Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Samenvatting

Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ _Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca ^2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca ²⁺ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 ⁺ opname en ΔΨ _m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.

Samenvatting

Naast hun essentiële rol bij het genereren van ATP, mitochondriën ook als lokale calcium (Ca2 ⁺⁾ buffers strak reguleren de intracellulaire Ca2 ⁺ -concentratie. Om dit te doen, mitochondriën gebruik maken van de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (ΔΨ _m) naar sekwestreren Ca ^2+. De instroom van Ca ²⁺ in de mitochondriën stimuleert drie snelheidsbeperkende dehydrogenases van de citroenzuurcyclus, het verhogen van elektronen overdracht via de oxidatieve fosforylering (OXPHOS) complexen. Deze stimulatie stelt ΔΨ _m, die tijdelijk wordt opgenomen als positieve calciumionen steekt de binnenste mitochondriale membraan in de mitochondriale matrix.

We beschrijven hier een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 ⁺ opname en ΔΨ _m in levende cellen met behulp van confocale microscopie. Doordringbaar door de cellen, mitochondriale Ca2 ⁺ kanworden gemeten met de fluorescerende Ca2 ⁺ indicator Fluo-4, AM, met bepaling van de ΔΨ _m met de fluorescente kleurstof tetramethylrhodamine, methylester, perchloraat (TMRM). Het voordeel van dit systeem is dat er zeer weinig spectrale overlap tussen de fluorescerende kleurstoffen, waardoor accurate meting van mitochondriale Ca2 ⁺ en _m gelijktijdig ΔΨ. Met de opeenvolgende toevoeging van Ca2 ⁺ aliquots, mitochondrial Ca2 ⁺ opname kan worden gevolgd, en de concentratie waarbij Ca2 ⁺ induceert mitochondriale permeabiliteit transitie en het verlies van ΔΨ _m bepaald.

Inleiding

Mitochondriën spelen een belangrijke rol in het reguleren van intracellulaire Ca2 ⁺ -concentratie door als lokale Ca2 ⁺ buffers ^1. Ca ²⁺ komt in de mitochondriën via het Ca ²⁺ uniporter, een proces gedreven door de elektrochemische gradiënt die over het mitochondriale binnenste membraan (ΔΨ _m) ² bestaat. Eenmaal in de mitochondriale matrix, kunnen Ca2 ⁺ oxidatieve fosforylatie activeren door het stimuleren drie snelheidsbeperkende dehydrogenases van de citroenzuurcyclus ^3. Deze stimulatie stelt ΔΨ _m, die tijdelijk wordt opgenomen als positieve calciumionen steekt de binnenste mitochondriale membraan in de mitochondriale matrix. Als de Ca2 ⁺ -concentratie in de mitochondriën erg hoog wordt, kan mitochondriale permeabiliteitsovergang worden gestart, waardoor de dissipatie van ΔΨ _m, de cessation van oxidatieve fosforylering en de inductie van celdood signaalroutes ^4.

De belangrijke rol die de mitochondriën spelen in de ruimtelijke buffering van cellulaire calcium maakt de nauwkeurige monitoring van mitochondriale calcium kritisch. Verschillende methoden zijn vastgesteld mitochondriale calcium, waaronder het gebruik van rhodamine gebaseerde kleurstoffen controleren. Een dergelijke kleurstof, Rhod-2, AM, is zeer effectief in verdeling naar de mitochondriën mitochondriale Ca2 ⁺ niveaus ^{5 meten 6.} Wel moet erop worden gebruikt als een kleurstof ophopen in andere organellen, zoals liposomen of blijven in de cel cytosol. Niettemin kan stroomafwaarts analyses worden gebruikt om deze signalen te onderscheiden van die van de mitochondriën ^7.

Een andere techniek om mitochondriale calcium monitoren gebruikt fluorescente reporter constructen ⁸ up>. Het voordeel van deze genetisch gecodeerde probes is dat ze specifiek naar de mitochondriën kan worden gericht door endogene N-eindstandige peptiden, bijvoorbeeld de N-terminale targeting signaal menselijke COX subeenheid VIII. Dit systeem is gebruikt om een mitochondriaal aequorine gerichte probe die uiterst nuttig voor het onderzoeken van mitochondriale calcium signaling ⁹ is gebleken genereren. Het belangrijkste nadeel van deze genetisch gecodeerde probes is dat ze moeten in de cellen door tijdelijke expressie worden ingevoerd (die niet haalbaar is voor bepaalde celtypes en kunnen variabele resultaten) of door stabiele expressiesystemen (die tijdrovend).

Om de hierboven geschetste problemen te omzeilen, hebben we een nieuw protocol ontwikkeld om mitochondriale Ca ²⁺ en ΔΨ _m gelijktijdig meten. Dit protocol is gebaseerd op een eerder beschreven methode exogeen calcium bijdraagt ​​aan gepermeabiliseerde cellens = "xref"> 10. Ons protocol heeft drie belangrijke voordelen ten opzichte van andere methoden: ten eerste maken we gebruik van Fluo-4, AM en TMRM om mitochondriale Ca ²⁺ en ΔΨ _m, twee kleurstoffen die zeer verschillende spectrale eigenschappen volgen; ten tweede worden de cellen permeabel gemaakt zodat de Fluo-4 signaal alleen detecteert mitochondriale Ca2 ⁺ en Ca2 ⁺ niet gelokaliseerd op andere organellen en de cel cytosol; en ten derde, het gebruik van Fluo-4 mitochondriale Ca ²⁺ detecteren maakt een snelle en eenvoudige celkleuring, ontkennen elke cel transfectie of transformatie problemen die bestaan bij gebruik van genetisch gecodeerde probes.

Protocol

1. Bereiding van Cellen

1. Kweek cellen op 10 cm celcultuurschalen of 75 ^cm2 kolven in kweekmedium [10 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagles Medium (DMEM) aangevuld met 5% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1 x penicilline / streptomycine (P / S )] bij 37 ° C / _5% CO2.
2. Om cellen te oogsten, verwijder media door aspiratie, daarna wassen met 5 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS). Verwijderen 1x PBS door afzuigen, voeg 1,5 ml 0,25% (w / v) Trypsine / 0,25% (w / v) ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en incubeer bij 37 ° C / 5% _CO2 gedurende 2 min. Tik gerecht of de kolf voorzichtig om cellen te verwijderen, dan resuspendeer in 5 ml kweekmedium.
3. Aantal cellen door toevoeging van 12 pi geresuspendeerde cellen op een hemocytometer.
4. Plaat cellen in gerechten of chambered dekglaasjes voor confocale beeldvorming.
   Opmerking: Deze zullen een geschikte kunststof of glazen bodem die is ontworpen voor gebruik met omgekeerde microscopen hebben.
5. Plaat cellen, zodat thbij ~ 80% confluentie bereikt op de dag van beeldvorming. Bijvoorbeeld ongeveer 2 x 10 ⁴ 143B osteosarcoom cellen kunnen worden uitgeplaat in een putje van een 8-well kamer dia één dag voor de beeldvorming.
6. Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C / 5% CO _2, zodat cellen te hechten en te herstellen.

2. Buffers voor TMRM en Fluo-4 Imaging

1. Bereid Record Solution (RS) bevattende 156 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM _MgSO4, 1,25 mM KH _{2PO 4,} 10 mM D-glucose, 2 mM _CaCl2 en 10 mM HEPES pH 7,35. Store RS in porties bij -20 ºC.
2. Bereid Intracellulaire Medium (IM) bevattende 6 mM NaCl, 130 mM KCI, 7,8 mM _MgCl2, 1 mM KH _{2PO 4,} 0,4 mM _CaCl2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2 mM malaat, 2 mM glutamaat, 2 mM ADP en 20 mM HEPES pH 7,1. 200 mM voorraadoplossingen van malaat, glutamaat en ADP afzonderlijk worden bereid, in porties verdeeld en bewaard bij -20 ° C. deze stocks kan aan de IM worden toegevoegd vlak voor gebruik.
3. Ca ²⁺ vrije Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS) worden verkregen vooraf bereid uit commerciële leveranciers. Add ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether) -N, N, N ', N'-tetraazijnzuur (EGTA) tot een eindconcentratie van 500 uM.
4. Bereid een voorraadoplossing van 10 mM tetramethylrhodamine, methylester, perchloraat (TMRM) in 100% methanol. Vanuit deze voorraad, maak een werkvoorraad van 2 micrometer in gedestilleerd H ₂ O.
5. Bereid een voorraadoplossing van 10 mM verapamil in 100% ethanol.
6. Maak een 1 mg / ml (w / v) voorraadoplossing van Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) in dimethylsulfoxide (DMSO).
   LET OP: Fluo-4, AM is een calcium-indicator die vertoont verhoogde fluorescentie na binding Ca ^2+. Fluo-4 is een analoog van fluo-3, met de twee chloorsubstituenten vervangen door fluoratomen. Dit resulteert in verhoogde fluorescentie excitatie bij 488 nm en fluorescentie hogere signaalniveaus. DeAM estergroep resulteert in een ongeladen Fluo-4 molecuul dat celmembranen kunnen doordringen. Eenmaal in de cel, wordt de AM ester gesplitst door niet-specifieke esterasen, resulterend in een geladen vorm van Fluo-4, dat wordt gevangen in de cel.
7. Bereid een voorraadoplossing van 1 mM p-carbonyl cyanide trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) in 100% ethanol.
8. Bereid een voorraadoplossing van 25 mg / ml (w / v) digitonine in gedestilleerd _H2O
9. Bereid een voorraadoplossing van 100 uM thapsigargin in DMSO.
10. Bereid een voorraadoplossing van 40 mM calciumchloride _(CaCl2) in gedestilleerd _H2O

3. kleuring van cellen met TMRM en Fluo-4, AM

1. Bereid RS kleuroplossing met 20 nM TMRM, 5 ug / ml (w / v) Fluo-4, AM en 0,005% surfactant zoals Pluronic F-127 in RS.
   Let op: dit is een niet-ionische oppervlakteactieve polyol dat het oplossen van Fluo-4, AM vergemakkelijkt. Opmerking: 10 uM verapamil kunnen ook worden toegevoegd aan inhibit TMRM uitvoer over de plasmamembraan multidrug transporter als het wordt uitgedrukt in het celtype geanalyseerd.
2. Verwijder kweekmedium uit cellen met een pipet en wassen met 100 ul 1x PBS.
3. Verwijderen 1x PBS pipet en incubeer cellen in 250 ul RS kleuroplossing gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
   LET OP: Als het Fluo-4, AM komt in de cel, wordt de AM-ester gesplitst door cellulaire esterasen. Incuberen bij kamertemperatuur remt esterase activiteit, waardoor Fluo-4 AM naar de mitochondriën binnengaan.
4. Verwijder RS kleuroplossing met een pipet en was cellen in 100 ul Ca ²⁺ vrije HBSS om overtollig Fluo-4, AM en TMRM verwijderen.
5. Bereid IM imaging oplossing met 25 ug / ml (w / v) digitonine, 200 nM en 1 uM TMRM thapsigargin in IM.
   Opmerking: De concentratie van digitonine moet mogelijk worden aangepast dat permeabilisatie van het mitochondriale binnenmembraan kan worden ver- kregen. Dit kan empirisch worden bepaald door het bepalen van de intensiteitTMRM van het signaal bij verschillende concentraties digitonine.
6. Verwijder de Ca2 ⁺ vrije HBSS pipet en voeg 300 ul IM imaging oplossing voor de cellen. Laat cellen equilibreren bij kamertemperatuur gedurende 10 min. De cellen zijn nu klaar voor beeldvorming met _CaCl2 toevoegingen.

4. Cell Imaging

1. Plaats de schotel of chambered dekglaasje met cellen in IM imaging oplossing op een omgekeerde laser scanning confocale microscoop.
2. Gebruik instelling op de microscoop lasers voor de excitatie en emissie spectra van TMRM en Fluo-4. Gebruik bijvoorbeeld 543 nm He-Ne en 473 nm argon laser lijnen respectievelijk prikkelen TMRM en Fluo-4. Gebruik een lage laservermogen van ongeveer 5% aan een foto-schade aan de cellen te minimaliseren.
3. Stel microscoop om afbeeldingen te scannen elke 25 sec. Scan cellen voor 10 min naar basislijn metingen vast te stellen voor de TMRM en Fluo-4 signalen.
   NB: De Fluo-4 signaal kan zwak of niet detecteerbaar bij rustende calcium concent zijnrantsoenen.
4. Voeg 3 ul van 40 mM CaCl ₂ voorraadoplossing direct naar cellen in 300 ul IM weergaveoplossing (een 1: 100 verdunning) en meng voorzichtig met een pipet. Pauzeer de afbeelding scannen, terwijl het toevoegen en mengen van de _CaCl2 indien nodig.
   OPMERKING: De laatste vrije Ca2 ⁺ ionconcentratie [Ca ^2,] in de IM beeldvormingsoplossing kan worden berekend met behulp van software zoals Maxchelator WEBMAXC Extended ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) of Chelator ^11. Een gedetailleerde beschrijving van hoe de laatste vrije Ca ²⁺ ion concentratie te berekenen [Ca ^2+] is beschreven in hoofdstuk 6 hieronder.
5. Doorgaan image scanning ongeveer 4 min, herhaal dan _CaCl2 toevoegingen om de 4 min, totdat het gewenste TMRM of Fluo-4 signalen worden bereikt, meestal rond de 8 tot 10 toevoegingen.
6. Met behulp van een pipet, voeg een 1: 100 verdunning van 1 mM FCCP (final concentration van 10 uM) direct naar cellen ΔΨ _m verdrijven. Afbeeldingscellen nog eens 5 min. Het experiment is nu voltooid.

5. Image Analysis

1. Zodra beeldvorming is voltooid, bepaalt de intensiteit van Fluo-4 en TMRM signalen via beeldanalyse software, bijvoorbeeld ImageJ software met de Bio-indelingen plugin (download 'bioformats_package.jar vanaf http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / en opslaan in de "C: Program Files ImageJ plugins 'folder).
2. Open de imaging-bestand (bijvoorbeeld een .oif-bestand) in ImageJ. Klik op selectie gereedschap en selecteer een regio van belang (ROI) dat mitochondriën bevat. Gebruik de eerste TMRM signaal naar de ROI te selecteren.
3. Open 'Analyze> Extra> ROI Manager', klikt u op 'Toevoegen' om de geselecteerde ROI voor verschillende meetwaardes bevatten. Meerdere ROI's kunnen worden geselecteerd op een enkel beeld voor de meting. Herhaal de vorige stappen totdat alle ROIdit is toegevoegd aan de ROI Manager.
4. Klik op 'Meer> Multi Measure', zorg ervoor dat de 'Meet alle segmenten' is geselecteerd en dat 'One Row Per Slice' is uitgeschakeld, klikt u vervolgens op 'OK' om een ​​tabel van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de TMRM en Fluo-4 signalen te verkrijgen voor elk ROI op elk tijdstip.
5. Gebruik gegevens uit alle ROI op de gemiddelde intensiteiten en de standaardafwijking voor TMRM en Fluo-4 signalen berekenen.

6. Berekening van de laatste vrije Ca ²⁺ Ion Concentratie [Ca ^2+]

1. Het vrije Ca2 ⁺ ionconcentratie [Ca ^2,] in de IM beeldvormingsoplossing kunnen worden bepaald met behulp van software zoals Maxchelator WEBMAXC Extended ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) of Chelator ^11. Stel bijvoorbeeld de variabelen in WEBMAXC UITGEBREID als volgt: Temperatuur = 24 ° C, pH = 7.1, ionensterkte = 0,162, EGTA = 0,002 M, 0,01 M = HEDTA, Ca2 ⁺ = 0,0004 M en Mg2 ⁺ = 0,0078 M. Dit leidt tot een laatste vrije Ca2 ⁺ ionconcentratie [Ca ^2,] van 62 nM . Merk op dat deze programma geen rekening kan houden met iedere variabele, zoals reagens zuiverheid, nauwkeurigheid van de metingen en de pH-bepaling. De meest nauwkeurige methode voor het bepalen van de vrije Ca2 ⁺ -concentratie is een gekalibreerde Ca2 ⁺ elektrode gebruiken.

Resultaten

We hebben dit protocol gebruikt om de gevolgen van een MT-ND5 mutatie op het vermogen van mitochondriën 143B verhogingen buffer calcium ¹² onderzocht. In het hier getoonde voorbeeld, werden controle 143B cellen opgeladen met TMRM en Fluo-4, AM voor permeabilisatie met digitonine. Na 5 min imaging, acht achtereenvolgende toevoegingen van een 1: 100 verdunning werden van 40 mM _CaCl2 exogeen gemaakt met de laatste vrije Ca2 ⁺ ionconcent...

Discussie

Calcium speelt een cruciale rol in vele celprocessen, waaronder spiercontractie, neuronale signalering en celproliferatie ^13. Toename in cel calciumconcentraties worden vaak geassocieerd met energievraag, met calcium rechtstreeks kan stimuleren mitochondriale oxidatieve fosforylering ATP generatie ³ verhogen. Het is daarom van essentieel belang dat we de mogelijkheid hebben om effectief toezicht mitochondriale calcium accumulatie en om te kunnen vergelijken hoe deze functi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
foetaal bovien serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x fosfaatgebufferd zoutoplossing (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicilline/streptomycine (p/s)	ThermoFisher	15140122
0,25% Trypsine/0,25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well kamer met dekglas	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malaat	Sigma-Aldrich	M1000
glutamaat	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ vrije Hank's gebufferde zout oplossing (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrodamine, methyl ester, perchloraat (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfaat (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluormethoxyfenylhydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonine	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargine	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm celkweek schaaltjes	Corning	COR430167
75 cm2 celkweekkolven	Corning	COR430641