Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Samenvatting

Enkele cel sequencing is een steeds populairder en toegankelijk instrument voor de aanpak van genomische veranderingen op hoge resolutie. Wij bieden een protocol dat enkele cel sequencing gebruikt om het aantal kopieën veranderingen te identificeren in enkele cellen.

Samenvatting

Detectie van genomische veranderingen op één enkele cel resolutie is belangrijk voor het karakteriseren van genetische heterogeniteit en evolutie in normale weefsels, kanker, en microbiële populaties. Traditionele methoden voor de beoordeling van de genetische heterogeniteit zijn beperkt door lage resolutie, lage gevoeligheid en / of lage specificiteit. Enkele cel sequencing is uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel voor het detecteren van genetische heterogeniteit met hoge resolutie, hoge gevoeligheid en, indien passend geanalyseerd hoge specificiteit. Hier bieden we een protocol voor de isolatie, hele genoom amplificatie, sequencing en analyse van enkele cellen. Onze aanpak maakt het mogelijk om betrouwbare identificatie van megabase-scale copy number varianten in enkele cellen. Echter aspecten van dit protocol kan ook worden toegepast op andere typen genetische veranderingen in individuele cellen te onderzoeken.

Inleiding

Veranderingen in DNA copy number kan variëren in grootte van een aantal basenparen (copy aantal varianten) (CNV) en om hele chromosomen (aneuploïdie). Kopie aantal veranderingen beïnvloeden grote gebieden van het genoom kan belangrijke fenotypische gevolgen hebben door het veranderen van de expressie tot duizenden genen ^{1, 2.} CNV aanwezig in alle cellen van een populatie kan worden gedetecteerd door sequentiebepaling of massa-microarray gebaseerde werkwijzen ^{3, 4} zijn. Echter kunnen ook populaties genetisch heterogeen zijn, waarbij bestaande CNV in een subset van de populatie of zelfs individuele cellen. Genetische heterogeniteit is gebruikelijk bij kanker, tumor evolutie drijven, en ook in normale weefsels, met onbekende gevolg ^{5, 6, 7, 8, 9 , 10.}

Traditioneel werd genetische heterogeniteit beoordeeld worden door cytologisch benaderingen of bulk sequencing. Cytologisch benaderingen, zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), chromosoom spreads, en spectrale karyotypering (SKY), hebben het voordeel van het identificeren van veranderingen aanwezig zijn in individuele cellen, maar hebben een hoge foutenpercentages als gevolg van artefacten van hybridisatie en verspreiden van ^11. Deze benaderingen zijn ook beperkt in hun resolutie alleen het onthullen van duplicaties over meerdere megabasen. Sequencing of microarrays van bulk DNA, hoewel hoger in nauwkeurigheid en resolutie, is minder gevoelig. Om genetische heterogeniteit te detecteren door populatie gebaseerde benaderingen moeten de varianten aanwezig in een aanzienlijke fractie van cellen in de populatie. De opkomst van methoden om de genomische DNA van enkelvoudige cellen amplificeren heeft het mogelijk gemaakt om het genoom van afzonderlijke cellen sequentie. Enkele cel Sequéncing heeft de voordelen van hoge resolutie, een hoge gevoeligheid, en, indien van toepassing voor kwaliteitscontrole methoden worden toegepast, hoge nauwkeurigheid ^12.

Hier beschrijven we een werkwijze voor het detecteren megabase schaal kopieaantal veranderingen in individuele cellen. We isoleren enkele cellen door microaspiration, genomisch DNA te amplificeren met behulp linker-adapter PCR bibliotheken bereiden voor de volgende generatie sequencing en detecteren kopieaantal varianten zowel verborgen Markov model en circulaire binaire segmentatie.

Protocol

1. Het isoleren van enkele cellen

1. Bereid de microaspirator
   1. Verwijder de doorzichtige plastic uiteinde van de aspirator buisstelsel en steek het smalle uiteinde in een uiteinde van een 1 cm lange PVC buis met 3/16 "binnendiameter.
   2. Plaats de uitlaat van een 0,2 urn spuitfilter in het andere uiteinde van de 1 cm lange PVC buis met 3/6 "binnendiameter.
   3. Steek de inlaat van de 0,2 urn spuitfilter in een einde van een 6 inch-lange PVC buis met 5/16 "binnendiameter.
   4. Optioneel: Snijd de 6 inch-lange PVC buis met 5/16 "binnendiameter in de helft en plaats een in-line water val tussen de twee helften.
   5. Breek een 5 ml plastic serologische pipet op 1 ml graduatie en plaats het gebroken uiteinde in het open uiteinde van de PVC buis met 5/16 "binnendiameter.
   6. Plaats de uitlaat van het 5 mL plastic serologische pipet in het flexibele uiteinde van een aspirator eenheid (waarbij de doorzichtige plastic eindewas verwijderd).
   7. Voor de opslag, hebben betrekking op de rode spreekbuis van de aspirator buis montage met een steriele plastic buis.
   8. Trekken uit een glazen capillair met een inwendige diameter van 10-30 urn doordat zij het midden van de buis bij een Bunsen brander vlam en toepassen spanning op beide uiteinden van de buis. Breek de buis getrokken in het midden om twee potentiële aspirator naalden te creëren. Herhaal deze stap met een aantal buizen, aangezien slechts enkele buizen zal eindigen met een inwendige diameter die geschikt is voor het plukken van enkele cellen is.
   9. Voor de opslag, plaats twee stroken van boetseerklei in een 15 cm petrischaal en zet de aspirator naalden over de strips.
2. Pick-cellen
   1. Bereid een enkele cel schorsing afhankelijk van het type cel en experiment. Bijvoorbeeld om hechtende cellen te bereiden zoals humane fibroblast cellijnen oogst cellen door behandeling met trypsine en overdracht cellen om een ​​conische buis met geschikte media.
   2. Voor, tijdens offter de voorbereiding van de enkele cel suspensie (afhankelijk van hoe lang het duurt om de enkele celsuspensie te bereiden), het instellen van de kap voor de hele genoom amplificatie.
      1. Spray beneden het oppervlak van de kap, pipetpunt dozen, en de pipet tips met 10% bleekwater en veeg met een papieren handdoek. Herhaal deze stap met 70% ethanol.
      2. Voeg 8 pi van water uit het hele genoom amplificatie (WGA) kit afzonderlijke putjes van een 96-well PCR plaat, één putje voor elke cel waarvan de sequentie. Bedek de 96-well PCR plaat met een deksel van een 96-well weefselkweekplaat en plaats op ijs.
   3. Voeg 1000 cellen aan 10 ml media of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een 15 cm petrischaal en plaats de schotel op ijs te voorkomen dat de cellen hechten aan de schaal.
   4. Breng de cellen in een petrischaal en de 96-well PCR plaat met deksel op ijs om een ​​licht microscoop met 10x objectief.
   5. Verhoog de opening van de aspirator naald door voorzichtig de uitgesponnen eind van Th tikkene aspirator naald op een hard oppervlak, zodanig dat de punt afbreekt. Steek het brede uiteinde van de aspirator naald in de heldere einde van de microaspirator.
   6. Plaats de petrischaal met cellen op de microscoop podium. Plaats de rode mondstuk van de aspirator in de mond. Met één hand de naald aspirator en anderzijds naar de petrischaal met cellen bewegen. Identificeer enkele cellen waarvan de sequentie.
   7. Met behulp van mond zuigkracht, trek een enkele cel in de aspirator naald samen met ~ 1-2 pi van media of PBS. Breng de cel in de 8 pi water in een enkel putje van de 96-well PCR plaat. Voorkomen dat er luchtbellen bij de overdracht van de cel.
   8. Herhaal stap 1.2.7 tot het gewenste aantal cellen zijn geïsoleerd. Houd de PCR-plaat op ijs en bedekt met deksel in tussen plukken cellen. Markeren de putten die cellen hebben ontvangen.
      1. Terwijl het oppakken enkele cellen, ontdooien de 10X enkele cel lysis en fragmentatie buffer uit de hele genome amplificatie kit. Na het kiezen van de gewenste aantal cellen, gaat onmiddellijk op hele genoom amplificatie.

2. Whole Genome Amplification

1. Om besmetting tijdens de gehele genoom amplificatie te voorkomen, voeg alle reagentia in een weefselkweek kap, gebruiken pipet tips met filters, en verander de pipet tip in tussen de putten.
2. Bereid een werkende lysis en fragmentatie bufferoplossing uit het hele genoom amplificatie (WGA) kit. Voor elke set van maximaal 32 cellen combineren 32 ui 10x cel lysis en fragmentatie buffer en 2 pl proteinase K oplossing in een microcentrifugebuis. Vortex de buis om de oplossingen te mengen.
3. Voeg 1 pl werken lysis en fragmentatie bufferoplossing aan elk putje en pipet op en neer te mengen.
4. Bedek de plaat en sluit alle putjes met een plastic folie. Kort centrifuge de plaat in een mini plaat spinner.
5. Thermische cyclus als follows: 50 ° C, 1 h en 99 ° C, 4 min.
6. Koel de plaat op ijs en kort centrifuge de plaat in een mini-plaat spinner.
7. Bereid een werkende bibliotheek voorbereiding bufferoplossing uit het hele genoom amplificatie kit. Voor elke cel, combineer 2 pl 1x cel bibliotheek bereiding buffer en 1 pi van bibliotheek stabilisatie oplossing in een microcentrifugebuis. Bereid de werkoplossing meerdere cellen in dezelfde microcentrifugebuis.
8. Verwijder de plastic film en voeg 3 pl werkbibliotheek preparaat bufferoplossing aan elk putje. Pipetteer de inhoud van de put op en neer om te mengen. Vervang de kunststoffolie.
   OPMERKING: De kunststoffilm kan worden hergebruikt gedurende het gehele genoom amplificatieproces totdat de putjes gaan boringen in de film. Wanneer dit gebeurt, overschakelen naar een nieuwe plastic folie.
9. Kort centrifuge de plaat in een mini spinner plaat en incubeer bij 95 ° C gedurende 2 minuten.
10. Koel de plaat op ijs en in het kortcentrifuge de plaat in een mini plaat spinner.
11. Verwijder de plastic folie, voeg 1 pl bibliotheek enzympreparaat aan elk putje en pipet de inhoud van de put op en neer te mengen. Houd de bibliotheek voorbereiding enzym op ijs of in een koude blok in deze stap. Vervang de kunststoffolie.
12. Kort centrifuge de plaat in mini plaat spinner en thermische cyclus als volgt: 16 ° C, 20 min, 24 ° C, 20 min, 37 ° C, 20 min, 75 ° C, 5 min, en houden op 4 ° C.
13. Koel de plaat op ijs en kort centrifuge de plaat in een mini-plaat spinner.
14. Bereid een werkende versterking mix van het hele genoom amplificatie kit. Voor elke cel, combineer 48,5 pi water, 7.5 pi 10x versterking master mix, en 5 pi WGA DNA polymerase in een microcentrifugebuis. De werkoplossing mix meerdere cellen in dezelfde microcentrifugebuis. Houd de werkende mix op ijs.
15. Verwijder de plastic folie, voeg 61 ul werken versterking mixaan elk putje, en de inhoud van de pipet goed op en neer om te mengen. Houd de werkende versterking mix op ijs of in een koude blok in deze stap. Vervang de kunststoffolie.
16. Kort centrifuge de plaat in een mini plaat spinner en thermische cyclus als volgt: 95 ° C, 3 min, 25 cycli van 94 ° C, 30 sec en 65 ° C, 5 min, en houden op 4 ° C.
17. Overdracht 60 pi van elk monster een aparte microcentrifugebuis en opslag bij - 20 ° C voor gebruik in stap 3.
18. Voeg DNA laadkleurstof het resterende volume van elk monster (dat wil zeggen 3 pi van 6x DNA laadkleurstof tot 15 pl monster) en in werking 5 pi van elke reactie op een 1% agarosegel.
    OPMERKING: Cellen die met succes versterkt zal verschijnen als een uitstrijkje van 250 tot 1000 bp. Monsters die geen uitstrijkje hebben laten zien of alleen laten een zwakke uitstrijkje is onwaarschijnlijk dat bruikbare sequencing data opleveren.

3. Sequencing

1. Zuiver monsters met paramagnetische kralen.
   1. Thaw DNA-monsters op ijs. Vortex paramagnetische kralen tot de oplossing homogeen en incubeer de korrels bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min.
   2. Transfer 20 pi van elk DNA monster in een schone microcentrifugebuis. De rest van het monster kan worden opgeslagen bij -20 ° C.
   3. Voeg 30 pi (1,5x) van paramagnetische kralen aan elk DNA-monster en vortex te mengen. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Laat de voorraadoplossing van kralen bij kamertemperatuur voor gebruik in stap 3,4.
   4. Plaats de buizen op een magnetische strip buis gedurende 2 minuten of totdat de korrels vormen een pellet en het supernatant helder.
   5. Met behulp van een pipet P200, verwijder zoveel van de supernatant mogelijk zonder de kralen.
   6. Voeg 180 ui 80% ethanol om het DNA-korrel mengsel. meermaals opzichte van de magneet "spoelen" de kralen door de ethanoloplossing draaien de buizen.
   7. Met behulp van een pipet P200, verwijder zoveel mogelijk van de ethanol wassen als mogeble zonder verstoring van de kralen.
   8. Herhaal 3.1.6 en 3.1.7.
   9. De lucht drogen de kralen gedurende ongeveer 10 minuten of tot er geen ethanol meer zichtbaar is. Naar de volgende stap bij de parels verschijnen gebarsten of de wand van de buis vallen.
   10. Verwijder de monsters van de magneetstrip. Voeg 40 ul van 10 mM Tris pH 8,0 met het DNA van de bolletjes elueren en vortex de monsters om de kralen resuspenderen. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
   11. Kort Centrifugeer de monsters om de vloeistof op de bodem van de reageerbuis te verzamelen en plaats de buizen op een magnetische strip buis gedurende ten minste twee minuten. Breng de eluent in schone microcentrifugebuizen zonder verstoring van de kralen.
2. sample normalisatie
   1. Kwantificeren van de concentratie van elk monster onder toepassing van een spectrofotometer. De concentraties moet liggen van 10 tot 30 ng / ul.
   2. Verdun elk monster tot 0,2 ng / ul gebruikt 10 mM Tris pH 8,0. De volgende stappen zullen een minimum ik vereisennput van 5 pi van deze verdunning.
3. voorbereiding bibliotheek
   1. Bereid sequencing bibliotheken door de instructies van de bibliotheek voorbereiding kit ^13.
4. eindschoonmaak
   1. Reinig de monsters volgens stap 3,1. Gelezen lengte van 50 bp, 75 bp of 150 bp, gebruiken een verhouding van kraag naar volume 1,5x, 1x of 0.6x monster, respectievelijk. Elueer met 15 ui 10 mM Tris pH 8,0.
   2. Run de monsters op een fragment analysator om de grootteverdeling van de bibliotheek ¹⁴ controleren. De grootteverdeling wordt gelijkmatig verdeeld 150-900 bp.
5. Kwantificeren monsters met behulp van qPCR
   1. Met behulp van een bibliotheek kwantificering kit, opzetten van een qPCR reactie volgens de kit instructies ^15. Laat een kolom leeg om positieve normen (DNA normen uit de kit) en negatieve normen (water of andere blanco-oplossing) toe te voegen.
   2. Thermische cyclus als follows: 95 ° C, 5 min (toenamesnelheid van 4,8 ° C / sec) en 35 cycli van 95 ° C, 30 sec (toenamesnelheid van 4,8 ° C / sec) en 60 ° C, 45 sec (toenamesnelheid van 2,5 ° C / sec).
6. pooling
   1. Bepalen hoeveel rijstroken op de doorstroomcel nodig zijn en verdeel de monsters in groepen, waarbij één groep per rijstrook.
   2. Voor iedere groep, kiest het monster met de laagste concentratie op basis van de qPCR gegevens uit stap 3.5.2 en normaliseren alle monsters in die groep die concentratie waarbij 10 mM Tris pH 8,0.
   3. de monsters in elke groep samen te bundelen.
7. sequencing
   1. Load zwembaden op next-generation sequencing machine volgens standaardprocedures ^16.

4. Data Analysis

OPMERKING: Een Unix-gebaseerde omgeving is vereist om de programma's en scripts in dit gedeelte werking. Installeer de in het protocol genoemde software na hun in stallatie gidsen. Alle scripts zijn te vinden op https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/.

1. Knip de leest 40-nt met behulp van fastx_trimmer van FastX-Toolkit versie 0.0.13 ^17.
   fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq l 40 -o example.trim.fastq
2. Lijn de leest om de juiste verwijzing genoom (MM9 voor muis, hg19 voor menselijke) met behulp van BWA versie 0.6.1 met standaardopties ^18.
   BWA ALN mm9.fa example.trim.fastq> example.sai
   BWA Samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam
3. Verwijder Alignmenten Chrm en willekeurige chromosomen, dan sorteren en de index van de resulterende BAM-bestand met SAMTools versie 0.1.19 ^19.
   grep -v -w Chrm example.sam | grep -v willekeurige> example.filtered.sam
   samtools bekijken -uSh example.filtered.sam | samtools sort - example.filtered
   samtools index example.filtered.bam
4. Ren HMMcopy om CNVs detecteren= "Xref"> 20
   1. Gebruik gcCounter in HMMcopy een GC percentage referentiebestand voor het genoom te genereren. Gebruik de optie '-w 500000 "om het venster formaat op te geven. Gebruik dezelfde versie van het FASTA referentiebestand gebruikt in stap 4.2, maar zorg ervoor dat Chrm en willekeurige chromosomen worden verwijderd uit de fasta bestand.
      gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig
   2. Gebruik generateMap.pl in HMMcopy een wiebelen bestand voor mappability genereren. Gebruik de optie "-w 40" om aan te geven te lezen lengte. Gebruik dezelfde FASTA referentiebestand gebruikt in stap 4.4.1.
      generateMap.pl -b mm9.fa
      generateMap.pl -w 40-i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig
   3. Gebruik mapCounter in HMMcopy een mappability referentiebestand voor het genoom te genereren. Gebruik de optie '-w 500000 "om het venster formaat op te geven.
      mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig
   4. Gebruik readCounter in HMMcopy een wiebelen bestand voor elk BAM bestand te genereren.
      readCounter -w 500000 example.filtered.bam> input.wig
   5. Wijzig de paden naar de referentie-bestanden in de R scripts (run_hmmcopy.mm9.r of run_hmmcopy.hg19.r), gebruikt u de bovenstaande bestanden gegenereerd in 4.4.1 (bijv mm9_gc.wig) en 4.4.3 (bijv mm9_map. pruik) voor de variabelen GFile en mfile, die verwijzen naar de GC percentage referentiebestand en mappability referentiebestand, respectievelijk. Dan start de meegeleverde R script "run_hmmcopy.mm9.r" of "run_hmmcopy.hg19.r".
      R CMD BATCH run_hmmcopy.mm9.r
      of
      R CMD BATCH run_hmmcopy.hg19.r
   6. Voor de batchverwerking van een reeks van BAM-bestanden, zet de BAM-bestanden in één map en voer de meegeleverde script "HMMpipe.pl" in het pakket aan segmenten te bellen en te berekenen variabiliteit scores (VS). Volg het formaat:
      perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles MM9
5. Ren DNAcopy om CNVs ²¹ detecteren.
   1. Gebruik SAMtools versie 0.1.19 te extraheren unieke wijze in kaart gebracht leest van elk BAM bestand.
      samtools bekijken -h-F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i "^ @ | XT: A: U" | samtools bekijken -shū -> example.mapped.bam
   2. Gebruik MarkDuplicates in Picard versie 1.94 markeren PCR duplicaten in het BAM-dossier ^22.
      java-jar MarkDuplicates.jar INPUT = example.mapped.bam uitgang = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true
   3. Gebruik coveragebed in bedtools versie 2.17.0 te tellen in kaart gebracht leest in elk van de vooraf gedefinieerde dynamische 500kb mappable ramen in de verstrekte BED bestand "mm9.500k.dynamic.win.bed" of "hg19.500k.dynamic.win.bed" ²³ .
      coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | sort -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts
   4. Gebruik de meegeleverde Perl-script "normalizeGC.pl" om de read tellingen op basis van de GC inhoud referentiebestand "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" of "hg19.500k.dynamic.win.fa normaliseren. gc.txt ".
      perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts
   5. Gebruik de meegeleverde R script "dnacopy.r" om de segmenten te bellen.
      R CMD BATCH dnacopy.r
6. Identificeer CNVs
   1. Uitsluiten cellen waarvoor de VS berekende 4.4.6 groter is dan 0,26.
   2. Filter de segmenten genoemd HMMcopy in 4.4.6 tot alleen die waarvan de gemiddelde log ₂ verhouding groter is dan 0,4 (vermeende gain) of kleiner dan -0,35 (vermeende verlies).
   3. Filter de segmenten genoemd DNAcopy 4.5.5 daarvan alleen die waarvoor het segment gemiddelde groter dan 1,32 of kleiner dan 0,6.
   4. Overlappen de segmenten van 4.6.2 en 4.6.3, roepen CNVs alleen in gebieden waar beide HMMcopy en DNAcopy identificeren van een vermeende winst of vermeende verlies.

Resultaten

De geassembleerde aspirator moet vergelijkbaar zijn met die in figuur 1A weergegeven. De naald moet zodanig worden opgesteld dat het voldoende breed om een ​​enkele cel tegemoet te komen, maar niet zo breed dat een groot volume wordt opgesteld met de single cell. Opzuigen enkele cellen eenvoudigst wanneer er één tot vijf cellen in een 10X gebied (Figuur 1B).

Als hele genoom amplificatie succesvol is, wordt het monster verschijnen als een uitstrijk op een agarosegel (Figuur 2, lanen 1, 2, 4, 5, 6 en 7). Een zwak of afwezig uitstrijkje geeft een foute amplificatiereactie en het monster moet niet worden gesequenced (Figuur 2, lanen 3 en 8).

Na bibliotheek voorbereiding moet het fragment grootteverdeling van de monsters beoordeeld door capillaire elektroforese op een fragment analyse.Met succes bereide bibliotheken een tamelijk gelijkmatige verdeling van fragment maten 150-900 bp (Figuur 3, A, B). Mislukt bibliotheek preparaat resulteert in een scheve fragment grootteverdeling en dergelijke bibliotheken niet worden gesequenced (figuur 3C).

Het verwerken van sequencing data door middel van de verborgen Markov model (HMMcopy) en circulaire binaire segmentatie (DNAcopy) zal het genoom van elke cel ontleden in segmenten van de geschatte aantal kopieën. Deze segmenten kunnen dan worden gefilterd die voor een aantal kopieën overeenstemming met winst of verlies in een enkele cel (tabel 1) te identificeren. Deze gefilterd segmenten van HMMcopy en DNAcopy moet dan worden overlapt te identificeren met veel vertrouwen CNVs.

Figuur 1. Enkele cel isolement. ( A) een samengestelde microaspirator. (B) A 10X veld tonen gescheiden cellen (pijlen) en microaspirator naald (rechtsonder). Opzuigen enkele cellen eenvoudigst wanneer er één tot vijf cellen in een 10x veld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Hele genoom versterking. Agarose gelelektroforese van 5 pl gehele genoom amplificatieproducten. Monsters die met succes amplificeren zal verschijnen als heldere vlekken van 100 bp tot 1 kb (lanen 1, 2, 4, 5, 6 en 7) en kan worden gesequenced. Monsters die niet met succes kan amplificeren zal zwakke vlekken of geen uitstrijkje (lanen 3 en 8) produceren en mag niet worden gesequenced.large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. bereiding Library. Representatieve resultaten van een fragment analysator. De grafieken tonen fragmentgrootte (in bp) op X-as en de relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) op de Y-as. Rechts van elke grafiek is een gesimuleerde gellaan. (A) de resultaten van een ideaal voorbeeld, met een gelijkmatige verdeling tussen de 150 en 900 bp en zonder scherpe pieken of neiging naar een kant. Dit monster is aanvaardbaar voor sequencing. (B) Resultaten uit een goed monster, met een grootteverdeling scheef naar lagere fragment maten. Hoewel dit niet optimaal, kan het monster nog worden gesequenced. (C) de resultaten van een mislukte monster, met overwegend kleine fragment maten. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door langdurige incubatie tijdens de tagmentation stapbibliotheek preparaat. Het monster moet niet worden gesequenced. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

HMMcopy
Monster	Segment	chr	Begin	Einde	Staat	Mediaan
D15-4998	23	chr8	144.500.001	146.500.000	6	0.5008794
D15-4998	29	chr10	67.000.001	134.500.000	6	0.4031945
D15-4998	52	chr19	1	20000000	6	0.4616884
D15-4998	57	Chry	1	59500000	2	-1,506532
DNAcopy
Monster	Chrom	Start bin	end bin	Begin	Einde	Seg gemiddelde	Seg med
D15-4998	chr10	88	197	62.612.945	129.971.511	1,4688	0,157
D15-4998	chr19	0	31	0	28.416.392	1,4141	0,1674
D15-4998	chrX	77	126	51.659.160	95.343.369	1,3548	0,1874
D15-4998	Chry	0	14	0	23.805.358	-2,7004	0,3591

Tabel 1. Gegevensanalyse. Gefilterd segmenten gegenereerd door HMMcopy en DNAcopy van een enkele cel. Overlappende Resulteert onthult een winst op chromosoom 10 67-130 Mb en een winst op chromosoom 19 van 0 tot 20 Mb. We hebben gevonden dat de voordelen op het proximale gedeelte van chromosoom 19 zijn de invloed van enkele cel ¹² sequencing.

Discussie

Traditioneel, het identificeren van CNVs en aneuploïdie op het niveau van enkele cellen nodig cytologisch methoden zoals FISH en SKY. Nu heeft enkele cel sequencing ontpopt als een alternatieve aanpak voor dergelijke vragen. Enkele cel sequencing heeft voordelen ten opzichte van FISH en SKY want het is zowel genoom-brede en hoge resolutie. Bovendien, wanneer de juiste kwaliteitscontrole methoden worden toegepast, één cel sequencing kan een meer betrouwbare beoordeling van CNVs en aneuploidy bieden want het is niet gevoelig voor de hybridisatie en het verspreiden van artefacten die inherent zijn aan vis en SKY. Echter, veel van de recente toepassingen van enkele cel sequencing niet zijn onderbouwd door een grondige evaluatie van de gevoeligheid en specificiteit van de methoden en analyses. Inderdaad, enkele analytische methoden dat door andere studies zijn geassocieerd met een hoge frequentie (> 50%) van valspositieve CNV roept ^12. De aanpak die we beschrijven is uitvoerig getest met behulp van cellen van kneigen CNV last om ware en valse ontdekking tarieven te bepalen en optimaliseren van de gevoeligheid en specificiteit van CNV detectie ^12. Met de kwaliteitscontrole en analytische methoden beschreven in dit protocol, ongeveer 20% van 5 Mb winst, 75% van 5 Mb verliezen, en alle CNV dan 10 Mb kunnen worden gedetecteerd. Hoewel de bepaling van de valse ontdekking tarief van eencellige sequencing moeilijk hebben geschat dat minder dan 25% bedragen. Dit protocol kan worden toegepast op cellen van verschillende bronnen, kan de scripts worden aangepast aan de resolutie van CNV detectie passen en het protocol kan worden aangepast aan andere soorten genomische veranderingen te identificeren.

Er zijn verscheidene middelen dissociëren verse weefsels in enkele cellen en vele publicaties beschrijven procedures geoptimaliseerd voor specifieke weefsels, zoals huid en hersenen ^{24 25.} Wij verkiezen enkele cellen isoleren microaspiration omdat hiermee fo r visuele beoordeling van elke cel te sequeneren. Het is echter ook mogelijk om enkele cellen te isoleren door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) ²⁶ en ²⁷ microfluïdische inrichtingen. Als één cel isolatie en gehele genoom amplificatie handmatig wordt uitgevoerd, is het redelijk te isoleren en amplificeren tot veertig cellen in een enkele zitting. Om een ​​hoge kwaliteit cel sequentiedata te verkrijgen, is het cruciaal dat de amplificatie van eencellige genomen uniform en volledig. We zien dat de kwaliteit van afzonderlijke cellen en die de efficiëntie van lysis en amplificatie een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van sequentiebepalingsgegevens. Als zodanig moet de cellen worden geoogst uit hun natieve omgeving juist voorafgaande aan isolatie en gehele genoom amplificatie dient onmiddellijk na cellen geïsoleerd. Bovendien moet de lysis en fragmentatie stap precies gevolgd zoals beschreven in stappen 2.3-2.6.

"> De algoritmes kan worden aangepast om de resolutie van CNV detectiewijziging, met tegengestelde effecten op de gevoeligheid en specificiteit ^12. Het is ook mogelijk om het bij te stellen om globale chromosoom aneuploidie te detecteren in de omgeving van tetraploidy ^11. We zien echter dat onze aanpak is beperkt tot het opsporen van CNVs groter dan 5 Mb, als ruis geïntroduceerd tijdens hele genoom amplificatie bemoeilijkt de opsporing van kleinere varianten ^12. Toekomstige verbeteringen in de hele genoom amplificatie benaderingen moeten uiteindelijk verbeteren van de resolutie van CNV detectie met behulp van enkele cel sequencing.

Enkele cel sequencing maakt onderzoek niet alleen kopieaantal veranderingen maar één nucleotide verschillen ^{28, 29} en ³⁰ structuurvariatie. Ons protocol voor cel isolatie kan worden toegepast op deze andere que beantwoordenstions. De keuze van hele genoom amplificatie is afhankelijk van de specifieke toepassing. De werkwijze in dit protocol, dat is gebaseerd op polymerasekettingreactie beschreven, is het meest geschikt voor het detecteren kopienummer veranderingen, omdat het wordt geassocieerd met lagere amplificatie vertekening ^32. Voor onderzoek naar andere soorten genomische veranderingen, zoals single nucleotide polymorphisms, zijn andere werkwijzen gehele genoom amplificatie aangenomen geschikter ^{31, 32} te zijn.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177
PVC-buis (ID 3/16", OD 5/16", ~1 voet)	VWR	89068-500
PVC-buis (ID 5/16", OD 7/16", ~6 inches)	VWR	89068-508
Acrodisc Spuitfilter met HT Tuffryn-membraan (diameter 25 mm, poriëngrootte 0,2 µm)	VWR	28144-040
Serologische pipet (5 mL)	BioExpress	P-2837-5	Elke plastic 5 mL pipet zou voldoende moeten zijn
Inline Water Trap voor zuurstofgebruik	Amazon.com	700220210813
Capillaire smeltpuntbuisjes (ID 0,8-1,1 mm, 100 mm lengte)	VWR	34502-99
Modelleerklei	VWR	470156-850
Petrischaal (150 mm diameter)	VWR	25384-326	Het oppervlak moet niet-klevend zijn om het aspireren van enkele cellen te vergemakkelijken
Hard-Shell Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR Plates	Bio-Rad	HSS9601	Elke 96-well PCR plaat zou voldoende moeten zijn
96-well weefselkweekplaat	VWR	62406-081	Elke 96-well weefselkweekplaat zou voldoende moeten zijn
GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit	Sigma	WGA4
Microseal 'A' Film	Bio-Rad	MSA5001
Mini plaatjescentrifuge	Thomas Scientific	1225Z37
Thermische cycler	Bio-Rad	1861096	Elke thermische cycler zou voldoende moeten zijn, zolang deze een 96-well PCR plaat kan herbergen
Agencourt Ampure Beads	Beckman Coulter	A63880
Dynamag-2 Magneet	Thermo Fisher Scientific	12321D	Elke vergelijkbare magnetische buisstrip zou voldoende moeten zijn
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1096
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-121-1012
Complete kit (geoptimaliseerd voor Roche LightCycler 480)	Kapa Biosystems	KK4845	Deze kit is geoptimaliseerd voor de Roche LightCycler 480 real-time PCR-machine. Als u een ander apparaat gebruikt, vervangt u een kit die is geoptimaliseerd voor uw apparaat.