Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca 2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca 2+ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Naast hun essentiële rol bij het genereren van ATP, mitochondriën ook als lokale calcium (Ca2 +) buffers strak reguleren de intracellulaire Ca2 + -concentratie. Om dit te doen, mitochondriën gebruik maken van de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (ΔΨ m) naar sekwestreren Ca 2+. De instroom van Ca 2+ in de mitochondriën stimuleert drie snelheidsbeperkende dehydrogenases van de citroenzuurcyclus, het verhogen van elektronen overdracht via de oxidatieve fosforylering (OXPHOS) complexen. Deze stimulatie stelt ΔΨ m, die tijdelijk wordt opgenomen als positieve calciumionen steekt de binnenste mitochondriale membraan in de mitochondriale matrix.
We beschrijven hier een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met behulp van confocale microscopie. Doordringbaar door de cellen, mitochondriale Ca2 + kanworden gemeten met de fluorescerende Ca2 + indicator Fluo-4, AM, met bepaling van de ΔΨ m met de fluorescente kleurstof tetramethylrhodamine, methylester, perchloraat (TMRM). Het voordeel van dit systeem is dat er zeer weinig spectrale overlap tussen de fluorescerende kleurstoffen, waardoor accurate meting van mitochondriale Ca2 + en m gelijktijdig ΔΨ. Met de opeenvolgende toevoeging van Ca2 + aliquots, mitochondrial Ca2 + opname kan worden gevolgd, en de concentratie waarbij Ca2 + induceert mitochondriale permeabiliteit transitie en het verlies van ΔΨ m bepaald.
Inleiding
Mitochondriën spelen een belangrijke rol in het reguleren van intracellulaire Ca2 + -concentratie door als lokale Ca2 + buffers 1. Ca 2+ komt in de mitochondriën via het Ca 2+ uniporter, een proces gedreven door de elektrochemische gradiënt die over het mitochondriale binnenste membraan (ΔΨ m) 2 bestaat. Eenmaal in de mitochondriale matrix, kunnen Ca2 + oxidatieve fosforylatie activeren door het stimuleren drie snelheidsbeperkende dehydrogenases van de citroenzuurcyclus 3. Deze stimulatie stelt ΔΨ m, die tijdelijk wordt ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van Cellen
- Kweek cellen op 10 cm celcultuurschalen of 75 cm2 kolven in kweekmedium [10 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagles Medium (DMEM) aangevuld met 5% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1 x penicilline / streptomycine (P / S )] bij 37 ° C / 5% CO2.
- Om cellen te oogsten, verwijder media door aspiratie, daarna wassen met 5 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS). Verwijderen 1x PBS door afzuigen, voeg 1,5 ml 0,25% (w / v) Trypsine / 0,25% (w / v) ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 2 min. Tik gerecht of de kolf voorzichtig om cellen te verwijder....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We hebben dit protocol gebruikt om de gevolgen van een MT-ND5 mutatie op het vermogen van mitochondriën 143B verhogingen buffer calcium 12 onderzocht. In het hier getoonde voorbeeld, werden controle 143B cellen opgeladen met TMRM en Fluo-4, AM voor permeabilisatie met digitonine. Na 5 min imaging, acht achtereenvolgende toevoegingen van een 1: 100 verdunning werden van 40 mM CaCl2 exogeen gemaakt met de laatste vrije Ca2 + ionconcent.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Calcium speelt een cruciale rol in vele celprocessen, waaronder spiercontractie, neuronale signalering en celproliferatie 13. Toename in cel calciumconcentraties worden vaak geassocieerd met energievraag, met calcium rechtstreeks kan stimuleren mitochondriale oxidatieve fosforylering ATP generatie 3 verhogen. Het is daarom van essentieel belang dat we de mogelijkheid hebben om effectief toezicht mitochondriale calcium accumulatie en om te kunnen vergelijken hoe deze functi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Wij danken Dr Kirstin Elgass en Dr Sarah Creed uit Monash Micro Imaging voor technische bijstand, en de Wellcome Trust en de Medical Research Council UK voor financiële steun. MMcK wordt ondersteund de Australian Research Council Future Fellowship Scheme (FT120100459), de William Buckland Foundation, The Australian Mitochondrial Disease Foundation (AMDF), The Hudson Institute of Medical Research en Monash University. Dit werk werd ondersteund door de Victoriaanse regering operationele infrastructuur Regeling.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| foetaal bovien serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x fosfaatgebufferd zoutoplossing (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicilline/streptomycine (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0,25% Trypsine/0,25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well kamer met dekglas | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malaat | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamaat | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ vrije Hank's gebufferde zout oplossing (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrodamine, methyl ester, perchloraat (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfaat (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluormethoxyfenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonine | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargine | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm celkweek schaaltjes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 celkweekkolven | Corning | COR430641 |
Referenties
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology. 23, 84-94 (2008).
- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
- Bhosale, G., S....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
