Methodenartikel

A Simple Red Blood Cell Lysis Methode voor de oprichting van B lymfoblastoïde cellijnen

DOI:

10.3791/55191

⸱

14 januari 2017

 ,  , 
1Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een eenvoudige rode bloedcel lysis methode voor het vaststellen van B-LCL werd ontwikkeld met hoge efficiency immortalisatie, die een kleine hoeveelheid bloed en tijdsbesparing van initiatie tot cryopreservatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn een aantal methoden voor de transformatie van B-lymfocyten door het Epstein Barr-virus in vitro in geïmmortaliseerde cellijnen. We hebben een nieuwe methode ontwikkeld met een krachtige en eenvoudige strategie voor de oprichting van B-LCL's, de rode bloedcel lyse methode. Deze methode vereenvoudigde de PBMC-scheidingsprocedure met verwijdering van rode bloedcellen en gebruikte slechts 0,5 ml vol bloed voor het opzetten van EBV-geïmmortaliseerde cellijnen, die kunnen prolifereren tot grote celnummers in een relatief korte tijd met een succespercentage van 100%. De methode is eenvoudig, betrouwbaar, tijdbesparend en toepasbaar op een groot aantal klinische monsters.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rustende B-cellen kunnen worden getransformeerd door het Epstein-Barr virus (EBV) in vitro in actief proliferende B-lymfoblastoïde cellijnen (B-LCL's). B-LCL's zijn vergelijkbaar met kiemcellen in differentiatie en ontwikkeling, en de somatische mutatiesnelheid van B-LCL's was slechts 0,3%1, met verwaarloosbare genetische en fenotypische veranderingen. Daarom hebben B-LCL's, als surrogaat voor perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's), de voortgang van genomics, transcriptomics en proteomics studie van EBV-geassocieerde ziekten2,3 aanzienlijk versneld. Bovendien hebben B-LCL's ook een belangrijke toepassing bij het screenen van monoklonale antilichamen4,5.

Er zijn verschillende methoden ontwikkeld voor het immortaliseren van B-lymfocyten door EBV. De meest voorkomende procedures omvatten de isolatie van B-lymfocyten en het gebruik van B95-8-cellijnen om infectieus EBV te produceren. Van isolatie tot transformatie zijn deze methoden onderverdeeld in drie strategieën. Lymfocyten worden gescheiden van vers bloed door dichtheidsgradientcentrifugatie en directe EBV-transformatie6-8, genoemd dichtheidsgradientscheidingsmethode in deze studie. Andere technieken overwinnen echter de moeilijkheid van het verzenden van vers bloed en gebruiken een procedure voor het invriezen van gezuiverde lymfocyten en daaropvolgend ontdooien en EBV-infectie9-11. Geconserveerd volbloed kan ook worden gebruikt voor de isolatie van B-lymfocyten en transformatie12,13. Naast dichtheidsgradientcentrifugatie om B-lymfocyten te scheiden, gebruiken sommige onderzoekers een magnetische celscheider om B-lymfocyten te selecteren12. Magnetische scheiding is echter een dure, complexe en tijdrovende procedure. Hoewel deze methoden nuttig zijn om B-lymfocyten te immortaliseren met een hoge succesratio, vereisen de behandeling van een groot aantal klinische monsters en het relatief kleine bloedvolume een eenvoudigere methode voor de oprichting van een permanente cellijn.

Een andere, minder vaak gebruikte methode is het gebruik van volbloed als bron van gekernde cellen voor EBV-infectie en de oprichting van B-LCL's. Deze methoden vereenvoudigen de techniek door de scheidingsprocedure weg te laten. Slechts een kleine hoeveelheid volbloed, vers14 of bevroren15,16, is voldoende om de cellijnen te verkrijgen. Helaas is er veel variabiliteit in succes vanuit documenten15,16 en verschillende van onze validatietests. Bovendien zijn getransformeerde kolonies nauwelijks onder de microscoop te herkennen vanwege de grote verontreinigende onzuiverheden. Daarom is een betrouwbaardere methode voor transformatie vereist.

Op basis van de bovenstaande overwegingen hebben we een nieuwe methode ontwikkeld om B-LCL's op te richten zonder voorafgaande zuivering van de lymfocyten, genoemd de rode bloedcel-lyse-methode. Deze methode is handig, tijdbesparend en toepasbaar op een groot aantal monsters. Zo weinig als 0,5 mL volbloed was voldoende om B-LCL's te verkrijgen die gemakkelijk verkrijgbaar zijn van baby's en ouderen zonder hun gezondheid aanzienlijk te schaden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Instituut voor Genetica en Developmental Biology, en het protocol volgt de institutionele richtlijnen voor het menselijk welzijn.

1. Bereiding van EB Virus

  1. Op dag 1, ontdooien B95-8 cellen en kweek in 6 ml compleet RPMI 1640 medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine en antibiotica (100 pg / ml streptomycine, 100 U / ml penicilline) in een T25 kolf. Plaats de kolf in 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
  2. Op dag 2, acht de cel morfologie onder een microscoop. Cellen zijn in goede conditie als ze zijn licht en rond. Voeg 10 ml compleet RPMI 1640 medium.
  3. Op dag 4, voeg 10 ml vers compleet RPMI 1640 medium, en vervolgens over een T75 kweekfles.
  4. Op dag 8, voeg 20 ml compleet RPMI 1640 medium.
  5. Handhaaf de cellen gedurende 8 dagen zonder toevoeging van vers medium, dat wil zeggen, verhongering.
  6. Op dag 16, acht cellenWaargenomen onder de microscoop. Verzamel de cellen in een 15 ml centrifugebuis, 12 ml / buis.
  7. Cryo-behouden bij -80 ° C gedurende 1 uur, en vervolgens snel ontdooien bij 37 ° C. Herhaal 3 totdat het virusdeeltjes vrijkomen uit de cellen.
  8. Centrifugeer bij 240 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
  9. Filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,22 urn filter, portie, 12 ml / buisje en bewaar bij -80 ° C.

2. Behandeling van volbloed met rode bloedcel lysisbuffer

  1. Voeg 0,5 ml volbloed antistolling door EDTA · K 2 tot 15 ml buis.
  2. Zet 1 ml rode bloedcellen lysis buffer (gefiltreerd door 0,22 urn filter en ontdooid tot kamertemperatuur vóór gebruik) het bloed en meng goed. Plaats het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 4 min. snel 7 ml 1x PBS aan de aanslag reactie - voeg dan 5.
  3. Centrifugeer bij 240 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Witte bloedcellen neerslaan op de bodem van de buis.
  4. Verwijder het supernatant, en was de neerslag door toevoeging van 7 ml 1640 basisch medium. Centrifugeer 5 min bij 240 xg bij kamertemperatuur. Herhaal dit twee keer.
  5. Resuspendeer de celpellet in 300 ul transformatie medium (RPMI 1640 medium dat 20% foetaal runderserum en 10 pg / ml fytohemagglutinine (PHA)).

3. EBV-infectie

  1. Voeg 60 ul van 20 ug / ml cyclosporine A (CsA) aan de celsuspensie.
  2. Snel ontdooien een hoeveelheid EBV bij 37 ° C. Voeg 240 ul EBV aan de celsuspensie.
  3. Meng goed en zet de celsuspensie op een 96-well plaat, 200 ul per putje. Verdamping plaatsvindt, voeg 200 ul 1x PBS aan elke well wordt rond de 96-well plaat. Plaats de plaat in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.

4. Uitbreiding en cryopreservatie van B-LCL

  1. Verander de helft van het medium eenmaal per week gedurende de eerste maand na EBV infectie. Alleen een dikke layer uit celfragmenten zichtbaar onder de microscoop op dag 7 (Figuur 2). Na een maand van EBV infectie lymfoblastoïde celclusters zichtbaar onder een dikke laag celfragmenten onder de microscoop (Figuur 2).
  2. Verander de helft van het medium om de 3 dagen tot de celgroepen duidelijk zichtbaar onder de microscoop (Figuur 2). Meestal is dit proces duurt 10 tot 20 dagen.
  3. Na mengen Pipetteer de cellen en overbrengen naar de 24-well plaat. Het dubbele van het volume van het kweekmedium met volledig RPMI 1640, terwijl het geel wordt. Dit proces is afhankelijk van de snelheid van celgroei.
  4. Vervolgens brengen de cellen T25 kweekfles. Het dubbele van het volume van het kweekmedium zo blijkt gele totdat het volume van het medium uit tot 10 - 15 ml.
  5. Verander medium 24 uur voor het invriezen. Centrifugeer celsuspensie gedurende 5 minuten bij 240 x g. Aantal cellen met een celteller en bevriezen bij een dichtheid van 5-10 x 10 6 / mL in frozen voorraadoplossing die 90% FBS en 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Invriezen bij een snelheid van 1 ° C per minuut tot -80 ° C en breng onmiddellijk in vloeibare stikstof.

5. 3- (4,5-dimethylthiazool-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay 17

  1. Bereid een B-LCL enkele celsuspensie met 1640 medium dat 10% foetaal runderserum. Zaad 3 x 10 4 cellen per putje op 96-well plaat, 100 ul per putje.
  2. Plaats de plaat in 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 12-16 uur.
  3. Voeg MTT (5 mg / ml) aan putjes die cellen groeien en weg te houden van licht gedurende 4 uur bij 37 ° C.
  4. Centrifuge cel plaat gedurende 10 minuten bij 168 x g.
  5. Verwijder supernatant en voeg 100 ul DMSO per putje.
    LET OP: Wees voorzichtig. Raak de naaldvormige kleurstof kristallen.
  6. Schud de plaat gedurende 10 minuten bij lage snelheid om de kristallen volledig te ontbinden.
  7. Meet absorptie bij 570 nm doormet behulp van een microplaat spectrofotometer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tijdens het transformatieproces worden de morfologische veranderingen van de cellen gevisualiseerd door lichtmicroscopie (figuur 2). Kleine clusters van cellen waren duidelijk zichtbaar met de dichtheidsgradiënt scheidingsmethode 7 dagen na infectie, terwijl slechts een dikke laag celfragmenten zijn zichtbaar vanaf de rode bloedcellen lysismethode. Echter, lymfoblastoïde cel clusters zijn zichtbaar onder de dikke laag celfragmenten 30 dagen na infectie. Met frequentere m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij rapporteren de ontwikkeling van een nieuwe werkwijze voor het onsterfelijk maken van humane B cellen uit bloed door lyseren van rode bloedcellen en de cellevensvatbaarheid van gevestigde B-LCL werd geëvalueerd door de MTT-bepaling. De resultaten toonden aan dat de cellevensvatbaarheid van de bij de rode bloedcel lysis methode B-LCL veel hoger dan die van de dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze. Het grote voordeel van de rode bloedcellen lysis methode is dat het eenvoudig en vereist een klein volume (slechts 0,5 ml...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de belangrijkste projecten van de Chinese Academie van Wetenschappen (KFZD-SW-205), strategisch ondersteuningssysteem voor biologische bronnentechnologie van de Chinese Academie van Wetenschappen (CZBZX-1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CentrifugeTechcompCT6TCentrifugation
Automated Cell Counter Countstar IC 1000 Voor celtelling 
Epoch Microplate SpectrophotometerBioTek InstrumentsSN263839Voor het meten van de absorptie
96 well cell culture clusterCorning Incorporated3599Polystyreen platen
24 well cell culture clusterCorning Incorporated3524Polystyreen platen
25 cm2 cell culture flaskNest707001Polystyreen 
FBSGibco10270Onderdeel van B-LCLs medium
RPMI Medium 1640Gibco31800-022Voor B-LCLs medium
L-Glutamine  Amresco0374Onderdeel van B-LCLs medium
100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309Onderdeel van B-LCLs medium
Ficoll paque plusGE  Healthcare17-1440-03Voor in vitro isolatie van lymfocyten
PHA-MSigmaL8902Voor het stimuleren van lymfocytproliferatie
Cyclosporin ACayman  Chemical12088Voor het remmen van het cytotoxiciteitseffect van T-cellen
Red cell lysis bufferTiangenRT122-01Voor het lysen van rode bloedcellen
MTTAmresco0793Voor de detectie van cellevensvatbaarheid
DMSOSigmaD2650Voor het bevriezen van cellen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
  2. Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118(2006).
  3. Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
  4. Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
  5. Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
  6. Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
  7. Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
  8. Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
  9. Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
  10. Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
  11. Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
  12. Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
  13. Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
  14. Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
  15. Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
  16. Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
  17. Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
  18. Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
  19. Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
  20. Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
  21. Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22(2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EBV transformatieverwerking van volbloedmononucleaire cellen uit perifeer bloedbehandeling met cyclosporine AMTT viabiliteitsassaycryopreservatieprotocolEBV virusproductieexpansie van celculturen

Gerelateerde artikelen