Voorbereiding en evaluatie van 99m Tc-gelabelde tridentaat Chelates voor Pre-targeting Met behulp Bioorthogonal Chemistry

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor het radiolabelen en in vivo testen van tridentaat ^99mTc(I) chelaat-tetrazine afgeleiden voor pre-targeting en bioorthogonale chemie.

Samenvatting

Pre-targeting gecombineerd met bioorthogonale chemie ontwikkelt zich tot een effectieve manier om nieuwe radiofarmaca te creëren. Van de beschikbare methoden is de inverse elektrone-vraag Diels-Alder (IEDDA) cycloadditie tussen een radiogelabelde tetrazine en trans-cycloocteen (TCO) gekoppeld aan een biomolecuul bewezen als een zeer effectieve bioorthogonale aanpak voor het beeldvormen van specifieke biologische doelen. Ondanks het feit dat technetium-99m het meest gebruikte isotoop blijft in diagnostische nucleaire geneeskunde, is er een tekort aan methoden voor het bereiden van ^99mTc-gelabelde tetrazines. Hierin rapporteren we de bereiding van een familie van tridentaat-chelaat-tetrazine-derivaten en hun Tc(I)-complexen. Deze tot nu toe onbekende verbindingen werden radiogelabeld met ^99mTc met behulp van een microgolf-geassisteerde methode in 31% tot 83% radiochemische opbrengst. De producten zijn stabiel in zoutoplossing en PBS en reageren snel met TCO-derivaten in vitro. Hun in vivo pre-targeting capaciteiten werden aangetoond met behulp van een TCO-bisfosfonaat (TCO-BP) derivaat dat zich lokaliseert in gebieden met actieve botmetabolisme of letsel. In muizenstudies vertoonden de ^99mTc-tetrazines hoge activiteitsconcentraties in knieën en schoudergewrichten, wat niet werd waargenomen wanneer experimenten werden uitgevoerd in afwezigheid van TCO-BP. De algehele opname in niet-doelorganen en farmacokinetiek varieerde sterk afhankelijk van de aard van de linker en de polariteit van het chelaat.

Inleiding

^99mTc radioisotoop nog steeds het meest gebruikt in de diagnostische nucleaire geneeskunde, met meer dan 50 miljoen beeldvormende procedures uitgevoerd per jaar wereldwijd ^{1, 2, 3.} De meeste ^99mTc middelen klinisch gebruikte soort perfusie radiofarmaca. Er zijn een beperkt aantal actief gerichte verbindingen waarin ^99mTc is gericht op een specifieke biomerker ligatie tot binden aan een targeting construct. Ontwerp van gerichte ^99mTc radiofarmaca wordt vaak belemmerd door de invloed van ^99m Tc-ligand-complexen op het vermogen van de richtende molecule om de biomarker plaats binden, of isotopen halfwaardetijd te kort is voor gebruik met een hoger gewicht biomoleculen moleculair zoals antilichamen. Dit laatste vereist meestal enkele dagen voor afbeeldingen in volgorde worden verworven voor de biomolecuul te verwijderen uit non-target tiss UES. Pre-targeting biedt een alternatieve benadering van deze uitdagingen te overwinnen.

Pre-targeting gecombineerd met bioorthogonal chemie is aangetoond dat het een effectieve manier om nieuwe moleculaire beeldvorming probes voor zowel fluorescentie en radio-imaging ^{4, 5, 6, 7, 8} ontwikkelen. De inverse vraag elektron Diels-els (IEDDA) reactie tussen 1,2,4,5-tetrazine (Tz) en trans -cyclooctene (TCO) derivaten, zoals weergegeven in figuur 1, is bijzonder effectief gebleken ⁶ te zijn. De IEDDA reactie met deze componenten kunnen snel kinetiek vertonen in PBS (k ₂ ≈ 6000 M ^-1 s ^-1) en hoge selectiviteit, waardoor het ideaal is voor in vivo pre-targeting toepassingen ^{9, 10.}

e_content "> De meest voorkomende aanpak omvat het toedienen van een TCO-afgeleide targeting vector en na een voldoende vertraging periode, is een radioactief tetrazine toegediend. Radioactief gemerkt tetrazine gebaseerd op ¹¹ C, ¹⁸ F, ⁶⁴ Cu, ⁸⁹ Zr en ¹¹¹ In zijn geweest meldde ^{11, 12, 13, 14, 15.} daarentegen is er slechts een rapport van een ^{99mTc-gelabelde} Tz, dat werd bereid onder toepassing van een HYNIC soort ligand die het gebruik van co-liganden voor eiwitbinding en afbraak in vivo voorkomen ^16. Als alternatief beschrijven we hier de synthese van ^99m Tc (I) gemerkt met een tetrazine familie van liganden die stabiele tridentate complexen vormen met een ^[99mTc (CO) _3] ⁺ kern.

Figuur 1: De bioorthogonal IEDDA reactie tussen tetrazine en trans -cyclooctene. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De familie van liganden bevatten bereid drietandige chelaten die variëren in polariteit en de aard van de verbindingsgroep tussen het metaal en het bindingsgebied Tz (figuur 2). Het doel was om een ^{99mTc-tetrazine} construeren die effectief kunnen lokaliseren en reageren met TCO-gelabelde plaatsen in vivo en snel duidelijk wanneer niet gebonden identificeren om hoge target-to-non-target-verhoudingen verkregen. De liganden te testen, een TCO-derivaat van een bisfosfonaat (TCO-BP) gebruikt ^17. We hebben eerder aangetoond dat TCO-BP lokaliseert gebieden actieve botmetabolisme en kan reageren metradiolabeled tetrazine in vivo ^18. Het is handig om nieuwe reagens tetrazine testen, omdat het kan worden bereid in een enkele stap en experimenten kunnen worden uitgevoerd bij normale muizen waarbij lokalisatie vindt voornamelijk plaats in de gewrichten (knieën en schouders).

Protocol

Animal studies werden goedgekeurd door de Animal Research Ethics Board van de McMaster University in overeenstemming met de Canadese Raad over Animal Care (CCAC) richtlijnen.

1. Radioactief merken van Tz-tridentaat liganden met ^99mTc

VOORZICHTIG: De volgende procedures vereisen het gebruik van radioactieve verbindingen. Werk mag alleen worden gedaan in een erkend laboratorium met de naleving van veiligheid en milieu voorschriften. Magnetron moeten uitgevoerd worden in een magnetron speciaal voor chemische synthese.

1. Synthese van ^[99mTc (CO) _{3 (H2O) 3]} ^{+ 19, 20}
   1. In een magnetron flesje combineren 8 mg _K2 [BH ₃ CO _2], 15 mg Na ₂ CO _3, 20 mg Na ₂ B ₄ O ₇ · 10H ₂ O en 25 mg KOCO [CH (OH)]₂ COONa · 4H ₂ O. Purge het flesje gedurende 10 minuten met argon gas.
   2. Voeg 4 ml ^99m TcO ₄ ^- (~ 1100 MBq, ~ 30 mCi) in 0,9% zoutoplossing aan het flesje.
   3. Verwarm de reactie in een magnetron gedurende 3,5 minuten bij 110 ° C na 10 s roeren om grondig mengen van de reagentia te garanderen.
   4. Stel de pH van de oplossing 3,5-4 gebruik ~ 400 pi van 1 M HCl. Controleren met behulp van pH-papier.
2. Radioactief merken van tetrazine liganden 1-5
   1. Los 2 mg van elk ligand (verbindingen 1-5) in 250 ul MeOH ^21.
   2. Voeg 250 ul van ^[99mTc (CO) _{3 (H2O) 3]} ⁺ (~ 74 MBq, ~ 2 mCi) aan elke oplossing.
   3. Verwarm het reactiemengsel in de magnetron gedurende 20 minuten bij 60 ° C.
      LET OP: Deze stap was identiek voor alle 5 tetrazine.
   4. Voor verbindingen 2- 5, damp het oplosmiddel en opnieuw dissolve de resulterende producten in 1 ml 1: 1 v / v DCM: TFA.
   5. Verwarm de opgeloste reactieproducten (2-5) bij 60 ° C in een magnetron gedurende 6 min (2-4) of 10 min (5).
   6. Na afkoelen tot kamertemperatuur, damp het oplosmiddel met behulp van een verdamper (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm) en los het gedroogde verbinding in 1: 1 ACN: H ₂ O of 1: 1 MeOH: _H2O, voorafgaand aan HPLC zuivering.
   7. Zuiver het ^{99mTc-gelabelde} verbindingen (1-5), met inbegrip van het scheiden van het gemerkte product uit ongelabelde ligand tetrazine, middels HPLC _(C-18 omgekeerde fase). Typisch gebruik van een elutiegradiënt van 30:70 ACN: _H2O (beide met 0,1% TFA) tot 40:60 ACN: _H2O gedurende 20 min (18 min) en een analytische 4,6 x 100 mm kolom C _18. Gebruik beide UV (254 nm) en gamma detectie.
      1. Neem een ​​klein monster van elk gemerkt product en vergelijk de HPLC retentietijd met die van een co-injecteerd, niet-radioactieve, Re-gemerkte standaard (0,125 mg in 20% methanol-H ₂ O). De-Re gemerkte standaard wordt in de UV HPLC spoor en elueren tegelijkertijd de ^{99mTc-gelabelde} verbinding in het γ-HPLC trace. Deze co-injectie toont pieken bij vergelijkbare retentietijden bevestigt de identiteit van de ^{99mTc-gelabelde} verbinding.
   8. Verdamp het oplosmiddel van HPLC fracties met een verdamper (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm).
   9. Formuleren de gezuiverde verbinding in een concentratie van 7,4 kBq / ul in PBS, bevattende 0,5% BSA en 0,01% Tween-80.
   10. Ter controle van de gemerkte verbindingen stabiel Voer een in vitro stabiliteitsonderzoek. Incubeer de geformuleerde verbinding bij 37 ° C gedurende 1, 4 en 6 uur, het injecteren van een kleine hoeveelheid (3,7 MBq) van het mengsel op HPLC op elk tijdstip om de stabiliteit te beoordelen.

2. Pre-gerichte Bio-distributie Studies

1. Voorbereiding van de dieren
   1. Gebruik 7-9 weken oude, vrouwelijke Balb / c muizen (n = 3) toedienen TCO-BP geformuleerd in een zoutoplossing (20 mg / kg) (5 ug / ul) via-staartader injectie.
   2. Plaats de muis in fysieke fixatie apparaat, en identificeren van de aderen op de zijvlakken van de staart en veeg met een alcoholdoekje. Op ongeveer 2 cm van het uiteinde van de staart, plaats een 30-gauge naald onder een kleine hoek, evenwijdig aan de ader. Langzaam op de zuiger om te injecteren, verwijder de naald en breng schoon gaasje spons op de injectieplaats met een lichte druk totdat het bloeden stopt.
   3. Op 1 uur na de injectie van TCO-BP, beheren ~ 0,74 MBq (20 uCi) van ^99m Tc-tetrazine geformuleerd in 100 ul van 0,5% BSA, 0,01% Tween-80 in PBS, via-staart ader injectie.
2. Bio-distributie studies
   1. Op het gewenste tijdstip (t = 6 uur), verdoven de muizen middels 3% isofluraan en 2% zuurstof gasmengsel. Aantonen dat er een aane snufje terugtrekking van de verdoofde muis om te zorgen dat ze onder chirurgische vlak van anesthesie.
   2. Verzamelen van bloed (1 ml) via hartpunctie met een injectiespuit voorbehandeld met heparine. Plaats de muis op zijn rug met de neus in de neuskegel voor verdere anesthesie en zoek de zwaardvormig proces op het dier.
      1. Plaats een 25 G naald, enigszins links van middellijn van het dier onder de processus xiphoideus, bij een 20 ° hoek. Steek de naald, en langzaam terug te trekken op de zuiger om bloed te zien in de naald hub als het hart werd doorboord. Iets passen de naald terwijl u de zuiger, indien nodig, naar het hart doorboren. Langzaam trekken bloed in de spuit.
   3. Euthanaseren het dier door cervicale dislocatie, terwijl onder verdoving.
   4. Plaats elk dier in een plastic zak en gebruik een calibrator ^(99mTc instelling) op het geheel activiteit te meten.
   5. Verzamel de volgende weefsels en vloeistoffen in de pre-wegened telbuizen: bloed, bot (knie en schouder), galblaas, nieren, lever, maag (met inhoud), dunne darm (met inhoud), dikke darm en blindedarm (met inhoud), de schildklier en luchtpijp, urineblaas met urine en staart.
   6. Spoel de juiste weefsels (met uitzondering van bloed, galblaas en urineblaas) in PBS om bloed te verwijderen en dep droog is voordat u de weefsels in juiste telbuizen.
   7. Plaats dier karkas in een plastic zak en meet resterende hele lichaam activiteit met een dosiskalibrator.
   8. Weeg elke buis bevattende een weefselmonster. Trek aanvankelijke gewicht van de buis om de massa van het weefsel te verkrijgen.
   9. Gebruik een calibrator ^(99mTc instelling) tot de hoeveelheid activiteit in een monster (100 pi) op het moment van injectie voor elke muis gemeten.
      Opmerking: Dit monster is gelijk aan het injectievolume, waardoor de telling activiteit op het moment van injectie.
   10. Op het moment van meting weefsel, eenliquot 5 pi van het monster eerder gebruikte. Gebruik een multi-detector gammateller ^(99m Tc instelling) en tel tot de telling per minuut (CPM) te verkrijgen voor de 5 pi monster.
   11. Gebruik de twee waarden verkregen in 2.2.9 en 2.2.10 van de activiteit en CPM relatie met vergelijking 1 tot een omrekeningsfactor (CPM uCi ^-1) te verkrijgen berekenen.
       (1)
   12. Gebruik de gammateller om de hoeveelheid radioactiviteit in elk weefsel of vloeistofmonster.
   13. Gebruik formule 1 om de hoeveelheid activiteit in elk weefsel of vloeistof op het tijdstip van de meting ten opzichte van het totale geïnjecteerde dosis te berekenen. Deze waarde wordt vervolgens genormaliseerd door orgaangewicht en gerapporteerd als percentage geïnjecteerde dosis per gram (dwz% ID / g) weefsel.
   14. Volg stappen 2.1.2 tot 2.2.13 een negatieve controle experiment met de ^{99mTc-gelabelde} liganden tetrazine in de afwezigheid opce van TCO-BP. Offer muizen (n = 3) op 0,5, 1, 4 en 6 uur na de injectie en het verkrijgen van weefsel of vloeistof zoals hierboven beschreven.

Resultaten

De liganden werden gesynthetiseerd met verschillende linkers en chelatoren met eenvoudige reductieve aminering strategie (figuur 2), gevolgd door koppeling van het product aan een commercieel verkrijgbare tetrazine ^{22, 23.} Radiolabeling werd uitgevoerd met dezelfde werkwijze voor alle verbindingen en was zeer reproduceerbaar. Het proces werd geoptimaliseerd door het variëren van de pH, hoeveelheid ligand, reactie...

Discussie

Een verzameling van gekoppelde tetrazine tridentaat chelaten van verschillende polariteiten bereid en het nut van de ^99mTc complexen in de IEDDA reactie met een TCO derivaat in vivo onderzocht. Een effectief en reproduceerbaar Tc ^99m labeling methode ontwikkeld vijf tetrazine-chelaten, waarbij het ligand concentratie 10 ^-3 M. Het labeling stap werd gevolgd door ontscherming van t-butylgroepen (voor verbindingen 2-5). De hoge concentratie ligand werd geb...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Argon gas	Alphagaz	---	---
Na2CO3	EMD Millipore	106395	---
Na2B4O7·10H2O	Anachemia	S9640	---
KNaC4H4O6·4H2O	Anachemia	217255	---
Technelite 99mTc generator	Lantheus medical imaging	---	Bron van 99mTcO4-
0.9% Saline	Lantheus medical imaging	---	Om de generator te elueren
1 M HCl	Lab Chem	---	---
MeOH	Caledon	---	---
ACN	Caledon	---	HPLC kwaliteit
Millipore H2O	Thermo Fisher Scientific	Barnstead Nanopure	---
DCM	Caledon	---	---
TFA	Caledon	---	---
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4 1x
BSA	Sigma Aldrich	A7906	---
Tween80	Sigma Aldrich	P8047	---
Isoflurane	CDMV	108737	Leverancier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC	Waters	1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590)	---
HPLC kolom voor analyse en zuivering van verbindingen 2-4	Phenomenex	00G-4435-E0	Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC kolom 250 x 4.6 mm
HPLC kolom voor analyse en zuivering van verbindingen 1 en 5	Waters	186003115	XBridge BEH C18 kolom, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm x 100 mm
Microwave Reactor	Biotage	Initiator 8	---
Biotage V10 Evaporator	Biotage	Serienummer # V1041	---
Dose kalibrator	Capintec, Inc.	CRC-25R	---
Gammateller	Perkin Elmer	Wizard 1470 Automatic Gamma Counter	---
Dierenkamerweegschaal	Mettler Toledo	XP105 Delta Range	---
Microwave vials	Biotage	355629	0.5-2 mL