Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Summary

Veel eiwitten voeren hun functie uit wanneer ze aan membraanoppervlakken zijn gehecht. De binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen kan indirect worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat de karakteristieke stapelvorming (rouleau) van nanodiscs, veroorzaakt door de negatieve kleuring natriumfosfowolframaat, wordt voorkomen door de binding van extrinsiek eiwit.

Abstract

Monotope eiwitten oefenen hun functie uit wanneer ze aan een membraanoppervlak zijn bevestigd, en dergelijke interacties zijn afhankelijk van de specifieke lipidensamenstelling en op de beschikbaarheid van voldoende oppervlakte om de functie uit te voeren. Nanodiscs worden gebruikt om een membraanoppervlak met gecontroleerde grootte en lipidegehalte te bieden. Bij afwezigheid van gebonden extrinsieke eiwitten zien natriumfosfowolframaat-gekleurde nanodiscs eruit als stapels munten wanneer ze van de zijkant worden bekeken door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Dit protocol is daarom ontworpen om het stapelen bewust te bevorderen; bijgevolg kan het voorkomen van stapeling worden geïnterpreteerd als de binding van het membraanbindende eiwit aan de nanodisc. In een verdere stap kunnen de TEM-beelden van de eiwit-nanodisc complexen worden verwerkt met standaard single-particle methoden om lagere resolutiestructuren te verkrijgen als basis voor hogere resolutie cryoEM-werk. Verder bieden de nanodiscs monsters die geschikt zijn voor TEM of niet-denaturerende gelelektroforese. Om de methode te illustreren, wordt Ca²⁺-geïnduceerde binding van 5-lipoxygenase op nanodiscs gepresenteerd.

Introduction

In medisch onderzoek wordt veel aandacht besteed aan membraaneiwitten, intrinsiek of extrinsiek betrokken bij diverse lipide interacties. Werken met lipide-interagerende eiwitten omvat hetzij het selecteren van een alternatief voor de lipiden, zoals detergenten, amphipols ¹ of ² kleine eiwitten, of het vinden van een alternatief membraan dat het eiwit oplosbaar en actief houdt. Lipoic membraan substituten omvatten liposomen en nanodiscs (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscs zijn near-native membraan platforms ontwikkeld door engineering van het eiwit gedeelte, ApoA-1, van de high-density lipoproteïne (HDL) die van nature in het bloed. ApoA-1 is een 243 residu-lange keten korte amfipathische α-helices en een lipide-oplosbaar vrij conformatie. In vitro als in aanwezigheid van lipiden, twee kopieën van het eiwit ApoA-1 spontaan herschikken de hydr omcirkelenophobic acylketen gedeelte van een lipide bilaag patch ^5. Gemanipuleerde versies van ApoA-1 worden over het algemeen genoemd membraan scaffolding eiwitten (MSP) en steeds zijn in de handel verkrijgbaar als plasmiden of gezuiverde eiwitten. Herhalingen of deleties van de α-helices in ApoA-1 resulteren in een langere of kortere ^{6 7} membraan steigers eiwitten. Dit maakt het weer mogelijk om schijven te vormen ongeveer 6 nm ^7-17 nm ⁸ in diameter. Er zijn verschillende soorten van de aanvragen voor de nanodiscs ^{3, 9.} De meest gebruikte toepassing is het een bijna-natieve membraan omgeving voor het stabiliseren van een integraal membraaneiwit ^8, voorheen ^{3, 9} beoordeeld verschaffen. Een minder onderzocht gebruik een nanoschaal membraanoppervlak te verschaffen voor de studie vanperifere membraaneiwitten ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} Deel 1 van het protocol hieronder visualiseert de procedure voor het maken van nanodiscs samengesteld uit fosfolipiden en membraan steigers eiwit.

Monstervoorbereiding is een knelpunt in de meeste methoden. Methode-specifieke monsters kunnen bepaalde informatie toe te voegen, maar ze ook vergelijkingen van de resultaten bemoeilijken. Daarom is het eenvoudiger wanneer monsters multimodale en kan direct worden gebruikt in verschillende methoden. Een voordeel van het gebruik van nanodiscs is de geringe omvang van de nanodisc vergeleken met liposomen (bijvoorbeeld kunnen de monsters direct worden gebruikt voor zowel TEM en niet-denaturerende gelelektroforese, zoals in het onderhavige protocol).

blaasjes en liposomen zijn lang gebruikt om de functie van membraan- interagerende eiwitten te begrijpen. Structurele studies en visualisatie, een voorbeeld van de structuurbepaling van een transmembraaneiwit in liposomen beschikbaar ^18. Echter geen hoge-resolutie 3D-structuur van een monotopic membraaneiwit ingesloten in een liposoom membraan nog niet gepubliceerd, voor zover wij weten. Goud nanodeeltjes of antilichamen kunnen worden gebruikt om eiwitten binden aan liposomen of blaasjes via TEM ¹⁹ visualiseren. Hoewel deze probes zeer specifiek zijn, kunnen ze interfereren met membraan-bindende eiwitten door veiling het membraan bindingsplaats of maskeren gebieden van belang met de flexibele onderdelen. Goud-gemerkte antilichaam gecomplexeerd of eiwitten kan waarschijnlijk worden geanalyseerd op een gel, maar dit zou de kosten van het experiment te verhogen.

Hoewel liposomen zijn een uitstekend platform, kan men niet zeker dat de pop te zijnning een bepaalde verhouding eiwit per liposoom, een eigenschap die kan worden onderzocht door het gebruik van nanodiscs ^20. In een liposoom, kan cofactoren en substraten worden gevangen in de oplosbare interieur. Stoffen die oplosbaar membraan zal hetzelfde lot beide typen membraan mimetica delen. Daar de bilaag kleiner is in nanodiscs, een kleinere hoeveelheid stof nodig is om de membranen nanodisc verzadigen.

Begrip eiwitfunctie door het bepalen van de atomaire structuur is essentieel geweest voor vele vakgebieden. Methoden voor eiwitstructuur bepaling onder X-ray ^21; kernmagnetische resonantie (NMR) ^{22, 23;} en transmissie elektronenmicroscopie (TEM) ²⁴ bij cryogene temperaturen, cryoEM. De resolutie van cryoEM is de laatste tijd sterk verbeterd, voornamelijk als gevolg van het gebruik van directe electron detectors ^{25, 26.} De macromoleculen worden afgebeeld in dunne, glasvocht ijs ²⁷ in een near-native staat. Vanwege het lage contrast van biologische moleculen, worden ze moeilijk te detecteren met afmetingen van 100-200 kDa. Voor voldoende grote monsters kan gegevensverzameling gedaan en de methode van afzonderlijke deeltjes reconstructie kan worden toegepast op een structuur ²⁸ te verkrijgen.

De bepaling van de eiwitstructuur door TEM is een meerdere stappen. Het begint meestal met de evaluatie van monster monodispersiteit door negatieve vlek TEM ²⁹ met behulp van zouten van zware metalen zoals phosphotungsten (PT) ³⁰ of ³¹ uranium. Reconstructie van een lage resolutie model van de negatief gekleurde macromolecuul wordt meestal gemaakt en kunnen belangrijke informatie opleveren over de moleculaire structuur ^29. Tegelijkertijdhet verzamelen van gegevens met behulp van cryoEM kan beginnen. Voorzichtigheid is geboden bij de beoordeling van negatieve vlek TEM gegevens naar de verkeerde interpretatie van artefact vorming te voorkomen. Eén specifiek artefact is het effect van de PT vlek op fosfolipiden en liposomen ^32, resulterend in de vorming van lange staven gelijkend stapels muntstukken van de zijkant ^33. Dergelijke "rouleau" of "stacks" (hierna aangeduid als "stacks") werden vroeg waargenomen voor HDL ^34, en later ook nanodiscs ^35.

Het stapelen en herziening van membranen kunnen optreden om vele redenen. Zo kan worden geïnduceerd door co-factoren zoals koper, getoond door TEM beeldvorming in een ammoniummolybdaat vlek ^36. Een fractie van de membraanlipiden in liposomen bevatte een iminodiazijnzuur kopgroep nabootsen metaal complexatie met EDTA, waardoor stapelen liposomen na de toevoeging van koperionen ^{36. Stapelen kan ook worden veroorzaakt door een eiwit-eiwit interacties door een eiwit in of op de lipide bilagen (gebruikte vlek niet genoemd) 37. De vorming stack van fosfolipiden door PT werd al vroeg waargenomen; echter, heeft later werkzaamheden gericht op het verwijderen of afschaffing van deze formatie artefact 38.}

Hier stellen we een werkwijze om te profiteren van de NAPT-geïnduceerde nanodisc stapelen voor de studie van membraan-bindende eiwitten door TEM. In het kort, zou eiwit bindend voor de nanodiscs voorkomen dat de nanodiscs van het stapelen. Hoewel de redenen voor het stapelen niet duidelijk is voorgesteld ³⁹ dat er een elektrostatische interactie tussen de fosfolipiden en de fosforylgroep van PT, waardoor de schijven aan elkaar kleven (Figuur 1A). De hypothese achter ons protocol is dat wanneer een eiwit bindt aan een nanodisc meeste fosfolipidenoppervlak niet beschik woordelijk voor de interactie met de PT als gevolg van sterische hindering door het eiwit. Dit zou stack vorming (figuur 1B) te voorkomen. kunnen twee conclusies worden getrokken. Ten eerste, het voorkomen van stapeling betekent dat het eiwit van belang gebonden is aan het membraan. Ten tweede kan het eiwit-ND complex worden behandeld met standaard single-deeltje verwerkingsmethoden ^{24, 40} een ruwe morfologie van het complex te krijgen. Bovendien analyseert door methoden zoals niet-denaturerende gelelektroforese of dynamische lichtverstrooiing kan worden uitgevoerd.

Om deze hypothese te tonen gebruikten we de membraan bindingseiwit 5-lipoxygenase (5LO), dat betrokken is bij vele ontstekingsziekten ^{41, 42.} Het 78-kDa eiwit vereist calciumionen te binden aan het membraan ^43. Hoewel dit membraan vereniging is onderzocht veelvuldig gebruik van liposomens = "xref"> ^{44, 45, 46} en membraanfracties ^47, deze kan niet worden gebruikt voor TEM analyse en structuurbepaling.

De bereiding van nanodiscs begint door het mengen van MSP met lipide gesuspendeerd in het wasmiddel natriumcholaat. Na incubatie op ijs gedurende 1 uur, wordt het detergens langzaam uit de reconstitutie mengsel met een adsorbens hars. Dit soort materiaal wordt vaak gemaakt van polystyreen gevormd tot kleine kralen. Ze zijn relatief hydrofoob en hebben een sterke voorkeur voor binding detergent ten opzichte van lipiden ^48. Na verwijdering van het hydrofobe kralen en uitvoeren klaring door middel van centrifugatie worden de nanodiscs gezuiverd door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). De gezuiverde nanodiscs worden gemengd met een monotopic membraaneiwit (en eventuele cofactoren) in een equimolaire ratio (ratio of meerdere voor een titratie) en worden overgelaten aan rEACT (15 min). Analyse door TEM wordt uitgevoerd door het toepassen van ul-hoeveelheden van het monster op glow-ontladen, koolstof beklede roosters en vervolgens door het uitvoeren van negatieve kleuring met NAPT uitgevoerd. Hetzelfde monster uit als de hoeveelheden werden toegepast op de TEM roosters kan worden gebruikt voor analyse door niet-denaturerende of SDS PAGE-gel-elektroforese, en door verschillende soorten activiteitsmetingen, zonder grote veranderingen.

Protocol

1. Bereiding van nanodiscs

1. Expressie en zuivering van het membraan eiwit steigers ^{8, 35}
   1. De His-tag MSP1E3D1 in de E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 stam in kolven te uiten. Bereid een 50 ml overnacht starterkweek met LB medium aangevuld met 50 ug / ml kanamycine bij 37 ° C. Verdun de nacht startercultuur in 2 L van geweldige kweekmedium gesupplementeerd met 50 ug / ml kanamycine.
   2. Groeien de cellen bij 37 ° C totdat de optische dichtheid bij 600 nm (OD ₆₀₀₎ er ongeveer 3. induceren de eiwitexpressie met 0,5 mM isopropyl-β-D-1 (IPTG) gedurende 3 uur bij 18 ° C.
   3. Bereid de lysisbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl en 10% glycerol). Voeg 1 mM TCEP onmiddellijk voor gebruik.
   4. Na 3 uur van inductie bij 18 ° C, verzamel de cellen door centrifugatie gedurende 10 min bij 4500 xgen 4 ° C. Verwijder het supernatant, wegen de geoogste cellen en hersuspenderen ze in lysisbuffer in een verhouding van 2 ml lysisbuffer per gram cellen.
   5. Lyse van de cellen door gepulste geluidsgolven (herhalingsfrequentie: 4 s ON, 4 s OFF) gedurende 3 minuten bij 80% amplitude.
   6. Centrifugeer de lysaten gedurende 20 minuten bij 49.000 xg en 4 ° C. Gooi de pellet uit deze centrifugatie.
   7. Injecteer de supernatant in een 5 ml Ni ⁺ chelerende kolom verbonden met een geautomatiseerd Vloeistofchromatografiesysteem voorkeur bewaard bij 4 ° C.
   8. Voordat de elutie (stap 1.1.9), was de kolom met buffers 1 - onder de 3 om alle eiwitten te verwijderen met uitzondering van de His-tag MSP. Monitor het eiwitgehalte bij 280 nm om de zuivering te volgen; de UV-opname bij 280 nm moet terug naar de baseline gaan na elke wasbeurt.
      1. Wassen met wasbuffer 1: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, en 1% Triton, pH 8,0.
      2. Wassen met wasbuffer 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mMNaCl, 20 mM imidazool en 50 mM natriumcholaat, pH 8,0.
      3. Wassen met wasbuffer 3: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl en 50 mM imidazool, pH 8,0.
   9. Elueer het MSP met 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCI en 500 mM imidazol, pH 8,0.
   10. Verander de buffer standaard buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl en 0,5 mM EDTA) MSP met gelfiltratie ^{8, 35;} de opbrengst per batch duurt ongeveer 7 mg L ^-1.
2. Bereiding van fosfolipiden stockoplossing
   1. Voeg 305 ul van 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC) opgelost in chloroform bij een concentratie van 25 mg / mL aan een glazen beker en verdampen van het chloroform door spoelen met een zachte stikstofstroom . Droog het lipide overnacht in een vacuümexsiccator. Opmerking: Deze stap wordt uitgevoerd om het oplosmiddel uit het lipide, dat een dunne film van lipide bladeren onderaan een bekerglas verwijderd.
   2. Resuspendeer het lipide cake in 200 pl MSP standaard buffer die 100 mM natriumcholaat door vortexen de buis tot de oplossing transparant; Dit zal een oplossing met een POPC concentratie van 50 mM te verschaffen.
      OPMERKING: 2 (lipide: detergent) ⁸ In het algemeen is de molaire verhouding van lipide detergentia op dit moment moet 1 zijn. Deze lipide-detergens mengsel kan bijna 2 maanden worden bewaard bij -80 ° C.
3. Bereiding van hydrofobe kralen voor detergensverwijdering
   1. Plaats 5 g kralen (droog gewicht) in een 50 ml buis.
   2. Was de kralen met 30 ml 100% methanol en vervolgens met 40 ml ultrazuiver water.
   3. Was de kralen met 10 ml MSP standaard buffer. Tenslotte worden opgeslagen kralen met 15 ml MSP standaard buffer bij 4 ° C.
4. nanodisc reconstructie
   1. Doseer 190 ul van MSP1E3D1 (0,124 mm) in een microfugebuis en voeg 61,5 ul van fosfolipiden voorraad-oplossing (50 mM POPC) dezelfde buis. Incubeer de reconstitutie mengsel op nat ijs gedurende 1 uur. LET OP: Dit komt overeen met een molaire verhouding van 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
   2. Voeg hydrofobe kralen aan een concentratie van 0,5 g korrels per ml reconstitutie mengsel aan de zelfassemblage te starten. Incubeer in een roterende incubator gedurende 16 uur bij 4 ° C.
   3. Na incubatie, centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 xg en 4 ° C om de precipitaten en aggregaten te verwijderen. Gooi de pellet en sla het supernatant.
   4. Equilibreren de size exclusion chromatografie kolom (gemonteerd op een geautomatiseerd Vloeistofchromatografiesysteem) met MSP standaard buffer totdat de absorptie bij 280 nm stabiel. Spuit de bovenstaande vloeistof in de kolom en het verzamelen van de piek fracties.
   5. Meet de concentratie van nanodiscs in de piekfracties bij 280 nm. Gebruik de molaire extinctiecoëfficiënt van MSP1E3D1 (ε = 29.910 cm ^{-1 -1} M) voor het berekenen van de concentratie nanodisc. Merk opaantal lipiden per nanodisc kan worden gemeten door een combinatie van radioactief gemerkte lipiden en fosfaatanalyse ⁴ of fosfaatanalyse alleen.

2. Bereiding van de Monotopic Protein 5-Lipoxygenase ³⁵

1. Bereid een overnachting starter cultuur. Supplement 50 ml LB medium met 100 ug / ml ampicilline. Beënten medium met E. coli BL21 (DE3) die het plasmide van de 5-lipoxygenase gen (ALOX5). Verdun de nacht startercultuur in expressie medium dat 42 mM Na ₂ HPO _4, 24 mM KH _{2PO 4,} 9 mM NaCl, 19 mM _NH4 Cl, 1 mM _MgSO4, 0,1 mM _CaCl2, 0,2% D-glucose, 0,1 %, 5 pM FeSO ₄ en 100 gg / ml ampicilline. Groeien de cellen tot de OD ₆₀₀ is ~ 0,5 bij 25 ° C. Induceren van eiwitexpressie met 0,2 mM IPTG gedurende 16 uur bij 20 ° C ^35.
2. Oogst door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 7000 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant. Weeg de pellet onderaan van de buis met het geoogste cellen en resuspendeer de geoogste cellen in lysisbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% glycerol en 1 mM TCEP) met proteaseremmer en 0,5 mg / ml lysozym ³⁵ in een verhouding van 2 ml lysisbuffer per gram cellen.
3. Lyseren de cellen door sonicatie gedurende 5 x 15 s bij 80% amplitude. Verwijder de celresten door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 7000 xg en 4 ° C. Voer ammoniumsulfaatprecipitatie tot 30-60% verzadiging om de eiwitten neer te slaan in de oplossing ^35. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 16.000 xg en 4 ° C. OPMERKING: De 5LO korrel kan snel worden ingevroren en opgeslagen bij -80 ° C maximaal 6 maanden.
4. Resuspendeer de pellet met 20 ml lysisbuffer en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 40.000 xg en 4 ° C.
5. Incubeer de supernatant op een ATP-agarose-kolom bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Was de kolom eenmaal met één kolom volume lysis buffer die 0,5 M NaCl. Elueer het 5LO met 20 mM ATP in lysis buffer die 10 uM FeSO ₄ en 20 ug / ml catalase. Voer gelfiltratiechromatografie de ATP ³⁵ verwijderen.
   NB: De 5LO is instabiel en moet onmiddellijk worden gebruikt na zuivering. Anders is het raadzaam om te stoppen bij de stap van het ammoniumsulfaat neerslag (zie de opmerking na stap 2.1.3).

3. Bereiding van de nanodisc-eiwit Complex

1. Bereid een totaal volume van 100 ui complex. Meng 0,8 uM en 0,8 uM ND 5LO met 1 mM Ca2 ⁺ in de MSP standaard buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA en 1,5 mM _CaCl2) en incubeer gedurende 10 min op ijs. Opmerking: Het monster kan worden opgeslagen gedurende één maand bij 4 ° C ^35.

ove_title "> 4. Analyse van de monsters

1. gelelektroforese
   1. Niet-denaturerende elektroforese
      1. Mix 15 pi van het monster met 5 gl laadbuffer (50 mM BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w / v) glycerol en 0,001% Ponceau S, pH 7,2) ⁴⁹ en laad een 4 - 16% Bis-Tris gel aan elektroforese voeren.
      2. Vul de kathode tank met licht kathode buffer (50 mM Bis Tris, 50 mM Tricine, pH 6,8 en 0,002% Coomassie G-250) en de anode tank met loopbuffer (50 mM Bis Tris en 50 mM Tricine, pH 6,8). Start de scheiding met behulp van een constante spanning bij 150 V.
      3. Stop de elektroforetische scheiding wanneer de Coomassie achterkant einde van de gel bereikt.
      4. Vlekken op de gel met een standaard Coomassie blauw protocol.
   2. denaturerende elektroforese
      1. Meng 40 pl monster met 10 gl laadbuffer bevattende SDS (0,05% (w / v) broomfenolblauw; 0,2 M Tris-HCl,pH 6,8; 20% (v / v) glycerol; 10% (w / v) SDS; en 10 mM 2-mercaptoethanol) en plaats het op een 4-20% Tris-glycine gel elektroforese voeren.
      2. Vul de kathode en anode tanks met loopbuffer (25 mM Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM glycine en 0,1% (w / v) SDS). Start de scheiding met behulp van een constante spanning bij 150 V.
      3. Stop de elektroforetische scheiding wanneer het laden kleurstof achterkant einde van de gel bereikt.
      4. Vlekken op de gel met een standaard Coomassie blauw protocol.
2. Voorbereiding van de NAPT oplossing
   1. Los 1 g fosfowolframaat natriumzout in 50 ml water door roeren bij kamertemperatuur tot een 2% (w / v) zure oplossing.
   2. Breng de pH op 7,4 met 1 M NaOH. Verwijder de deeltjes onder toepassing van een 0,22 urn spuitfilter. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur of bij 4 ° C.
3. Voorbereiding van het monster voor TEM analyse
   1. Glow-ontlading koolstof beklede koperen roosters (400 mesh) gedurende 20 s bij 30 mA tot de netwerken hydrofiele vóór de adsorptie van het monster maken. Plaats 3,5 pi van het monster (0,8 uM opzichte van de nanodiscs) op het net en incubeer gedurende 30 s. OPMERKING: De toegepaste hoeveelheid kan variëren tussen 2,5 en 5 pl, afhankelijk van de monsterconcentratie. Een geschikt concentratiegebied voor nanodiscs is 0,5-1 uM.
   2. Blot off overtollige oplossing met behulp van papieren filter.
   3. Onmiddellijk vlek het raster met een druppel van 2% NAPT gedurende 30 s. Dep het overtollige oplossing en laat het rooster aan de lucht drogen.
   4. Evalueer de roosters met TEM. Een microscoop met 120-200 keV versnellende spanning is voldoende om een ​​schatting van de omvang van het stapelen. LET OP: Voor het huidige protocol, werd een geijkt transmissie-elektronenmicroscoop gebruikt, uitgerust met een 200-keV veldemissie pistool.
   5. Noteer de TEM beelden. Voor de beelden die lange stapels, niet verder te verwerken; beelden tonen het complex van nanodiscs met extrinsieke eiwit dat een paar bevattenshortstacks, maar de meeste deeltjes in het complex. Opnemen verschillende beelden en deze werkwijze volgens standaardmethoden klasse-gemiddelden en een lage resolutie, 3 dimensionaal model van het complex te verkrijgen.
      LET OP: Voor het verzamelen van negatieve vlek data, werden roosters op minstens drie verschillende dagen. Voor elke dag, werden vers monster incubaties (zoals in stap 3.1) vóór de negatieve vlek werd toegepast.

Results

De werkwijze die we voorstellen is afhankelijk van de opstelling van nanodiscs op het membraanoppervlak voor monotopic membraan-eiwitbinding verschaffen. Aangezien er geen transmembraaneiwit ingebed in de nanodisc lipide bilaag, worden de nanodiscs hier aangeduid als "lege nanodiscs" (Figuur 2A). Deze hebben een berekend molecuulgewicht van 256 kDa voor een samenstelling van twee MSP1E3D1 steigers eiwitten en ongeveer 260 moleculen van POPC ^8....

Discussion

De werkwijze kan worden onderverdeeld in drie delen: de reconstructie van lege nanodiscs, de bereiding van eiwit-complexen nanodisc en de negatieve kleuring voor de TEM van deze complexen. Elk onderdeel zal afzonderlijk worden behandeld met betrekking tot beperkingen van de techniek, kritische stappen en nuttige wijzigingen.

Reconstructie van lege nanodiscs. Kritische stappen en beperkingen in de productie en het gebruik van nanodiscs.

Voor de bereiding van de lege ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F	JEOL
CCD camera	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger	Baltec
TEM grid: 400 mesh	TAAB	GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1	Addgene	20066
Bacteria: BL21DE3	NEB	C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose	Sigma Aldrich	A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
Lipid: POPC	Avanti polar lipids	850457C	25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin	Bio-Rad	1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm	Pall life sciences	PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate	Sigma Aldrich	31648
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad	161-0301
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
Detergent: Sodium cholate hydrate	Sigma Aldrich	C6445-10G
Sodium Cholate			500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock			50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer			20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA. Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer	Thermo Fisher Scientific	BN2001	50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer	Thermo Fisher Scientific	BN2002	50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer	Thermo Fisher Scientific	BN2003	50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer			In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer			In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth			Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL. Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.