3107-1
Pipettors20, 200, 1.000 µL
Plate septa, 96 wellABI4315933
QIAamp DNA Mini KitQiagen51304Voor BM aspiraat en perifeer bloed
SeqScape Sortware v3.0ABI4474978Voor sequencing analyse
Slide basket
Sodium Acetate (3 M, pH 5.2) SigmaS7899
Sterile filtered pipette tips20, 200, 1.000 µL
Thermomixer C Eppendorf5382000023
Vortex genieScientific IndustriesSI-0236
Wash reservoir~ 1.000 mL
XyleneVWR89370-088Histology grade

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  2. Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
  3. Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
  4. Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
  5. Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
  6. Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420(2014).
  7. Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
  8. Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
  9. Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
  10. Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
  11. Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
  12. Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
  13. Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  15. Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
  16. Applied Biosystems. User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
  17. Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
  18. Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
  19. Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
  20. Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
  21. Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
  22. Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
  23. Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
  24. Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
  25. Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
  26. Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
  27. Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
  28. Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Detectie van somatische mutatieslaagfrequente mutatiesMYD88 mutatieLocked Nucleic Aciduracil DNA glycosylasezuivering met magnetische kralenbidirectionele sequencingprimerontwerp

Gerelateerde artikelen