Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

Samenvatting

We ontwikkelden een horizontale slice voorbereiding van de zoogdierretina volwassene met het vlak van snijden parallel aan het netvliesoppervlak. Dendritische gebied van nonradially georiënteerde retinale neuronen werden niet afgekapt, waardoor de studie van de signaalverwerking met patch-klem en beeldvormende technieken.

Samenvatting

Verticale slice voorbereidingen zijn goed ingeburgerd om circuits en signaaloverdracht studeren in de zoogdieren netvlies volwassene. Het vlak van snijden in deze preparaten loodrecht op het netvliesoppervlak, ideaal voor het bestuderen van radiaal georiënteerde neuronen zoals fotoreceptoren en bipolaire cellen. De grote dendritische assen van horizontale cellen, wide-field amacrine cellen en ganglioncellen meestal afgekapt, waardoor duidelijk verminderde synaptische activiteit in deze cellen. Dat ganglioncellen en verplaatste amacrine cellen kunnen worden onderzocht in een geheel gemonteerde opstelling van het netvlies, horizontale cellen en amacrine cellen in de binnenste kernlaag zijn alleen moeilijk toegankelijke voor elektroden geheel netvliesweefsel.

Om maximale toegankelijkheid en synaptische integriteit te bereiken, ontwikkelden we een horizontale slice voorbereiding van de muis netvlies, en studeerde signaaloverdracht bij de synaps tussen fotoreceptoren en horizontalecellen. Horizontale snijden maakt (1) eenvoudig en eenduidig ​​visuele identificatie van de horizontale cellichamen voor elektrode targeting, en (2) het behoud van de uitgebreide horizontale cel dendritische velden, als een voorwaarde voor intacte en functionele kegel synaptische input voor horizontale cel dendrieten.

Horizontale cellen van horizontaal plakjes vertoonden tonic synaptische activiteit in het donker, en ze reageerden op lichtflitsen kort met een vermindering van de innerlijke huidige en verminderde synaptische activiteit. Immunocytochemische bewijsmateriaal wijst erop dat bijna alle kegels binnen de dendritische veld van een horizontale cel vast te stellen synapsen met zijn perifere dendrieten. De horizontale slice voorbereiding is derhalve geschikt voor de fysiologische eigenschappen horizontaal verlengde retinale neuronen en sensorische signaaloverdracht en integratie in geselecteerde synapsen te bestuderen.

Inleiding

Visuele informatie wordt gecodeerd als een dynamische ruimte-tijd patroon van afdrukband activering, en het lint synaps tussen fotoreceptoren en tweede orde neuronen is bepalend voor de downstream overdracht van visuele informatie. De verticale opstelling van de plak zoogdierretina is een zeer waardevol instrument voor signaalverwerking studeren in verticale paden, dus tussen fotoreceptoren en bipolaire cellen en tussen bipolaire cellen en sommige soorten amacrine cellen ^{1, 2, 3, 4.}

Echter, verticale snijbeweging zorgt steeds ernstige afknotting van de dendritische gebied van vele retinale neuronen, wat leidt tot aanzienlijk verlies van synaptische contacten. Vooral in de buitenste retina, zijn horizontale cellen beïnvloed door het lateraal verspreiden uitgebreide dendritische velden en axon terminal systemen ^5. In een verticaleslice voorbereiding, de synaptische ingang van honderden kegel fotoreceptor terminals dendrieten horizontale cel wordt daarmee beperkt tot enkele kleine contacten. Dit kan voldoende zijn om de eigenschappen van individuele synapsen bestuderen, maar het doet geenszins vertegenwoordigt de signaalverwerking onderliggende gesynchroniseerde activering van fotoreceptor lint synapsen.

We ontwikkelden ook een horizontale slice voorbereiding, die bijna alle kegel fotoreceptor synaptische ingang overlaat aan horizontale cel dendrieten intact en functioneel. Het vlak van snijden loopt parallel aan het oppervlak van het netvlies, idealiter snijden door de binnenste kernlaag tussen horizontale cellen en amacrine cellen. Aldus worden horizontale segmenten van de buitenste retina gemaakt dat, op de presynaptische plaats, fotoreceptoren met binnen- en buitensegmenten en synaptische uiteinden en horizontale cellen en bipolaire cellen op de postsynaptische terrein. Deze voorbereiding is goed geschikt to onderzoeken gecoördineerde synaptische inputs in horizontale cel dendrieten door alle kegel fotoreceptoren binnen zijn dendritische veld. Het zou dus nuttig blijken om beter inzicht in de werking van de fotoreceptor lint synaps, die cruciaal is voor de overdracht van visuele informatie uit de matrix van fotoreceptor activering in een postsynaptische respons.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierproeven die door de Bondsrepubliek Duitsland uitgevoerd.

OPMERKING: Omdat de retinale weefsel tijdens verlengde delen van deze werkwijze zonder zuurstof zijn, alle stappen moeten worden uitgevoerd zo snel mogelijk uitgevoerd. Muizen moeten donker aangepaste minstens 3 uur voor dissectie zijn. Om lichte aanpassing van het netvlies, de voorbereiding te vermijden en het snijden dient onder gedimd rood licht worden uitgevoerd.

1. Voorbereiding van de Media en andere chemicaliën

1. Bereid Ames 'Medium ^6. Na dissectie, dompel retinale weefsel in Medium Ames 'te allen tijde.
   1. Los op 2,2 g van Ames 'Medium en 298 mg HEPES in 250 ml gedestilleerd water. De concentratie zal HEPES 5 mM. Roer voorzichtig totdat alle deeltjes zijn opgelost.
   2. Medium bubble Ames bij kamertemperatuur met carbogeen (95% zuurstof, 5% autobon dioxide) gedurende ten minste 5 min. Supply carbogen met een glazen Pasteur pipet om de oplossing. Sluit de Pasteur pipet via geschikte slang aan op de uitlaat van het gas regulator.
   3. Voeg 475 mg natriumbicarbonaat aan de oplossing. De toevoeging van bicarbonaat na borrelen voorkomt precipitatie van calciumcarbonaat.
2. Bereid lage geleringstemperatuur agarose. Agarose is nodig voor het inbedden van retinale weefsel tijdens vibratome snijden.
   1. Los op 180 mg agarose in 9 ml Ames 'Medium en 1 ml gedestilleerd water. Gebruik een magnetron om langzaam verwarmen de agarose oplossing totdat alle vaste stoffen zijn opgelost. Verhit in 5 - 10 sec stappen om overlopen te voorkomen. Oplossing moet helder en transparant zijn.
   2. WINKEL agarose opgelost in een waterbad bij 37 ° C voor de duur van de procedure.

2. Instellen van de Vibratome

LET OP: Alle snijden heeft uitgevoerd met de uitgevoerdvibratome vermeld in de tabel Materials. De opgegeven instellingen verwijzen naar dit soort van slechts vibratome. Voor meer informatie over vibratome opdeling van zenuwweefsel verwijzen wij u naar verwijzen ^7.

1. Plaats vibratome injector mes in bladhouder.
2. Meet verticale afbuiging van het blad met de "Vibrocheck" apparaat. Gebruik de stelschroef op het blad houder om het blad te kantelen totdat het evenwijdig aan het snijvlak is. De exacte positionering van het blad noodzakelijk jaloezie effecten op het gedeelte oppervlak te voorkomen en een vlak gedeelte dat levende cellen op het oppervlak bevat produceren.
3. Stel vibratome om de volgende instellingen: amplitude, 1.00; snelheid, 0.20; dikte 180-200 urn.

3. Dissectie van Mouse Retina

1. Verdoven volwassen C57BL / 6 muis door verdamping van ongeveer 1 ml isofluraan in een luchtdichte container. Wanneer anesthetica voltooid, inslapen dierlijke cervicale dislocatie. Demuis mogen niet ouder dan 3 maanden, omdat anders de kwaliteit van de plakjes verslechtert.
2. Verwijderen oogbal door een gebogen pincet onder het oog. Voorzichtig optillen van de oogbol zal de optische zenuw bloot te leggen. Snijd de oogzenuw met een veer schaar en breng het oog bal naar een 35 mm petrischaal met 2 ml Ames 'Medium.
3. Voer alle volgende stappen op het podium van een stereomicroscoop. Pas de vergroting op een waarde die optimaal visuele controle van de volgende procedures (stappen 3,4-3,9) toelaat.
4. Prik het hoornvlies bij de overgang naar de sclera met spitse tang of een 20 G naald. Tijdens deze stap, stabiliseren de oogbal met een andere tang. Wees voorzichtig het netvlies met de doorprikkende apparaat niet te beschadigen.
5. Plaats de veer schaar in het gaatje in stap 3,3 en snijd een cirkel rond het hoornvlies. Opnieuw steady de oogbal met een tang tijdens het snijden. Houd de insnijding zeer dicht bij het oppervlak om te voorkomen dat cut in het netvlies.
6. verwijderen hoornvlies, lens en glasachtig lichaam voorzichtig met een pincet. Het glasachtig lichaam bestaat uit slechts een dunne transparante laag aan de achterkant van het oog. Het is echter essentieel vibratome snijden dat het glasachtige lichaam volledig wordt verwijderd.
7. In de petrischaal, plaatst u de oogschelp op een manier die men kijkt door het gat naar beneden op het netvlies. De rand van de opening moet bestaan ​​uit slechts sclerale weefsel. Als de cirkelvormige snede (stap 3.4) is te dicht bij de evenaar van de oogschelp is uitgevoerd, zal het netvlies weefsel ook aanwezig zijn in de buurt van de incisie zijn. Wees voorzichtig dan het netvlies in stap 3.8 niet te beschadigen.
8. Pak de sclera met een tang en zorgvuldig het weefsel scheuren. Het is essentieel het netvlies niet scheurt tijdens deze stap. Indien nodig, maak het netvlies van de ora serrata door stil houden de sclerale deel van het weefsel met de tang en voorzichtig afpellen van het netvlies met de andere tang. Houd de tang gesloten; nooit het opnieuw te behandelentina met een pincet, omdat het weefsel is zeer zacht en zal zo meteen geven.
   Opmerking: In deze stap, het netvlies en de rest van de oogschelp wordt verbonden Pas bij het oogzenuwuiteinde.
9. Snijd de bevestiging plaats bij de oogzenuw hoofd met het voorjaar schaar. Het netvlies moet nu vrij zweven als een enkel stuk weefsel in Ames Medium.
10. Snijd het netvlies in 4-6 kleine rechthoeken van ongeveer 23 mm met een gekromd scalpel door met het netvlies aan de randen met de tang te manipuleren zijn plaats. Vermijd het afklemmen van de retinale weefsel in de rechthoeken. Neem stukken van het centrale deel van het netvlies, niet ver periferie.
11. Transfer retinale stukken met een grote diameter plastic Pasteur pipet met een 35 mm plastic petrischaaltje, waarvan de bodem is vervangen door een maas met raster kleiner dan 1 mm. Bevestig de petrischaal in het bovenste derde van een beker of erlenmeyer en dompel retinale stukken in Medium bu Ames 'bbled met carbogen.

4. Inbedding van retinale Pieces in Agarose

1. Zorgvuldig overdracht 2-3 retinale stukjes in een 35 mm plastic petrischaal met enkele Ames Medium. Dat het gemakkelijkst een grote diameter plastic Pasteur pipet gebruiken voor overdracht. In deze stap heeft de exacte oriëntatie van de retinale stukjes niet toe.
2. Verwijder zoveel mogelijk van de resterende Ames middelmatig een glazen Pasteur pipet. Zodra de vloeistof is verwijderd verder met stap 4.3. Laat de retinale weefsel droog.
3. Onmiddellijk bedekken retinale stukjes met 2 ml agarose opgelost (37 ° C). Gezien de in stap 3.10 genoemde omvang, zullen de stukken niet opkrullen binnen de agarose.
4. In de vloeibare agarose, duw retinale stukjes naar de bodem van de petrischaal. Het ganglion cellaag moet naar beneden. Gebruik een stereo-microscoop voor het oordeel van de exacte positie. Voor de positionering, handvat retinale piECES met een kleine spatel. Plaats de retina zo snel en nauwkeurig mogelijk, omdat de agarose zal snel stollen.
   1. Regelen retinale stukjes evenwijdig aan de bodem van de glazen schaal; anders secties zullen raakt of schuin zijn. Individuele stukken moeten elkaar niet raken, maar ook niet te ver uit elkaar. Probeer om het netvlies stukken min of meer op dezelfde hoogte te plaatsen.
5. Zet glazen petrischaal met ingesloten retinale stukjes in de koelkast (4-6 ° C) gedurende ten minste 2 min. Dit zal snel uitharden de agarose voor verdere verwerking. Zodra de agarose gepolymeriseerd verder met de volgende stap.

5. Montage van het netvlies Pieces

1. Haal de agarose blok met netvlies stukken uit de petrischaal. Gebruik een spatel of een soortgelijk apparaat om de agarose blok van het glas te heffen. Door adhesiekrachten, kan deze blijken vrij moeilijk te zijn. Echter, voorkomen dat het breken van deagarose blok. Voer deze en alle volgende stappen bij kamertemperatuur.
2. Plaats de agarose blok op een glazen dekglaasje en pas de grootte met een scalpel. Laat 1-2 mm van agarose aan weerszijden van de retinale stukjes. De uiteindelijke grootte van het blok moet ongeveer 1066 mm (10 mm betrekking op de hoogte van het blok, 6 mm aan de rand lengte).
3. Lijm de agarose blok met het model houder van de vibratome met behulp van een instant lijm. Retinale stukken moet worden aangebracht op de top van de 10 mm hoge versnelling en evenwijdig aan het oppervlak, terwijl de onderzijde is bevestigd aan de houder.
4. Bedek het blok direct door het gieten van de eerder borrelde Ames 'Medium in de buffer lade van de vibratome.

6. Voorbereiding van de Horizontale Vibratome Secties

1. Start snijden. In eerste instantie ligt de dikte van de hand snijden tot fragmenten van retinale weefsel verschijnen in de slice. Verander vervolgens de instellingen in stap 2.3. aangezien demuis netvlies is slechts ongeveer 200 urn dik, zullen er niet meer dan 2-3 sneetjes per agarose blok.
2. Verwijder onderdelen uit de buffer dienblad met een glazen staaf en overbrengen naar 2 ml Ames 'Medium in een 35 mm petrischaal.
3. WINKEL secties onmiddellijk in een incubator bij 37 ° C (5% CO _{2/55% O2).} De agarose rond de secties vaste stof in de incubator blijven en kan worden gebruikt om de secties te behandelen zonder schade aan het netvlies. Betere segment kwaliteit wordt verkregen bij opslag bij 37 ° C in de respectievelijke atmosfeer opzichte Medium geoxygeneerde Ames bij kamertemperatuur. Secties kunnen direct worden gebruikt of kan tot 4 uur worden bewaard in de incubator met goede fysiologische resultaten.
4. Insluiten volgende retinale stukken in agarose en herhaal de afdelingen 4-6.

Resultaten

In horizontale segmenten van de muis netvlies kan horizontaal cellichamen gemakkelijk worden geïdentificeerd op basis van hun unieke morfologie met meerdere primaire dendrieten die uit een veelhoekige cellichaam (Figuur 1A). Horizontale cellichamen vlakbij het oppervlak van de plak werden routinematig toegankelijk voor patch-clamp elektroden. Tijdens opnamen werden de cellen gevuld met een fluorescerende kleurstof, onthullen hun ingewikkelde dendritische arborizati...

Discussie

In tegenstelling tot de verticale segmenten, wordt de dendritische morfologie van radiaal georiënteerde neuronen zoals horizontale cellen en amacrine cellen goed bewaard gebleven. In vergelijking met hele retina preparaten, deze celtypen zijn gemakkelijk toegankelijk voor micro-elektroden en kan worden onderzocht door zowel elektrofysiologische en beeldvormende technieken. Hier hebben we ons gericht op de buitenste retina; echter, heeft een vergelijkbare benadering name gemeld voor amacrine cellen van de binnenste retin...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ames' Medium	Sigma	A1420
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Hepes	Sigma	H3375
Carbogen	Air Liquide
Agarose	Sigma	A9045
35 mm Petri dish (plastic)	Nunc Thermofisher	150318
Glass Petri dish	Chemoline	50-1470-40
Isoflurane	Dispensary university hospital
Vibratome injector blade	Biosystems	39053250
Vibratome	Leica Microsystems	VT1200
Vibrocheck	Leica Microsystems
Microwave
Water bath
Forceps
20 G needles
Spring scissors
Curved scalpel blades
Stereo microscope
Plastic Pasteur pipette
Glass Pasteur pipette