Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Forskoline-geïnduceerde zwelling in Intestinal Organoids: An

19.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55159

⸱

11 februari 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Foundation Hubrecht Organoid Technology, 2Department of Pediatric Pulmonology, Regenerative Medicine Centre Utrecht, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Centre Utrecht, 3Department of Stem Cells and Cancer, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 4Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een assay voor het meten van CFTR-functie en CFTR-modulatorreacties in gekweekt weefsel van personen met cystische fibrose (CF). Biopsie-afgeleide intestinale organoïden zwellen op een cAMP-gestuurde manier, een reactie die defect (of sterk verminderd) is in CF-organoïden en kan worden hersteld door blootstelling aan CFTR-modulatoren.

Samenvatting

Recent ontwikkelde geneesmiddelen die de CFTR-transmembraanconductantieregulator (CFTR) moduleren, corrigeren de oppervlakte-expressie en/of functie van het mutante CFTR-kanaal bij personen met cystische fibrose (CF). Identificatie van personen die kunnen profiteren van deze geneesmiddelen is een uitdaging vanwege de uitgebreide heterogeniteit van CFTR-mutaties, evenals andere onbekende factoren die bijdragen aan de individuele geneesmiddelwerkzaamheid. Hier beschrijven we een eenvoudige en relatief snelle test voor het meten van individuele CFTR-functie en respons op CFTR-modulatoren in vitro. Driedimensionale (3D) epitheliale organoïden worden gekweekt uit rectale biopten in standaard organoïde medium. Eenmaal gevestigd, kunnen de organoïden worden gebiobankt voor toekomstige analyse. Voor de test worden 30-80 organoïden gezaaid in 96-well platen in basement membraanmatrix en vervolgens blootgesteld aan geneesmiddelen. Een dag later worden de organoïden gekleurd met calcein groen, en forskoline-geïnduceerde zwelling wordt gemonitord door confocale live cel microscopie bij 37 °C. Forskoline-geïnduceerde zwelling is volledig CFTR-afhankelijk en is voldoende gevoelig en nauwkeurig om onderscheid mogelijk te maken tussen de geneesmiddelresponsen van individuen met verschillende en zelfs identieke CFTR mutaties. In vitro zwelresponsen correleren met de klinische respons op therapie. Deze test biedt een kosteneffectieve aanpak voor de identificatie van geneesmiddelresponsieve individuen, onafhankelijk van hun CFTR-mutaties. Het kan ook instrumenteel zijn in de ontwikkeling van toekomstige CFTR-modulatoren.

Inleiding

CF wordt veroorzaakt door mutaties in het cystische fibrose transmembraan conductantie regulator (CFTR) gen dat een epitheliale anion kanaal codeert. CF treft ongeveer 85.000 mensen wereldwijd 1. Meer dan 2.000 CFTR mutaties geïdentificeerd ( www.genet.sickkids.on.ca ). Deze verscheidenheid verklaart deels een breed spectrum van de ziekte waargenomen fenotypes ( www.CFTR2.org ) 2, 3. Zes klassen van CFTR mutaties worden gedefinieerd op basis van hun effect op CFTR proteïne expressie en functie: (I) geen synthese, (II) verminderde handel, (III) defect kanaal gating, (IV) veranderde geleidbaarheid, (V) verlaagde gewoonlijk functionerend CFTR en (VI) verminderde celoppervlak stabiliteit 4. Hoewel het gemeenschappelijk CFTR mutaties goed bestudeerd, CFTR-functie en de relatie met de klinische status blijven poorly onderzocht op het niveau van het individu, met name voor de grote groep van zeldzame "orphan" mutaties ( www.CFTR2.org ) 1, 3.

Recent zijn medicijnen ontwikkeld die het CFTR-eiwit een mutatie-specifieke wijze te richten. Twee klassen van CFTR-eiwit gericht geneesmiddelen zijn klinisch gebruikt en hebben verschillende werkingsmechanismen. Potentiatoren, zoals VX-770, verbetering van de open waarschijnlijkheid van apicaal-gelokaliseerde mutant CFTR en direct werken op hun toevoeging aan cellen 5. Correctors, zoals VX-809, het herstel van de handel in endoplasmatisch reticulum-gelokaliseerde misfolded CFTR en vereisen pre-incubatie met cellen voor de effecten worden waargenomen 6. Het CFTR potentiator, VX-770, is geregistreerd bij patiënten met de G551D mutatie 7, 8, en acht andereCFTR gating mutaties, waaronder S1251N 9; samen worden deze mutaties gedragen door 5% van alle CF patiënten. Andere klinische studies hebben aangetoond dat VX-770, in combinatie met de corrector VX-809, nog aanzienlijk beperkte longfunctie en veroorzaakt een verlaging van exacerbaties bij personen die homozygoot zijn voor de mutatie F508del met 45-50% van de patiënten 10 uitgevoerd, 11.

Conventioneel klinisch onderzoek naar geneesmiddelen reagerende patiënten binnen de resterende 50% van CF-patiënten te identificeren zijn kostbaar en tijdrovend en niet haalbaar voor individuen met zeer zeldzame CFTR genotypen. Novel, kosteneffectieve, gepersonaliseerde methoden zijn van cruciaal belang voor het toenemende aantal CFTR modulators om individuen die elk type CFTR mutatie passen. Tot nu toe heeft het proces opnemen van patiëntengroepen dragen specifieke CFTR mutaties leiden door studies met behulp van mutante CFTR-gen transfectie in heterologous celsystemen, gevolgd door elektrofysiologische studies in Ussing kamers 5, 6, 12. Vanwege een gebrek aan adequate CF diermodellen geneesmiddelefficiëntie studies lucht-vloeistof-interface gedifferentieerde bronchiale epitheelcellen afkomstig van CF long explantaat materialen gebruikt voor de ontwikkeling van geneesmiddelen 13, 14, 15. Echter, de beperkte beschikbaarheid van long- explantaat weefsels en de invasieve procedures om bronchiale cellen van patiënten zonder end-stadium van de ziekte te verkrijgen belemmeren de analyse van de minder voorkomende CFTR mutaties en het voorkomen van drugstests op een persoonlijke manier. Om deze beperkingen, "easy access" weefsels, zoals colorectale organoids, nasale luchtwegen cellen en luchtwegen cellen afkomstig van geïnduceerde pluripotente stamcellen te overwinnen, worden momenteel onderzocht voor gepersonaliseerde behandelingen met geneesmiddelen.

Eerder stelden we protocollen cultuur epitheliale stamcellen vanuit gastrointestinale orgaan in de vorm van 3D organoids 16, 17. Voor het colon / rectum, omvatten de kweekomstandigheden gedefinieerde groeifactoren (Epithelial Growth Factor (EGF), gastrine, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3) en Noggin) in combinatie met kleine moleculen (nicotinamide, A83-01, en SB202190) in een basaal membraan matrix. Onder deze omstandigheden enkele stamcellen of kleine weefselfragmenten uitgroeien tot gesloten, blaas, 3D structuren gevormd door hoog-gepolariseerde epitheel met basale zijde naar buiten gericht. Alle celtypen verschijnen meestal in hun normale verhoudingen en posities. Organoids kan worden uitgebreid over lange periodes door middel van wekelijkse mechanische ontwrichting en re-plating. Zij genetisch en fenotypisch stabiel en kunnen worden opgeslagen, zodat langdurige expansie en biobanking 17. Ze zijn vatbaar vooralle standaard celbiologische / genetische manipulaties en analytische technieken ontwikkeld voor 2D-cellijnen 18.

We hebben onlangs aangetoond dat CFTR-functie gemakkelijk kan worden gemeten colorectale organoids in een forskoline-geïnduceerde zwelling (FIS) assay 19, 20. Bij blootstelling aan forskoline (FSK) of, subsidiair, choleratoxine, organoids snel toenemen hun cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) niveaus, wat weer resulteert in de opening van het CFTR kanaal 19. Organoids van gezonde individuen of van patiënten met CFTR mutaties geassocieerd met restfunctie, zullen vervolgens opzwellen als gevolg van ionen en water transport naar de organoïde lumen, de in vitro equivalent van secretorische diarree. FIS reactie van colorectale organoids bleek eerder CFTR volledig afhankelijk te zijn, zoals aangegeven door organoids afgeleid van CFTR-null individuen eennd door het gebruik van specifieke farmacologische remmers CFTR 19. Grote vakspecifieke datasets kunnen worden afgeleid binnen enkele weken na het nemen van een biopsie.

Voor de FIS-test hier in detail beschreven, organoids gekweekt uit rectale biopsies die kan worden verkregen op elke leeftijd en met slechts beperkte hinder 21. Organoids worden gepasseerd wekelijks door mechanische verbreking in enkele crypten die gemakkelijk opnieuw te verzegelen en vormen nieuwe organoids. Voor het uitvoeren van de assay FIS, ~ 30-80 van deze verstoorde kleine organoids uitgeplaat in elk putje van een 96-wells plaat 19. Op de dag van de assay worden de organoids gekleurd met calceïne groene, een fluorescerende cel-permeabel kleurstof die wordt vastgehouden binnen levende cellen, vergemakkelijkt levende imaging. Vervolgens, FSK, die intracellulaire cAMP verhoogt en daardoor activeert CFTR, wordt toegevoegd om organoïde zwelling stimuleren. Versterkers die inwerken op apicale CFTR gelijktijdig toegevoegd wet de forskoline, terwijl correctoren dat CFTR mensenhandel te herstellen worden toegevoegd 24 uur vóór de toevoeging van FSK. De organoïde zwelling wordt gekwantificeerd door een geautomatiseerde beeldanalyse dat de relatieve toename van het totale oppervlak van alle fluorescerende objecten voor elk tijdstip na forskoline toevoeging berekent.

3D organoïde zwelling biedt voor- en nadelen ten opzichte van bestaande elektrofysiologische CFTR uitlezingen in 2D cellen gekweekt luchtwegen in Ussing kamers. Een belangrijk voordeel is de doorvoer van de zwelling assay. Cellen worden gekweekt en onderzocht met behulp van een enkel type kweekmedium, en een ervaren technicus kan cultuur tot 25 organoïde monsters op een wekelijkse basis met de kwantificering ongeveer 1200 datapunten per week in 12 patiëntenmonsters. We conventioneel typt u een enkele experimentele conditie door twee- of drievoud metingen per plaat en herhaal dergelijke metingen bij drie onafhankelijke incubatietijd punten. In totaal zijn ongeveer 300-500 single organoïde structuren worden dan gemeten per experimentele conditie, waardoor zeer precieze metingen van CFTR-functie met beperkte technische variabiliteit. Dit precisie laat ons toe om duidelijke verschillen in de resterende functie en de reactie op CFTR modulators definiëren en stelt ons in staat om gemakkelijk te halen genetische achtergrond-effecten tussen patiënten dragen identieke CFTR mutaties 19, 22, 23, 24, 25. kwaliteit gegevens kunnen eenvoudig worden beoordeeld vanuit microscoop beelden. Terwijl FIS volledig CFTR-afhankelijke, is een indirecte maat resultaat voor CFTR functie, zijn uitgelezen door de koppeling van ionentransport om vloeistoftransport. Dit in tegenstelling tot directe CFTR-functie metingen in Ussing kabinet, transepitheliaal ion stromingen 26 te meten. Ussing Chambers kan de select stimulatie van apicale of basolaterale compartments (die de organoïde assay niet mogelijk); door permeabilisatie basolaterale membranen, kan de apicale CFTR-afhankelijke anion secretie selectief worden gemeten 27.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten waarbij menselijke weefsels hierin beschreven werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Universitair Medisch Centrum Utrecht (UMCU; TcBio # 14-008). Informed consent voor tissue verzameling, productie, opslag en het gebruik van de organoids werd verkregen van de patiënten in Wilhelmina Kinderziekenhuis (WKZ) -UMCU.

uitrusting verbruiksartikelen Gereedschap
Laminaire stroming kap 15 en 50 ml conische buizen Zeiss LSM 800 - Zen 2 (Blauwe editie) software voor het meten van beelden
CO 2 incubator microfugebuisjes Microsoft Excel-programma
Celcultuur Microscope (licht / optische microscoop) 0,22 urn filters
centrifuge serologische pipetten
Rolling Shaker Micropipet filtertips
4 ° C kamer of 4 ° C koelkast voor incubator cryovials
CoolCell Cell Invriezen Container
serologische Pipettor
Micropippette (1000, 200 en 20 ui)
Viaflo herhalen pipet
(Live cel) confocale microscoop
Computer
Vloeibare stikstof tank
Multichannel (200 pl)

1. Voorbereiding reagentia voor Cultuur

LET OP: Alle stappen worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast en volgende standaard richtlijnen voor het werken met celculturen. Om de vorming van mooie druppeltjes basaalmembraan matrix te vergemakkelijken, handhaven een voorverwarmde voorraad van 96-, 24- en 6-well platen in de incubator bij 37 ° C.

  1. Basale Medium Voorbereiding
    OPMERKING: Basal medium (BM) verwijst naar geavanceerde Dulbecco's Modified Eagle Medium met Ham's Nutrient Mixture F-12 (Ad-DF) aangevuld met 4- (2-hydroxyethil) -1piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), glutamine en penicilline / streptomycine (Pen / Strep).
    1. In een 500 ml Ad-DF medium fles, voeg 5 ml 200 mM glutamine, 5 ml 1 M HEPES en 5 ml pen / strep oplossingen (10.000 U / ml, 10000 ug / ml).
    2. WINKEL BM in de koelkast bij 4 ° C gedurende ten minste 4 weken.
  2. -Wnt-3A geconditioneerd medium Bereiding
    LET OP: Wnt-3A-geconditioneerd medium is gemaakt in-house using de cellijn L-Wnt-3A volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Voor het oogsten van de Wnt-3A geconditioneerd medium, verzamelen het medium blootgesteld aan de cellen gedurende één week en spin deze gedurende 5 minuten bij 450 x g om drijvende cellen te verwijderen.
    2. Filter de Wnt-3A geconditioneerd medium door een 0,22 urn filter en verdeel het in 40 ml porties in 50 ml conische buizen. Bewaar ze bij 4 ° C gedurende ten minste 4 maanden zonder verlies van activiteit.
    3. Test de activiteit van de Wnt-3A geconditioneerd medium in een TOP / FOP assay met menselijke embryonale nier (HEK) cellen die met -293 TOP- en FOP-luciferase en TK Renilla en gemeten met een Renilla -luciferase testkit volgens instructies van de fabrikant.
      LET OP: TOP-luciferase is een reporter plasmide die wild-type TCF bindende regio's bevat. Als de Wnt-3A-geconditioneerd medium actief is, wordt de Wnt-signalering geactiveerd. Beta-catenine transloceert in de kern namelijk associërenh TCF / LEF transcriptiefactoren en activeert transcriptie van het luciferase reporter induceren van een verhoging van de relatieve luciferaseactiviteit wanneer het substraat wordt toegevoegd. De FOP-luciferase wordt gebruikt als negatieve controle omdat het TCF bindende gebieden stroomopwaarts van het luciferasegen worden gemuteerd.
  3. Colon Medium Voorbereiding
    OPMERKING: Bereid en verdun alle groeifactoren en reagentia volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Gebruik klein formaat porties een vermijden vries-dooi cycli. Functionele groeifactoren zijn essentieel voor de resultaten.
    1. Bereid colon medium (CM) van BM vullen met 1x B27, 1,25 mM N-acetylcysteïne, 50 ng / ml hEGF, 5 nM gastrine, 10 mM nicotinamide, 300 ng / ml hRspo3, 100 ng / ml hNoggin, 500 uM A83-01 , 10 uM SB202190 en 100 ug / ml van een antimicrobieel voor primaire cellen.
    2. Verdeel de CM in aliquots en bevriezen bij -20 ° C gedurende maximaal 4 maanden. Ontdooi de fracties om volledige dikke darm voor te bereidenmedium (FCM) door toevoeging van 50% Wnt-3A-conditoned medium aan de CM. WINKEL FCM tot 7 dagen bij 4 ° C zonder verlies van activiteit.
    3. Voor de oprichting van een organoïde cultuur van rectale biopsies, vullen FCM met 50 ug / ml vancomycine, 50 ug / ml gentamycine en 10 uM-Rho geassocieerd opgerolde-coil-vormende eiwit serine / threonine kinase inhibitor (RhoKi). Met dit medium, genaamd isolatiemedium (IM), alleen voor de eerste 2-3 dagen in kweek.
  4. EDTA Stock Solution Voorbereiding
    1. Bereid 0,5 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), pH 8, in ultrapuur H 2 O, gesteriliseerd met een 0,22 urn filter.
  5. Manipulatie van de Basement Membrane Matrix
    1. Bereid de basaalmembraan matrix (BMM) volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    2. Dooi BMM 's nachts op het ijs.
    3. Bij het overbrengen van de BMM de fles naar een 15 ml conische buis, gebruikeen 5 ml pipet en een 15 ml conische buis voorgekoeld bij -20 ° C.
    4. Ontdooide Bewaar de BMM in een koelkast bij 4 ° C en incubeer op ijs gedurende ten minste 30-60 minuten voor gebruik.
      LET OP: Om de beste resultaten te verkrijgen, moet de BMM koud en behoorlijk gemengd voordat het inbedden crypten of organoids zijn.

2. Vaststelling van Colon Organoids van een CF patiënt Biopsie

OPMERKING: Na weefselverzameltoestel, is het belangrijk om het monster op ijs in zoutoplossing handhaven, Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg2 + (DPBS) of BM. Snelle verwerking van de biopten wordt aanbevolen, maar het is mogelijk gebleken om organoïde culturen vaststellen van biopsies op ijs bewaard gedurende maximaal 7 dagen.

  1. Laat de biopten bezinken op de bodem van een 15 ml conische buis en de bovenstaande vloeistof.
  2. Voeg 10 ml van DPBS de biopsieën en pipet op en neer 10-20 keer met een 10 ml pipet.
    OPMERKING: De pipet moet vooraf worden bevochtigd met BM voordat pipetteren de biopsie.
  3. Laat de biopten vestigen op de bodem en de bovenstaande vloeistof.
  4. Herhaal stap 2.2 en 2.3 4-5 keer totdat het supernatans helder is.
  5. Voeg 10 ml DBPs en 200 ul EDTA (0,5 M) aan de biopten en plaats de buis op een wiebelbalk platform 60-120 min bij 4 ° C.
    LET OP: incubatie tijd kan verschillen per patiënt. Als crypten worden vrijgegeven, DPBS troebel. EDTA incubatie kan worden afgerond wanneer crypten onder een microscoop worden waargenomen.
  6. Laat de crypten om zich te vestigen. Verwijder het supernatant.
  7. Neem 2 ml van BM en voeg deze toe aan een nieuwe 15 ml conische buis. Schud dit nieuwe buis handmatig zodanig dat de binnenzijde is bedekt met BM.
  8. Pipetteer vooraf bevochtigd met BM, voeg 2 ml DPBS om de buis met het biopsieën en pipet op en neer 10-20 keer.
  9. Laat de biopten om zich te vestigen en de overdracht van de DPBS met de crypten van de nieuwebuis met het 2 ml BM die bereid is in stap 2,7.
  10. Herhaal stap 2.8 en 2.9 totdat er geen crypten meer worden vrijgegeven.
  11. Spin de crypten neer op 130 xg gedurende 5 minuten bij 8 ° C.
  12. Ondertussen overdracht IM de veiligheidskast bij kamertemperatuur (RT).
  13. Verwijder het supernatant en voeg 10 ml van BM naar de crypte pellet en herhaal stap 2.11.
  14. Resuspendeer de pellet in 1 ml BM. Neem 5-10 ul en tel het aantal crypten met het blote oog onder een microscoop.
  15. Spin de crypten neer op 130 xg gedurende 5 minuten bij 8 ° C.
  16. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 55% BMM (v BMM naar v IM).
    OPMERKING: De crypten worden opnieuw gesuspendeerd in het overeenkomstige volume van 55% BMM 1 crypt per pl. Als er niet genoeg crypten, het minimale volume van de BMM is 40 pl.
  17. Voor het zaaien Pipetteer 35 ul per putje (in een 24-wells plaat). Verdeel de 35 ul van BMM in 3-5 druppels afzonderlijk Teneinde de verspreiding van gro verbeterenwth factoren in de BMM. Niet bellen creëren.
  18. Plaats en laat de plaat ondersteboven in de incubator bij 37 ° C gedurende ten minste 20 min de BMM stollen.
  19. Voeg 500 pl IM per putje en houdt deze in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  20. Vernieuw de medium om de 2-3 dagen. Verwijder de oude medium door pipetteren met een pipet P1000, het verlaten van de BMM daalt intact. voeg FCM zorgvuldig pipetteren het aan de zijde van de put, niet direct op het BMM daalt.
    LET OP: Als er geen crypten worden uitgebracht in de isolatie-protocol, centrifugeren de bovenstaande vloeistof, was de pellet 2-3 keer met BM, en resuspendeer in BMM. Neem de overgebleven weefsel en snijd deze in kleine stukjes met een scheermes. Innen deze in een 15 ml conische buis, centrifuge hen en resuspendeer ze in dezelfde BMM. Indien epitheliale stamcellen aanwezig zijn, zullen deze ook organoids genereren.

3. Passage van Colon Organoids voor Maintenance, bevriezen, en voorskolin-geïnduceerde zwelling Assay (FIS)

OPMERKING: Elke organoïde cultuur heeft zijn eigen verdubbeling tijd. Normaal gesproken kan colorectale CF organoids worden uitgebreid 1: 3-1: 5 keer per 7-10 dagen. Het is een goed teken als ontluikende structuren worden waargenomen. Colorectale CF organoids minder cystic (Figuur 2A - 2C) dan colorectale normale organoids (figuur 2D). Voor opzetten en onderhouden, organoids gekweekt in 24-putjesplaten; te vriezen, in 6-well platen; en de FIS assay in 96-well pasteien.

  1. Passage van Organoids
    1. Houd de BMM op ijs gedurende ten minste 30-60 min alvorens het te gebruiken.
    2. Houd de FCM bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
    3. Label een 15 ml conische buis met de naam monster en een andere buis als "gewassen."
    4. Zorgvuldig aspireren het medium uit de putjes met een P1000 pipet zonder de BMM daalt.
    5. Voeg 1 ml BM tot 1 goed en break de BMM daalt met behulp van een P1000 pipet. Breng deze 1 ml in de 15 ml conische buis met de naam monster.
    6. Was de put met een andere 1 ml BM en overbrengen naar dezelfde 15 ml buis.
    7. Herhaal stap 3.1.5 en 3.1.6 met 5 meer putjes (maximaal 6 putjes van een 24-wells plaat wordt over een 15 ml conische buis wordt gewassen).
    8. De buis wordt tot 12 ml met BM. Pipet op en neer met een vooraf bevochtigde 5 ml pipet.
    9. Spin bij 85 xg gedurende 5 minuten bij 8 ° C.
    10. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml van BM aan de pellet. Met dezelfde P1000 pipet tip, neem een ​​P10 tip zonder filter, en pipet op en neer 20 keer. Gooi zowel de P1000 en P10 tips.
    11. Voeg 4 ml van BM met een 5 ml pipet en houd de buis gekanteld op ongeveer 70 ° van de verticale naar één kant. Pre-nat een nieuwe P1000 tip en meng krachtig 2-3 keer met de P1000 (1 ml volume).
    12. Tel tot 10, terwijl die nog in de gekantelde positie, het verzamelen van de bovenste laag voorzichtig wet de P1000 pipet en overdracht 4 x 1 ml in de buis aangeduid als "gewassen."
    13. Let op de organoids afwikkeling van de bodem in de gekantelde buis; ongestoorde organoids en grotere brokken zal zinken naar de bodem. Centrifugeer de 15 ml "gewassen" buis gedurende 5 minuten bij 85 xg en 8 ° C.
    14. Verwijder het supernatant en voeg de vereiste hoeveelheid medium en BMM de organoïde pellet tot een uiteindelijke concentratie van 55% BMM. Meng door op en neer pipetteren zonder dat bellen (figuur 3B).
      OPMERKING: Een goede dichtheid wordt bereikt door zaaien 25-30 organoids in 10 pl BMM.
    15. Volg stap 2,17-2,19.
  2. Passage voor het invriezen
    1. Houd de BM in ijs gedurende ten minste 30-60 minuten voor gebruik. Houd de FCM bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
    2. Bereid FCM aangevuld met RhoKi (stap 1.3.3).
    3. Neem trypsine uit de koelkast en laat het op kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten voor gebruik.
    4. Volg de stappen 3.1.5-3.1.10.
    5. Verwijder zoveel mogelijk supernatant, voeg 4 ml trypsine, en vortex gedurende 30 seconden.
    6. Plaats de buis in een warmwaterbad bij 37 ° C gedurende 1 min en vortex krachtig gedurende 30 seconden.
    7. Inspecteer de oplossing in de buis. Als intact organoids zijn nog steeds zichtbaar onder de microscoop, herhaalt u stap 3.2.7.
    8. Wanneer de organoids verstoord, voeg 8 ml BM de trypsine en pipetteer 10 maal neutraliseren.
    9. Spin gedurende 3 min bij 450 xg bij 8 ° C.
    10. Verwijder het supernatant en voeg de vereiste hoeveelheid medium en BMM de organoids een 55% BMM oplossing. Meng door en neer te pipetteren zonder dat er bubbels.
      LET OP: Voor het vriespunt, moet organoids worden gezaaid in een verhouding 1: 1 na behandeling met trypsine.
    11. Zaad 250 pl in een enkel putje van een voorverwarmde 6-well weefselkweekplaat, produceren kleine, gescheiden druppeltjes ~ 10 pi. Plaats de plaat ondersteboven in de incubator bij 37 ° C en laat deBMM stollen gedurende 20-30 min.
    12. Voeg 2,5 ml vers FCM + RhoKi iedere 6-well plaat goed en breng de plaat naar de incubator (figuur 3C).
  3. Passage Organoids voor de FIS Assay
    Opmerking: Afhankelijk van het aantal en de grootte van de organoids, tussen 4 en 6 putjes van een 24-wells plaat voldoende zaaien 27 putjes van een 96-wells plaat.
    1. Verwerk de organoids zoals beschreven van stap 3.1-3.1.13.
    2. Resuspendeer de pellet in 120 ui 50% BMM.
    3. Bevestig het aantal organoids (30-50) in een 3 ui BMM daling onder de microscoop.
    4. De plaat organoids met een druppel van 3 ul in het midden van elk putje van een 96 putjes paté.
    5. Plaats de plaat in de 37 ° C incubator gedurende 15 min voor het BMM stollen; verdere stappen worden beschreven in stap 6.1.1.

4. Invriezen Colon CF Organoids

LET OP: OrganOID's zijn klaar om te worden ingevroren 1-2 dagen na de behandeling met trypsine en het kweken, zodat organoids zullen nog klein, die na ontdooien van de efficiëntie van de overleving vergroot zijn.

  1. Voeg 1 ml BM en breken de BMM druppels met een P1000 pipet. Over te dragen aan een 15 ml conische buis.
  2. Was de put met een andere 1 ml BM en transfer naar dezelfde 15 ml buis.
  3. Herhaal de stappen 4,1 en 4,2 met alle putjes.
    OPMERKING: Om overtollige BMM voorkomen, 3 putjes van een 6-wells plaat worden samengevoegd in een 15 ml buis.
  4. Vul de 15 ml buis met het organoids met 12 ml koud BM en de pipet op en neer met een 5 ml pipet. Laat de buis op ijs gedurende 5 minuten.
  5. Spin gedurende 3 min bij 450 xg en 8 ° C en de bovenstaande vloeistof.
  6. Los de pellet van organoids met het bevriezen van middelgrote en pipet op en neer om de organoids goed te mengen.
    OPMERKING: 500 pl ijskoud medium wordt gebruikt per 100 ui BMM.
  7. Met een 5 ml pipet, breng 0,5 mlorganoids gesuspendeerd in de vrieskou medium tot cryogene flacons steriel.
  8. Breng de flesjes een cel bevriezing en plaats het op -80 ° C.
  9. Na 24 uur en spoel de flesjes voor opslag in vloeibare stikstof.

5. Vaststelling van Culturen van Frozen Organoids

LET OP: Ontdooi de BMM op ijs en houd het op ijs. Laat de BM bereiken RT, en warm een ​​10 ml aliquot tot 37 ° C alvorens de procedure van ontdooien een cryovial.

  1. Ontdooi de ampul snel door beweging in een 37 ° C waterbad totdat er nog iets bevroren materiaal.
  2. Breng de ontdooide organoids een 15 ml conische buis met een P1000 pipet.
  3. Direct daarna voeg 1 ml warm BM druppelsgewijs onder schudden de bodem van de buis. Zodra de 1 ml medium wordt toegevoegd, meng goed door en neer te pipetteren een paar keer om de bevriezing medium te verdunnen.
  4. Langzaam (druppelsgewijs) toe te voegen 9 ml warm BM aan de conische buis Containing de organoids. Omkeren een paar keer.
  5. Draai de celsuspensie gedurende 3 minuten bij 85 xg en 8 ° C.
  6. Verwijder het supernatant voorzichtig, zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de organoïde in 90 pi aangevuld met FCM RhoKi (stap 1.3.3). Voeg vervolgens 110 ul van BMM.
  7. Voeg 35 ul aan elk putje van een voorverwarmde 24-well plaat, waardoor kleine, gescheiden druppeltjes.
  8. Breng de plaat om de 37 ° C incubator, waardoor de plaat op zijn kop naar beneden voor 20-30 min.
  9. Voeg 500 ul van FCM met RhoKi aan elk putje en de plaat te dragen naar de incubator (Figuur 4A - 4C).
  10. Zodra organoids naar behoren uit ontdooien hersteld, verdunnen in meer BMM zodat elk 10 ul van BMM bevat 25-30 organoids. Deze procedure kan worden uitgevoerd 2-3 dagen na ontdooiing (Figuur 4D - 4G) en zorgt voor de goede groei van de organoïde.

6. Forskolin-geïnduceerde zwellingzeggen (FIS)

OPMERKING: FSK titratie maakt de meting van CFTR restfunctie. Voor CFTR modulatie worden organoids blootgesteld aan een bepaalde corrector (bijvoorbeeld, VX-809) en / of versterkingsmiddel (bijvoorbeeld VX-770), afhankelijk van het genotype. Gewoonlijk, VX-809 toegevoegd wordt 18-24 uur voor de meting, terwijl VX-770 en FSK toegevoegd net voordat de metingen. Wees ervan bewust dat sommige modulators (correctoren / versterkers) kan binden aan het plastic oppervlak van de testplaat.

  1. Plating voor Assay
    OPMERKING: VX-809 voorraden worden in porties verdeeld in 20 mM en bij -80 ° C. Bij het ontdooien, laten bij kamertemperatuur en bescherming tegen licht.
    1. Verwerk de organoids zoals beschreven in paragraaf 3.3.
    2. Wanneer het testen van de VX-809 corrector, stelt een dosis-response curve in triplo met de volgende concentraties: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 en 30 uM. Maak de verdunningen in FCM.
    3. De 96-well plaat, voeg ofwel 100 μ; L van FCM met de respectievelijke VX-809 concentratie of 100 ul FCM alleen en incubeer de plaat.
  2. Meten Assay
    LET OP: VX-770 voorraden worden in porties verdeeld in 20 mM, terwijl FSK is op 10 mM; beide opgeslagen bij -80 ° C. Bij het ontdooien, laten bij kamertemperatuur en bescherming tegen licht.
    1. Neem een ​​flesje van calceïne en DMSO en laat bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
    2. Voeg 5,1 pl DMSO aan het flesje waar de calceïne wordt geleverd als poeder, ongeopend. Gebruik anders een reeds gesuspendeerd calceïne flacon met 2,5 ul van calceïne.
    3. Voeg 2,5 ul van calceïne tot 580 ul van BM in een 1,5 ml tube en labelen.
    4. Voeg 10 ul van deze kleurstofoplossing (BM + calceïne) aan elk putje met een herhaling pipet.
    5. Resuspendeer eenmaal met een meerkanaals zodat de kleurstof goed gemengd.
    6. Incubeer de plaat in een 37 ° C incubator gedurende 30 minuten.
    7. Tijdens de calceïne incubatie, beginnen met de voorbereiding van de FSKen VX-770 oplossingen, indien nodig.
    8. Bij gebruik van een VX-770 potentiator, stelt een dosis-response curve in drievoud met de volgende concentraties: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 en 30 uM. Bij een FSK titratie, de concentraties: 0, 0,008, 0,02, 0,05, 0,12, 0,32, 0,8, 2,0 en 5,0 pM. Maak de verdunningen in BM.
      OPMERKING: Bij FSK, VX-770, of andere geneesmiddelen toegevoegd op de tweede dag, de verdunningen moeten met 2x eindconcentratie, aangezien 100 pl FSK / geneesmiddel titratieoplossing ontvangt elke worden putje toegevoegd, die reeds 100 pl bevatten van FCM.
    9. Breng de FSK en VX-770-oplossingen, een P200 pipet, en tips om de microscoop kamer.
    10. Voor het afbeelden van de FIS-test, gebruik dan een live-cell imaging confocale microscoop uitgerust met een geautomatiseerde podium, een verwarmde kamer, en de CO 2 stroom.
      OPMERKING: De volgende stappen verwijzen naar een specifiek microscoop. Verschillende instellingen moeten gelden voor andere microscopen volgende fabrikantinstructies.
    11. Zet de 96-wells plaat in de plaathouder.
    12. Voer de instellingen voor confocale beeldvorming.
      1. Stel de levende beeldvormingstechniek tot 37 ° C en 5% CO2 en laat de kamer vooraf incubeer gedurende minimaal 30 minuten vóór de meting.
      2. Gebruik de optie 'Smart setup "om de Alexa Fluor-488 track te selecteren.
      3. Stel de 5X lens en scangebied om 0.6x om uit te zoomen en vastleggen van de gehele ook.
      4. Pas de laservermogen en detector gevoeligheid voor de optimale detectie van calceïne-groen gelabelde organoids over de achtergrond in te schakelen. Pengat kan worden verhoogd tot 130 urn en de beelduitmiddel kan worden ingesteld op 2.
      5. Stel de bitdiepte op 8 en de framemaat tot 512 x 512.
      6. Gebruik de optie tijdreeksen aan de meettijd, frequentie en intervallen.
        LET OP: Voorgesteld voor regelmatige metingen: 1 uur 10 min interval: cycli = 7 (cyclus 1 is T = 0). Voor het meten van een verminderde zwelling, organoids kunnen worden afgebeeld tot 3 uur.
      7. Gebruik de optie tegel aan de individuele goed posities handmatig te bepalen.
    13. Voeg 100 ul van de FSK en / of VX-770 oplossingen voor de corresponderende putjes, volgens dezelfde volgorde als de meting. Beginnen met het toevoegen van de oplossingen in de eerste afgebeeld goed en ga verder met de beeldvorming bestelling.
    14. Start de meting.
    15. Nadat het experiment is voltooid, sla het bestand op.
  3. Analyse van FIS analysegegevens
    1. Een "organoïde analyse" macro voor gegevensanalyse van de FIS assay met het analyseprogramma per beeldanalyse software dat alle structuren afgebeeld door Alexa-488 nummer herkent en vult de geïdentificeerde structuren voor de toename van totale organoïde ruimte boven de berekening verschillende tijdstippen.
    2. Open het bestand met de verworven beelden in de beeldanalyse-programma.
    3. Selecteer de macro voor organoïde analyse.
    4. Stel de drempel voor de signaal-ruisverhouding in een goed evenwicht op tijdstip 1 en controleer of alle organoïde structuren worden herkend en gevuld.
      1. Aankomst 4-6 putten of alle structuren bestaan ​​op tijdstip 7. erkend Iets wijzigen van de drempel zodat de achtergrondsignalen op tijdstip 7 niet worden herkend als structuren (de specifieke drempel enigszins veranderen tussen experimenten).
    5. Stel de criteria van minimale oppervlaktegrootte van erkende voorwerpen 1000 um 2.
    6. Druk op "analyseren" om te beginnen. De analyse duurt ongeveer 3 minuten, afhankelijk van de gebruikte software.
    7. Wanneer de software is voltooid, gaat u naar "create table" en selecteer de volgende gegevens: zowel nummers (tabel moet toenemen in deze volgorde), tijdstippen, en de totale oppervlakte per putje.
    8. Bestand opslaan als een .xlm naar een spreadsheet programma om te exporteren.
    9. In dit programma, het berekenen van de relatieve toename van de oppervlakte per well door het gebied van tijdstip 1 bij 100%. Bereken de oppervlakte onder de curve (AUC) van tijdstippen 1-7 per conditie; de ondergrens van het gebied (Y-waarde) ingesteld op 100%. FSK of geneesmiddel titraties (X-as) uitgezet tegen de AUC (Y-as).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1A toont een representatief verse isolatie van crypten ingesloten op BMM. De crypten zijn afkomstig uit een colorectale biopsie van een CF onderwerp. Gewoonlijk wordt een organoïde gegenereerd uit elke crypt (Figuur 1 A - C). Door het disfunctioneren van het CFTR meeste colon CF organoids niet blaas, maar zijn compact en met uitsteeksels en oculaties (Figuur 2A - 2B). Echter, sommige CF organoïde ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier bieden we een compleet protocol voor de opwekking, expansie, invriezen en ontdooien van menselijke colorectale organoids. Terwijl we de menselijke organoïde culturen enige tijd geleden 17 hebben vastgesteld, is het soms moeilijk gebleken om de technologie in andere labs te vestigen zonder hands-on training. We verwachten dat deze protocollen een dergelijke opleiding zal vervangen.

-Wnt-3A geconditioneerd medium is een van de meest cruciale reagentia om te slagen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Hans Clevers is een uitvinder op patenten voor organoïdcultuur en de Forskolin-geïnduceerde zwellingstest. Jeffrey M Beekman is een uitvinder op een patent voor de Forskolin-geïnduceerde zwellingstest. Sylvia F Boj en Robert Vries zijn in dienst bij de Stichting Hubrecht Organoid Technology (HUB), die de exclusieve licentie heeft voor de Organoid-technologie. Verder hebben de auteurs niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de HIT-CF-programma van de Nederlandse CF Stichting (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), het Wilhelmina Kinderziekenhuis Research Fund en CZ en Zilverenkruis / Achmea. We willen graag bedanken S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, en G. Berkers (Department of Pediatric Longziekten, Wilhelmina Kinderziekenhuis, UMC Utrecht), en RHJ Houwen (Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Children's Hospital, UMC Utrecht) voor het naderen van de patiënten en het krijgen van de biopsieën voor het genereren van een CF Biobank.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen#12634bewaard bij 4 °C
GlutaMaxThermo Fisher Scientific:  Invitrogen#35050bewaard bij 4 °C
HepesThermo Fisher Scientific:  Invitrogen# 15630-056bewaard bij 4 °C
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific:  Invitrogen#15140-122bewaard bij -20 °C
96 well culture plateCellstar#655180
24 well culture plateCellstar#662160
6 well culture plateCellstar#657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)Life Technologies: Gibco#14190-094bewaard bij 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen#31966-021Voor Wnt-3A Conditioned Medium Productie. Opgeslagen bij 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)Bovogen#SFBS LOT#11113Voor Wnt-3A Conditioned Medium Productie. Opgeslagen bij -20 °C
L Wnt3A cell lineATCC#CRL-2647Voor Wnt-3A Conditioend Medium Productie.
TOP/FOP plasmidsMillipore #17-285Voor het meten van Wnt-activiteit
pTK-RenillaPromega #E2241Voor het meten van Wnt-activiteit
HEK-293ATCC#CRL-1573Voor het meten van Wnt-activiteit
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromega #E1910Voor het meten van Wnt-activiteit
Zeocin Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen#R250-01Voor Wnt-3A Cellijn selectie
B27 supplement Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen#17504-044bewaard bij -20 °C
N-AcetylcysteïneSigma Aldrich#A9165-5Gbewaard bij -20 °C
NicotinamideSigma Aldrich#N0636bewaard bij -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)PrepoTech#AF-100-15bewaard bij -20 °C
GastrineSigma Aldrich#G9145bewaard bij -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) Tocris#2939bewaard bij -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)Selleckchem#S1049bewaard bij -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)Sigma Aldrich#S7067bewaard bij -20 °C
PrimocinInvivoGen#ant-pm-1bewaard bij -20 °C
Human Noggin (hNoggin)PrepoTech#120-10Cbewaard bij -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3)R&D Systems#3500-RS/CFbewaard bij -20 °C
VancomycineSigma Aldrich#861987- 250mgbewaard bij -20 °C
GentamicineLife Technologies: Gibco#15710-049bewaard bij -20 °C
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Sigma Aldrich#431788Opgeslagen bij 4 °C
MatrigelCorning#354230bewaard bij -80 °C
TryplE Express Life Technologies: Gibco#12605-010voor het trypsiniseren van organoïden voor bevriezing
Recovery Cell Culture Freezing MediumLife Technologies: Gibco#12648010voor bevriezing
CalceinLife Technologies: Gibco#C3100MPbewaard bij -20 °C
ForskolineR&D Systems#1099-50 mgbewaard bij -80 °C
Lumacaftor (VX-809)Selleckchem#s1565bewaard bij -80 °C
Ivacaftor (VX-770)Selleckchem#s1144bewaard bij -80 °C
Naam van Reagens/MateriaalSolventStockconcentratieEindconcentratie
GlutaMax200 mM2 mM
Hepes1 M10 mM
Penicillin/Streptomycin10K U/ml 10K µg/ml100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin 100 mg/ml 125 µg/ml
B27 supplement 100x1x
N-AcetylcysteïneMiliQ H2O500 mM
NicotinamideDPBS1 M10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)DPBS 0.1% BSA0.5 mg/ml50 ng/ml
GastrineDPBS100 µM10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) DMSO5 mM500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)DMSO10 mM10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)

Referenties

  1. De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
  2. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
  3. Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45 (10), 1160-1167 (2013).
  4. Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67 (2), 117-133 (2000).
  5. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106 (44), 18825-18830 (2009).
  6. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
  7. Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  8. Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
  9. De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
  10. Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2 (7), 527-538 (2014).
  11. Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
  12. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13 (1), 29-36 (2014).
  13. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
  14. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  15. Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
  16. Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  19. Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19 (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1 (1), e27112(2014).
  21. Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91(2013).
  22. Ommen, D. D. Z. -V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15 (2), 158-162 (2016).
  23. Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. , (2016).
  24. Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. , (2016).
  25. Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8 (344), 344ra84(2016).
  26. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
  27. Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266 (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
  28. Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
  29. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  30. Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48 (3), 768-779 (2016).
  31. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
  32. Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192 (10), 1252-1255 (2015).
  33. Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

CFTR-modulatorenconfocale microscopiebasaalmembraanmatrixcalceïne-groene kleuringdrugrespons-assayorganoïdkweekVX770-behandeling
Forskoline-geïnduceerde zwelling in Intestinal Organoids: An
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.