Methodenartikel

Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie

9.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55177

⸱

27 maart 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Georgetown University Medical Center, 2Department of Medicine, Georgetown University Medical Center, 3Department of Physics, Georgetown University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om de afbeelding cellen die groen fluorescerend eiwit-tag soort angiotensine 1a receptoren tijdens endocytose geïnitieerd door angiotensine II behandeling. Deze techniek omvat labeling lysosomen met een tweede fluorescerende marker, en vervolgens met behulp van software om de co-lokalisatie van receptor en lysosomen te analyseren in drie dimensies in de tijd.

Samenvatting

Levende cellen beeldvorming wordt gebruikt om gelijktijdig vastleggen time-lapse beelden type 1a angiotensine receptoren (AT 1a R) en intracellulaire compartimenten in getransfecteerde humane embryonale nier-293 (HEK) cellen na stimulatie met angiotensine II (Ang II). HEK cellen tijdelijk getransfecteerd met plasmide DNA dat op 1a R tag versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP). Lysosomen worden geïdentificeerd met een rode fluorescerende kleurstof. Levende cellen beelden worden vastgelegd op een laser scanning confocale microscoop na Ang II stimulatie en software geanalyseerd in drie dimensies (3D voxels) tijd. Live-cell imaging maakt onderzoek naar receptoren handel en vermijdt verwart geassocieerd met fixatie, en met name het verlies of artefact verplaatsing van EGFP-gelabelde membraanreceptoren. Dus, zoals afzonderlijke cellen worden gevolgd in de tijd, de subcellulaire lokalisatie van receptoren kunnen worden afgebeeld en gemeten. Afbeeldingen moeten worden verworven sufficiently snel tot een snelle blaasje beweging vast te leggen. Maar bij hogere belichtingssnelheden, het aantal fotonen verzameld verminderd. Compromissen moeten worden gemaakt in de keuze van beeldvormende parameters zoals voxel om beeldvorming snelheid te winnen. Significante toepassingen van levende cellen beeldvorming om eiwittransport, migratie, proliferatie, celcyclus, apoptose, autofagie en eiwit-eiwit interactie en dynamiek bestuderen om maar enkele te noemen.

Inleiding

Het algemene doel is om kwantitatieve gegevens in tijd en ruimte van de receptor colocalization met specifieke subcellulaire organellen krijgen na behandeling met een receptor agonist. Aldus onmiddellijke doel is hier om time-lapse confocale beelden van lysosomen en een transmembraan spanning receptor in humane embryonale niercellen (HEK) na transfectie en vervolgens verzamelen en analyseren van de beeldgegevens in 3D kwantitatief meten van de afgifte van receptor vastleggen lysosomen. Onderzoeken van de gelijktijdige handel in een transmembraan receptor met lysosomen of andere organellen tijdens endocytose wanneer geactiveerd door receptor ligand kan helpen bepalen hoe de transmembraan receptor wordt gereguleerd onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden.

AT 1a R wordt geacht te zijn afgebroken in lysosomen na behandeling met Ang II model celsystemen, vooral HEK293 1 hoewel de meerderheid van receptors zijn voornamelijk gelokaliseerd in multivesiculaire recycling endosomen voor latere overdracht naar de plasmamembraan terwijl het grootste deel van de ligand, Ang II, afgebroken in het lysosoom 2, 3, 4, 5. Meer recent, Li et al. aangetoond met Förster resonantie energieoverdracht (FRET) en fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) technieken die op 1a R colocalizes (op ~ 10 nm schaal) LAMP1, een lysosomale membraaneiwit suggereren dat ten minste enkele van de receptor is gericht op en afgebroken door lysosomen 6. Deze auteurs opgemerkt dat de lysosomale remmer chloroquine geblokkeerde AT 1a R-LAMP1 vereniging die is in overeenstemming met eerdere rapporten suggereren dat een effect van chloroquine is om fusie van de late endosomen of autofagosomen met lysosomen te blokkeren. Andere indirecte methoden om te bepalen op 1a R localization in lysosomen hebben gebruikt bafilomycine, een lysosomale remmers afgeleid op 1a R aanwezig in lysosomen 3, 4, 5, 6, 7, 8.

Live-cell imaging vermijdt mogelijke gevolgen van fixatie op celvolume en verlies / dimmen / herverdeling van GFP-chimere receptor. Eerdere studies hebben ingeroepen gefixeerde cellen aan colocalization of samen voorkomen van de receptor met lysosomen of met levende cellen gemerkt met receptorbinding surrogaten bepalen zoals β-arrestine 1, 2, 3, 4, 5, 6. Live-cell imaging van andere GPCR's met behulp van draaiende schijf confocale laser of point scanning confokale microscopen uitgerust met de Gaasp of hyd detectoren ingeschakeld onderzoekers aan de internalisering van en handel in receptoren in individuele cellen afgebeeld in z-stacks op 30 s intervallen 9, 10 observeren. Maar zelfs als levende cellen z-stacks snel worden verzameld, kan de analyse pas na selectie van een enkel vlak binnen elke stapel, dwz in 2D 10. Hoewel dit voldoende kan zijn voor het bestuderen van geïnternaliseerde GPCR of tyrosine kinase receptor in kwestie, de AT 1a Rs ophoopt in blaasjes die grootte en de positie in de tijd en zijn derhalve inherent moeilijk voldoende monster met een representatief snee op elk tijdstip. Om de route van het gemerkte AT 1a R door de cel en elke subpopulatie van vesicles die verschillen in grootte en positie detecteren grondig te bepalen, hebben wij een methode ontwikkeld voor 3D beeldvorming en 3D analyse om deze veranderingen te volgen en te in combinatie met kenmerken van verschillende intracellulaire compartimenten zoals lysosomen.

Onderzoekers kunnen dit protocol live-cell imaging om de beweging van AT 1a R direct zichtbaar in de cel en het naar subcellulaire compartimenten na Ang II stimulatie. Subcellulaire compartimenten zijn gelabeld met fluorescerend eiwit chimaera's of andere fluorescente merkers. Dit protocol kan ook worden gebruikt als een eerste benadering van receptoren in subcellulaire organellen met een minimale resolutie van 200 nm lokaliseren ter vergelijk gemuteerd versus wild-type receptoren of aan veranderingen na farmacologische behandelingen detecteren. De techniek is bereikbaar omdat het op elke confocale microscoop uitgerust voor levende cellen beeldvorming kan worden uitgevoerd. Het relatieve gemak van deze benadering contrasteert met verhoogde deskundigheid en apparatuur die nodig FRET / FLIM / BRET technieken welke moleculaire interacties detecteren 6 uit te voeren,"xref"> 11. Deze metingen definiëren eiwit-eiwit interacties met hoge resolutie (~ 10 nm) en lokalisatie binnen subcellulaire organellen is afgeleid. Deze meer geavanceerde technieken worden gebruikt om te volgen en verder te definiëren moleculaire interacties plaats, in plaats van de doorgang van receptoren, subcellulaire compartimenten en zij rechtstreeks eiwit-eiwit interacties op bepaalde tijdstippen en plaatsen aantonen binnen de cel 11. FLIM, een FRET techniek onafhankelijk van de acceptor concentratie, wordt meestal uitgevoerd op vaste monsters sinds beeldacquisitie is langzamer. Daarentegen verhouding FRET biedt snelle beeldvorming en hoge resolutie colokalisatie van interagerende eiwitten. Het nadeel van verhouding FRET is dat beeldvorming gebruikt groothoek epi-fluorescentie imaging snelheid te winnen en de gehele cel, wat resulteert in gereduceerde resolutie en contrast van organellen 12 omvatten. Bioluminescentie resonantie energie-overdracht (BRET) is een andergeavanceerde techniek die is toegepast op GPCR's aan de overname van de moleculaire nabijheid te meten in de tijd 11. In deze techniek een eiwit fluorofoor moleculair verdeeld en elke helft gekoppeld aan één van twee eiwitten betrokken. Wanneer de twee eiwitten van belang binden elkaar, het delen van het chimere tag opnieuw assembleren fluorescentie en de verhoogde fluorescentie gekwantificeerd tijd krijgen.

Hier presenteren we een eenvoudige techniek voor live cell imaging in combinatie met image kwantificering tot smokkel van AT 1a R studeren in de cel na Ang II stimulatie en de mogelijke verandering in de levering van geïnternaliseerde AT 1a R om lysosomen na Ang II stimulatie. Het uiteindelijke gebruik van deze techniek is om verschillen in membraantransport vergelijken wildtype en gemuteerde receptoren te karakteriseren. Deze verschillen zullen helpen om het mechanisme (s) die van invloed zijn fysiologische activiteiten van AT 1a R leadi identificerenng tot regulering van de bloeddruk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dag een

1. Cel zaaien

  1. Bereid compleet Dulbecco's gemodificeerd Eagle Medium (DMEM). Voeg 50 ml foetaal runderserum, 5 ml penicilline / streptomycine, 5 ml L-glutamine tot 450 ml DMEM tot 500 ml te maken van compleet DMEM aangevuld met foetaal runderserum (10%), penicilline / streptomycine (1%) en L-glutamine (1%).
  2. Seed humane embryonale nier (HEK) cellen, passage nummer 11/06 op 50.000 / putje in een 8 goed chambered dekglaasje systeem in volledige DMEM.
  3. Handhaaf de chambered glijbaan bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 24 uur.

Dag twee

2. Liposoom Transfectie

  1. Vers maken AT 1a R-GFP plasmide en liposoom-oplossingen met behulp van steriele omstandigheden met een bioveiligheidsniveau 2 kast.
  2. Verdun 2 pi plasmide-DNA in 900 ng / ul voorraadoplossing in 178 ui gereduceerd serum medium een ​​concentrat bereikenion van plasmide-DNA van ongeveer 10 ng / ul.
  3. Verdun 4,5 pi van liposoom voorraad oplossing in 175,5 ul van verminderde serum media om een ​​1:40 verdunning van de voorraad te creëren.
  4. Voeg de liposoomoplossing het plasmide-oplossing en meng met een pipet 1 ml pipet op en neer 20 keer om de transfectie oplossing te mengen.
  5. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (25-27 ° C).
  6. Terwijl dit mengsel te incuberen, verwijder de langzaam met 1 ml pipet en voeg langzaam 400 ul van 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die vooraf verwarmd tot 37 ° C.
  7. Verwijder de PBS en vervangen door 200 ul / putje gereduceerd serum medium voorverwarmd tot 37 ° C.
    LET OP: Wees voorzichtig bij alle stappen bij het wassen van de cellen om losmaken van cellen van het dekglaasje te voorkomen als gevolg van pure stress veroorzaakt door pipetteren.
  8. Handhaaf de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 30 minuten.
  9. Zodra deincubatieperiode voorbij is, voeg 80 ul transfectiemix aan elk putje en incubeer de cellen gedurende 4,0-4,5 uur maar niet meer dan 5 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
  10. Na de transfectie incubatietijd is voltooid, langzaam verwijderen van de inhoud van de kamers met een 1 ml pipet en voorzichtig vervangen door 300 pl / putje volledig DMEM en incubeer cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO 2 .

Dag drie

3. Serum Starvation

  1. Verwijder het medium voorzichtig met een pipet 1 ml en langzaam vervangen door 300 gl serumvrij DMEM zonder fenolrood.
  2. Handhaaf de kamer bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 10-12 uur.

dag vier

4. Live-cell imaging

  1. Vlek intracellulaire compartimenten (lysosomen in dit geval).
    1. about 30 min voorafgaand aan lysosomen beeldvorming in cellen, voeg 22,5 ul van een 1 uM fluorescerende kleurstof voorraadoplossing (0,5 gl 1 mM fluorescente kleurstof opgelost in 499,5 gl serumvrij DMEM zonder fenolrood) aan elk putje om een ​​uiteindelijke kleurstofconcentratie van 75 nM.
    2. Incubeer 25-30 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO 2 en verwijder voorzichtig de kleurstof en langzaam vers serumvrij DMEM voeg 300 ul zonder fenolrood.
  2. Bereid de microscoop voor beeldvorming.
    1. Stel de fase om schade aan de lens tijdens het opstarten van een geautomatiseerde microscoop voorkomen.
    2. Schakel de stroom microscoop, scanner vermogen, laservermogen en laseremissie, en tenslotte het metaalhalogenide lamp voor visuele waarneming (zie confocale microscoop instructies van de fabrikant).
    3. Open de imaging software programma en in de software afslag op de argon (488 nm) laser en vermogen tot 30-50%. Let op de stroom afhangtleeftijd laser. In experimenten is het cruciaal om constant instellingen te behouden.
    4. Zet op rood-emitterende laser (bv 568 nm of 594 nm).
    5. Set imaging formaat naar 12-bit diepte.
    6. Stel de pinhole voor de argon laser lijn 488 nm en voor de 568 nm of 594 nm laser tot 1 Airy disk unit. Als de GFP is erg zwak, gebruik dan een instelling van 2 Airy disk eenheden, maar op de juiste wijze overeenkomen met de kanalen.
    7. Bij het gebruik van dichroïsche filter sets, selecteert u de juiste emissie-golflengten voor GFP en de fluorescerende kleurstof. Of zet de emissiegolflengte (Em) bij 499-580 nm voor GFP en Em 599-680 nm voor de rode-emitterende fluorescerende kleurstof.
    8. Controleer of bloeden door en crossover niet voorkomen. Schakel elke laser op zijn beurt en laat zowel de emissie-kanalen voor elk. Wanneer de Argon laser is uitgeschakeld, moet de groene emissie nul. Wanneer de groene emitterende laser is uitgeschakeld, moet de rode emissie kanaal nul.
      LET OP: De veiligste methode is om het beeld elk in afzonderlijke tracks (loverttieel).
    9. Onder andere een helderveld kanaal indien gewenst. Vermijd differentieel contrast imaging (DIC), omdat het colocalisatie metingen kunnen scheef.
    10. Voor live imaging, selecteer lijn sequentiële dan Frame Sequential.
  3. Selecteer de cellen voor beeldvorming.
    1. Gebruik van een 1,4 numerieke apertuur (NA) doel, zoals een 63x / 1,4 NA olie doelstelling afbeeldingscellen (of 40X / NA 1,4). Centreer de doelstelling en voeg een druppel hoge viscositeit, lage autofluorescentie immersie olie op het doel.
    2. Breng de kamer met de getransfecteerde cellen uit de incubator tot het stadium van de microscoop. Wees voorzichtig om de dia's plat te houden en ervoor te zorgen dat de kamer goed op zijn plaats zit en weerhouden van beweging.
    3. Beweeg het doel tot de druppel olie onder de bodem van de slede raakt; de juiste focal plane ligt in de buurt van deze positie. In automatische microscopen, dan deze positie en de onderste stand gebruiken voor de remainder van de beeldvorming experiment te faciliteren veranderende monsters.
    4. Kies dim cellen. Overexpressie AT 1a R-GFP zal de receptor in de cel misleiden en verstoren de normale functie.
    5. Controleer of de omtrek van de cel bepaald door de plasmamembraan, zichtbaar en bij voorkeur niet overlapt met andere cellen.
    6. Focus en centreren de cel in het gezichtsveld.
    7. Overschakelen naar confocale mode.
    8. Selecteer een snelle imaging-modus. Met één hand op de focus controle en de andere op het podium XY control, focus en centreren van de cel van belang zijn zichtbaar op de monitor.
    9. Controleer of de cel van belang goed verspreid en de bodem- of buikzijde afgewisseld samen met het dekglaasje door te focussen op en neer door de cel.
  4. Stel de z-stage parameters beeld een cel in 3D.
    1. Selecteert u de toets voor de Z-stack bovenste en onderste venster (of equivalent) en gericht naar de bodem van de cell druk op 'begin'. Vervolgens richten zich naar de top van de cel en druk op de "end." Controleer opnieuw dat de gehele cel in de z-stack.
    2. Stel de Z-stapgrootte 1,0 urn.
  5. Stel imaging-instellingen.
    1. Selecteer Zoom 2, afhankelijk van de lens, zodat de uiteindelijke pixelgrootte ongeveer 0,279 urn x 0,279 urn tot 0,14 urn x 0,14 urn in het XY dimensie.
    2. Voor HEK cellen in dit experiment, stelt scansnelheid tot ongeveer 1 microseconde per voxel en selecteer 2 middeling of 2 ophopingen door lijn, afhankelijk van de helderheid van cellen.
    3. Pas laserintensiteit en krijgen voor beeldvorming van GFP en de fluorescerende kleurstof. In het algemeen zal counterstains veel helderder Photomultiplier detector (PMT) en niet galliumarsenide fosfide (Gaasp) of Hybrid detectoren (Hyd) moet worden gebruikt voor deze tweede kleur kanaal terwijl snik en hyd detectors nodig zijn voor het GFP-kanaal en daarom. Als de HYD of Gaasp detecterenors worden gebruikt voor de fluorescerende kleurstof uitoefenen voorzichtigheid en beginnen met de laser op een extreem laag vermogen.
    4. Stel de duur van de scan en de frequentie van het scannen, bijvoorbeeld elke 30-60 s meer dan 25 minuten of langer te zien targeting van AT 1a R-GFP te lysosomen.
    5. Zet de autofocus aan focal plane stabiliteit in de tijd te handhaven.
  6. Begin de beeldvorming experiment.
    1. Bereiden op voorhand 100x Ang II voorraad bij 5 ug / ul (4,7793 mmol) en voeg 2,1 pi van deze 998 ul medium (10 pm).
    2. Begin ligand stimulatie door toevoeging van 3 pi van een voorraadoplossing van 100x ligand (Ang II) het putje met 300 ul onmiddellijk voorafgaand aan beeldvorming (eindconcentratie 100 nM).
    3. Klik op de afbeelding start en in 3D voor de gewenste tijd en frequentie.
    4. Voor het einde van het werk bij de microscoop, het verzamelen van een z-stack voor later gebruik in de achtergrond aftrekken tijdens de analyse. In foton telmodus, dit is nietnodig omdat de achtergrond in hoofdzaak 0. verlichting ingeschakeld en alle andere beeldvormende omstandigheden hetzelfde, maar zonder monsterneming een voorbeeldafbeelding. Zie Achtergrond aftrekken (zie hieronder) onder analyse.

dag vijf

5. Image Analysis

  1. Afbeeldingen Exporteren naar TIFF-formaat.
    1. Klik met de rechtermuisknop op de naam van het beeldbestand om menu's te zien en selecteer Exporteren of klik op Bestand | export | importeren.
    2. Exporteren naar tiff voor verdere analyses en zorg ervoor dat de RAW, 12-bit data [niet de 'Red Blue Green' (RGB) conversie gebruikt voor publicatie kwaliteit foto's] exporteren. Niet naar jpeg-formaat exporteren.
    3. Let op de X, Y, Z voxel afmetingen en de grootte z-stap om later tijdens beeldanalyse. Bijvoorbeeld met behulp van een 40x / 1,4. NA objectief van deze waarden kunnen 0,138 micrometer x 0,138 urn met 1 micrometer z-stapgrootte (zie gegevens in de resultaten representatief gedeelte) zijn.
  2. image stack voor analyse.
    1. Afbeelding openen Kwantificering software (figuur 2)
    2. Gebruik "Actie | Nieuw | Beelden uit de geselecteerde sequentie" naar een enkel bestand afbeelding van geïmporteerd enkele sequenties (figuur 2, pijl # 1) te genereren.
    3. Voer het aantal kanalen, het aantal z-profielen, en het aantal tijdstippen.
    4. Afhankelijk van de structuur van de * TIFF bestanden selecteert, bijvoorbeeld, kanalen, z-vlak en tijdstippen de volgorde van de beeldvlakken. Controleer of het uiteindelijke beeld stapel correct vertegenwoordigt de kleur kanalen, z-stack, en de tijdstippen van het originele beeld.
    5. Selecteer de afbeelding naam (figuur 2, benadrukt bestandsnaam links, pijl # 2). Klik met de rechtermuisknop op het beeld en / of het beeldveld, en uit de opties aan de onderkant van de lijst selecteer "Eigenschappen". In de urn pixel voor (X) (Y) en (Z) grootte, voert u het juiste beeld eigenschappen zoals hierboven vermeld.
  3. Aftrekken achtergrond voorafgaand aan beeldanalyse. Achtergrondcorrectie kan op elke beeldanalyse software. Aftrekken achtergrond met behulp van één van de twee opties.
    1. Optie 1: Kies "Actie | Nieuwe | Achtergrond Aftrekken" (figuur 2, pijl # 1). Gebruik de verworven afbeelding achtergrond verkregen aan het einde van de opnamesessie hierboven beschreven als de "Dark Reference" Afbeelding onder "Tools | Aftrekken Background".
    2. Optie 2: Controleer de donkerste gebieden in het beeld waar geen monster bereken de gemiddelde of maximale helderheid van pixels in dat gebied ervan, wanneer buitengewoon heldere pixels die parasitaire fluorofoor, een willekeurig defecte pixel of een ander verschijnsel kan zijn. Selecteer "Actie | Nieuwe | Achtergrond aftrekken". Gebruik deze helderheid pixel (negatieve gemaakt) als offset.
  4. Controleer of de kleur registratie en corrigeer indien nodig.
    1. Het gebruik van een positieve controle, zoals afgebeeld microbolletjes, of, colocalized GFP-bevattende blaasjes en fluorescerende kleurstof (figuur 3) beoordeling van de noodzaak voor de correctie door te schakelen ofwel de rode of groene kleur kanaal uit en weer aan. Visueel, als de registratie is uitgeschakeld door nog 1 pixel, is het duidelijk voor het oog.
    2. Genereer een registratie correctie door te kiezen voor "Acties | Nieuw | Registratie Correction" (figuur 2, pijl # 1) en gebruik het dialoogvenster om aanpassingen te maken. Na voltooiing van een nieuwe map onderdeel zal verschijnen met de titel "Registratie Correction".
    3. Breng de registratie van één of meer van de beelden van belang door te klikken op de afbeelding naam (figuur 2, benadrukt bestandsnaam links, pijl # 2) en vervolgens te kiezen voor "Extra | correcte registratie" (Tool knop naast acties).
  5. Maak meting sequentie te analyseren AT 1a R-GFP blaasje en volledige cel intensiteit volgendebehandeling met Ang II.
    1. Selecteer een afbeelding (figuur 2, benadrukt bestandsnaam links, pijl # 2) en teken een regio van belang (ROI) rond een enkele cel met behulp van het freestyle regio gereedschap (figuur 2, pijl # 3). Gebruik de uitgebreide Focus-modus (2D, drop-down menu in de linker bovenhoek) naar de cel te observeren als het bijsnijden tool werkt alleen in 2D visualisatie.
    2. Klik rechts op de afbeelding en selecteer "Crop naar selectie 'en een nieuw beeld item wordt gegenereerd.
    3. Selecteer de bijgesneden cel door te klikken op de naam en selecteer het tabblad 'Meting "hierboven (figuur 2, pijl # 4).
    4. Te definiëren en te meten geïnternaliseerd blaasjes voor GFP, drag "Find Objects" onder "Finding" (figuur 2, pijl # 5) in sequentie box (figuur 2, pijl # 6).
    5. Stel "Find Objects" Channel aan het GFP-kanaal.
    6. Open instellingen (wiel pictogram in het dialoogvenster pijl # 6) en stel4; Drempel met: "naar SD en" ondergrens "tot 6. Set" Minimumformaat object "naar 0 micrometer 3.
      NB: De SD ondergrens zal afhangen van de individuele experimenten. Visuele bevestiging dat de juiste objecten thresholded gemaakt door onderzoek verschillende tijdstippen (figuur 2, pijl # 7). De "Measurement | Beoordeling Opties" dialoogvenster wordt gebruikt om de wijze waarop thresholded geselecteerde objecten worden gevisualiseerd kiest (figuur 2, pijl # 8).
    7. Klik op "Measure" in "Zoek objecten" dialoogvenster (Figuur 2 pijl # 6) en selecteer de kanalen en het type van de metingen. Typisch, selecteer "Alle kanalen" en "Intensiteit en Volume Metingen".
    8. De drempelwaarde en filters definiëren voor identificatie van de gehele cel en totale GFP intensiteit meten Herhaal de bovenstaande stappen (5.5.4 - 5.5.8) met de volgende parameters: SD 0 en "minimale objectgrootte" tot 2 μ; m 3 in de tweede "Find objecten" dialoogvenster om cellen met behulp van GFP te identificeren (figuur 2, pijl # 9)
    9. Drag "Filter Bevolking" onder "Filtering" om de volgorde vak onder de bevolking 2 (de tweede box "Find Objects", figuur 2, pijl # 9). Selecteer "Volume (micrometer 3> 100).
    10. Visueel gewaarborgd dat slechts één voorwerp wordt geïdentificeerd. De gehele cel moet worden thresholded en alle andere objecten gefilterd weg. De "Filter" parameter (s) kan een aanpassing nodig als de cel is klein, bijvoorbeeld.
    11. Zodra de meting is gestandaardiseerd, sla het protocol door met de rechtermuisknop te klikken op de afbeelding en selecteer "Save Protocol" met het oog op hergebruik ( "Restore Protocol"). Het protocol kan ook worden geëxporteerd naar een record te bieden in dezelfde submap als het beeld.
    12. Ga verder met "Make Measurement" door "Metingen | Maak Measurement Item" (figuur 2 , pijl # 8) of rechts te klikken op de afbeelding en selecteer "Make Measurement" en "alle tijdspunten".
    13. Voer de juiste meting naam (kopieer en plak uit het beeld is handig) en analyse-code of de datum (een handige toevoeging voor het bijhouden) en selecteer "alle tijdspunten". Een nieuw werkblad post zal worden gecreëerd onder het beeld. Houd bestandsnamen beknopt.
  6. Te analyseren en de gegevens te exporteren.
    1. Klik op de bestandsnaam werkblad en selecteer het tabblad "Analyseren". Bepaal of verzadigd voxels aanwezig door eerst te kiezen voor "Beperk Analyse aan:" zijn te selecteren Bevolking 2 (de cel).
    2. Klik met rechts op het veld onder het tabblad "Analyseren" en in het dialoogvenster onder "Analyseer deze gegevens:" selecteer "Max ([GFP kleurkanaal])"; onder "Samengevat door:" select "Mean ([GFP kleurkanaal]", en onder "Organiseer de gegevens door:" en "Rij" select "Timepoint" en click "OK".
      LET OP: Als de gegevens bevat verzadigde pixels (bijvoorbeeld 65536 voor 16-bits of 4096 voor 12-bit), zal de analyse niet klopt (het zal blaasje inhoud onderschatten). Negeer die cel voor analyse. Zo niet verzadigd, ga dan naar de volgende stap.
    3. Vervolgens onder het tabblad "Raw" en vervolgens onder het tabblad "Analysis" en rechts-klikken op de gegevens te vinden "Beperk Analyse aan: 'en selecteer Bevolking 1 voor blaasjes of Population 2 voor de gehele cel.
    4. Onder "Analyseer deze gegevens:" select "Sum" (GFP kleurkanaal); onder "Samengevat door:" "Sum" te selecteren; en, in het kader van "Het organiseren van de gegevens door:" en "Rij" select "Timepoint" of "Relative Time" en vervolgens op "OK". Analyse selecties kunnen worden opgeslagen en hergebruikt.
    5. Selecteren en copy / paste direct uit afbeelding kwantificatie software naar een lege spreadsheet of de spreadsheet gegevens exporteren door rechts te klikken op de DATeen en het selecteren opslaan als CSV-bestand. De gehele cel verschillende meetwaardes zullen worden opgenomen in de metingen van elk blaasje in de populatie dus zorg ervoor om te identificeren en te scheiden van de blaasjes.
      OPMERKING: Na het uitzetten van de gegevens stijgt de totale GFP fluorescentie opgenomen in vesicles snel stijgt. Fotobleken, als het zich voordoet, wordt gedetecteerd als verlies van totale cellen GFP-intensiteit in de tijd.
  7. Maak meting volgorde om GFP aanwezig in lysosomen te analyseren.
    1. In de objecten te vinden (Bevolking 1), ingesteld "Find Objects" Channel voor het rode kanaal en in het wiel icoon binnen die dialoogvenster aangegeven door pijl # 6 (figuur 2) set "Drempel met:" naar SD en "ondergrens" naar 6. Stel "Minimumformaat object" naar 0,017 micrometer 3.
      NB: De SD ondergrens zal afhangen van de individuele experimenten. Visuele bevestiging dat de juiste objecten worden thresholded moet worden gemaakt door examenining verschillende tijdstippen. De "Measurement | Beoordeling Opties" dialoogvenster wordt gebruikt om de wijze waarop thresholded geselecteerde objecten worden gevisualiseerd kiest (figuur 2, pijl # 8).
    2. Klik op "Measure" in "zoeken" objecten "dialoogvenster (Figuur 2 pijl # 6) en selecteer de kanalen en soorten metingen. Typisch," Alle kanalen "en" Intensiteit en Volume Metingen "worden geselecteerd.
    3. Voor Population 2, gebruik instellingen hetzelfde als bij de hele getransfecteerde cel die op 1a R-GFP (5.5.9) te identificeren.
    4. Als meerdere cellen (inclusief getransfecteerde cellen met fluorescerende kleurstof-positieve vesicles) aanwezig zijn, snijden de cel in de eerste fase van het onderzoek kritisch. Als alternatief kan het gebruik van "grendelen" worden gebruikt om identificatie van lysosomen binnen de getransfecteerde cel die op 1a R-GFP beperken. Lysosomen mag alleen worden geïdentificeerd binnen de GFP cel enniet uit de buurt, ongetransfecteerde cellen.
    5. Analyseren en exporteren van gegevens als hierboven.
      Opmerking: Een voorbeeld van thresholded cellen en blaasjes is weergegeven in figuur 4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze representatieve reeks experimenten werden HEK cellen getransfecteerd met type 1a angiotensine receptor (AT 1a R-GFP) construct (E1,2,3-AT 1a R) gekloneerd in het plasmide pEGFP-N2 13. Time-lapse beelden van HEK werden verworven en speelde als een film (zie live cell imaging 1 en live cell imaging 2 films). De films en foto blijkt dat na ligand stimulatie, AT 1a R-EGFPs zijn voornamelijk gel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Voorlopige experimenten hier gepresenteerde illustreren dat over een vrij korte tijdsverloop van 24 min, geen merkbare verandering in de levering van AT 1a R-GFP aan de lysosomen plaatsgevonden. In het algemeen kan afgifte van geïnternaliseerd receptoren lysosomen al 15-20 min optreden. Dit experiment is consistent met de hypothese dat het merendeel van de geïnternaliseerde AT 1a R is gericht op grote perinucleaire endosomen. Bewijs dat althans een aantal op 1a R komt in lysosomen werd a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Het onderzoek dat in dit manuscript werd ondersteund door subsidie ​​R01 HL121456-01A1 aan Kathryn Sandberg. Dit werk werd ondersteund in aanvulling op de beschikbaarheid van een Leica SP8 AOB in de Microscopie en Imaging Shared Resource (MISR) aan Georgetown University Medical Center, die deels wordt gefinancierd door P30-CA051008 van de National Institutes of Health van de Verenigde Staten van Amerika. Wij dankbaar erkennen Leica SP8 imaging bijstand van Peter Johnson, en het gebruik van de Zeiss LSM880 in het laboratorium van Thomas Coate, Departement Biologie aan de Georgetown University met imaging bijstand van Alma Arnold van Carl Zeiss Microscopy LLC. De inhoud van dit manuscript is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Angiotensin II (Ang II)Sigma-AldrichA9525 
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)Gibco -ThermoFisher Scientific11960-044Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik 
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF2442Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik
Penicillin Streptomycin (Pen Strep)Gibco -ThermoFisher Scientific15140-122Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco (life technologies)25030-081Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik
Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cellenAmerican Type Culture Collection (ATCC) CRL-1573Passage nummer 5 - 12
Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass SystemSigma-Aldrich155409
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermoFisher Scientific11668019Bewaar bij 4 °C 
Opti-MEM, Reduced Serum MediumGibco- ThermoFisher Scientific31985-070Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik
PBS 10x Fisher BioReagentsBP3994Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) Gibco -ThermoFisher Scientific31053-028Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik
LysoTracker Red DND-99molecular probes -ThermoFisher ScientificL7528Bewaar aliquots in het donker bij -20 °C . 
Volocity Ver. 6.3 Image Analysis softwarePerkinElmerVisualization and Quantitation ModulesVoor 3D beeldanalyse van beeldastacks
Leica SP8 AOBSLeica Microsystemslaser scanning confocal microscopeVoor beeldacquisitie
Zeiss LSM 880Carl Zeisslaser scanning confocal microscopeVoor beeldacquisitie

Referenties

  1. Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
  2. Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
  3. Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
  4. Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
  5. Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206(2008).
  6. Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003(2010).
  7. Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
  8. Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
  9. Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
  10. Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
  11. Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26(2014).
  12. Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613(2016).
  13. Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
  14. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  15. Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
  16. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670(2015).
  17. Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
  18. Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Angiotensine receptor traffickingHEK 293 cellenGFP gelabelde receptorenlysosomale colocalisatie3D beeldanalysetime lapse imagingreceptorinternalisatiefluorescentiemicroscopie

Gerelateerde artikelen