Lokale Field fluorescentiemicroscopie: Beeldvorming van cellulaire signalen in Intact Hearts

Samenvatting

In het hart, moleculaire gebeurtenissen coördineren van de elektrische en contractiele functie van het orgel. Een set van de lokale veld fluorescentiemicroscopie technieken hier gepresenteerde maakt de registratie van cellulaire variabelen in intacte harten. Het identificeren van mechanismen voor het definiëren van de hartfunctie is van cruciaal belang in het begrijpen hoe het hart werkt onder pathologische situaties.

Samenvatting

In het hart, zijn moleculaire signalering studies meestal uitgevoerd in geïsoleerde myocyten. Veel pathologische situaties, zoals ischemie en hartritmestoornissen kunnen alleen volledig worden begrepen op het gehele orgaan niveau. Hier presenteren we de spectroscopische techniek van het lokale veld fluorescentie microscopie (LFFM) dat de meting van cellulaire signalen in het intacte hart toelaat. De techniek is gebaseerd op een combinatie van een Langendorff geperfundeerde hart en optische vezels fluorescentiesignalen nemen. LFFM heeft verschillende toepassingen op het gebied van cardiovasculaire fysiologie het hart te bestuderen onder normale en pathologische omstandigheden. Meerdere cardiale variabelen kunnen worden gevolgd met verschillende fluorescente indicatoren. Deze omvatten cytosolisch [Ca ^2+], intra-sarcoplasmatisch reticulum [Ca ^2+] en membraan potentials. De exogene fluorescerende probes zijn enthousiast en de uitgezonden fluorescentie gedetecteerd met drie verschillende arrangementen van LFFM epifluorescentie technieks in dit document. Het centrale verschil tussen deze technieken zijn de soort lichtbron voor excitatie en onderweg het excitatielicht wordt gemoduleerd. De gepulseerde LFFM (PLFFM) maakt gebruik van laser lichtpulsen, terwijl continue golf LFFM (CLFFM) maakt gebruik van continue laserlicht voor excitatie. Tenslotte, light-emitting diodes (LED's) gebruikt als een derde lichtbron. Deze niet-coherente opstelling wordt genoemd gepulseerd LED fluorescentie microscopie (PLEDFM).

Inleiding

Het hart is het centrale orgaan van het cardiovasculaire systeem. Samentrekking van het hart wordt geïnitieerd door een toename van intracellulaire [Ca2 ^+]. De relatie tussen de elektrische prikkelbaarheid en veranderingen in de intracellulaire Ca ²⁺ release van oudsher bestudeerd in enzymatisch gedissocieerde cellen ^{1, 2.} Echter, hartcellen elektrisch, metabolisch en mechanisch gekoppeld ^{3, 4.} Wanneer die de myocyten zijn niet alleen fysiek ontkoppeld, maar myocyten uit verschillende lagen worden gemengd tijdens de dissociatie ^5. Verder ondanks de enorme voordelen die uit de studie van geïsoleerde cellen ontstaan onder voltage clamp omstandigheden, ^{6, 7, 8} de intrinsieke aard van het hart als een syncytium elektrische always stelt de vraag hoe functioneel verschillende worden gescheiden cellen van de aanwezigen in het weefsel ^3.

In dit manuscript beschrijven we de vooruitgang in de kennis van hartfysiologie verkregen door middel van lokale veld fluorescentiemicroscopie (LFFM) technieken in het intacte hart. LFFM gebruikt fluorescente indicatoren voor verschillende fysiologische variabelen zoals cytosolische Ca2 ^+, intra sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca2 ⁺ en membraanpotentiaal meten. Deze metingen kunnen gelijktijdig en in combinatie verkrijgbaar ventrikeldruk ^{9, 10, 9} elektrocardiogrammen, elektrische actiepotentialen (AP's), ionenstroom opnames en flitsfotolyse gekooide verbindingen ^{4, 11.} Bovendien kunnen deze metingen worden verkregen door pacing het intacte hart op hogere frequenties closer om fysiologische tarieven. Hoewel verschillende artikelen ^{9, 11, 12, 13, 14} zijn door de groep met behulp van LFFM technieken gepubliceerd, heeft het vermoeden van de technische complexiteit in verband met deze techniek het massale gebruik voorkomen in het bestuderen van ex vivo fysiologische verschijnselen in het hart en andere organen.

LFFM de techniek (figuur 1) is gebaseerd op epifluorescentie metingen verkregen met een multimode optische vezel in contact met het weefsel. Als contact fluorescentie beeldvormende techniek, de optische resolutie hangt af van de diameter en de numerieke apertuur (NA) van de vezel. Een hogere NA en kleinere diameter van de vezel wordt de ruimtelijke resolutie van de meting verhogen. NA en vezeldiameter kan variëren 0,22-0,66 en van 50 urn tot 1 mm, respectievelijk. Invouwen het NA zal de signaal-ruisverhouding (S / N) te verbeteren door aanvaarding fotonen aankomen uit een grotere ruimtehoek. Om te werken als een epifluorescentie inrichting wordt het licht gefocusseerd op de optische vezel met een asferische lens of een epifluorescentie doelstelling waarbij de NA van de lens en de vezel spel. Deze matching maximaliseert de energie-overdracht voor excitatie en voor het verzamelen van de rug van de fotonen uitgezonden door het fluorofoor.

Om de exogene fluorescente indicatoren in het weefsel prikkelen geladen kunnen verschillende lichtbronnen en verlichtingsmodi worden gebruikt. Onze baanbrekende studies met behulp van de gepulste lokale veld fluorescentiemicroscopie ^{3, 12} (PLFFM) gebruik van een low-cost picoseconde laser (figuur 1a, PLFFM). Dit type lichtbron biedt het enorme voordeel van het opwekken van een grote fractie van fluorofoor moleculen onder de verlichtingsgebied zonder significante bleken van de kleurstof te wijtende korte pulsduren ^12. Bovendien kan het gebruik van ultrakorte pulsen mag de beoordeling van de fluorescentie levensduur van de kleurstof ^12. De fluorescentie levenstijd is een eigenschap die kan worden gebruikt om de fractie van kleurstofmoleculen gebonden aan Ca2 ⁺ te kwantificeren. Helaas, de temporele jitteren van de pulsen en variaties in amplitude van puls-tot-puls kan zij de toepassing van deze experimentele strategie op gevallen waarin de verandering in fluorescentie door de ligandbinding aan de kleurstof groot.

Continuous Wave (CW) lasers worden meestal gebruikt als de belangrijkste lichtbron in LFFM (figuur 1b, CLFFM). De laserstraal kan continu branden het weefsel of kan ferroelektriciteit worden gemoduleerd. De ferroelektrische van de bundel maakt de generatie van microseconden lichtpulsen. Deze modulatie kan worden gecontroleerd door externe hardware. Deze procedure vermindert niet alleen drastisch tHij tijdelijke jitteren van lichtpulsen, maar maakt het ook mogelijk het mengen van bundels van verschillende golflengten. Het mengen van bundels gebeurt door multiplexen stralen van verschillende lasers. Bijgevolg kunnen meerdere kleurstoffen met verschillende spectrale eigenschappen worden opgewekt op de metingen van verschillende fysiologische variabelen te voeren, bijvoorbeeld Rhod-2 voor cytosolische Ca2 ^+, MagFluo4 voor intra-SR Ca2 ⁺ en di-8-ANEPPS voor membraanpotentiaal.

Hoewel lasers aanwezig zijn verschillende voordelen als lichtbron in LFFM, kunnen andere soorten lichtbronnen worden gebruikt, waaronder light-emitting diodes (LED's). In dit geval, de excitatie lichtbron bestond uit een InGaN LED (figuur 1c, PLEDFM). LEDs worden fotonen spontaan afgegeven wanneer elektronen uit de geleidingsband recombineren met gaten in de valentieband. Het verschil met solid-state lasers is dat de emissie niet gestimuleerd door andere fotonen. Dit resulteert in een niet-coherente bundel eneen bredere spectrale emissie voor LEDs.

Verschillende soorten high power LEDs kunnen worden gebruikt. AP opnamen behulp di-8-ANEPPS en Ca ^{2 +} transiënten opgenomen middels Fluo-4 of Mag-Fluo-4, we een LED die een gemiddelde piek emissie bij 485 nm (blauw) en een halfwaardebreedte van 20 nm gebruikt (figuur 1d). Voor Ca2 ⁺ transiënten opgenomen met Rhod-2, de LED had een typische piek emissie bij 540 nm (groen) en een halfwaardebreedte van 35 nm (figuur 1d). LED's uitzenden in een band golflengte en vereisen daarom filters om hun spectrale emissie te beperken. Bovendien kan gepulseerd licht bij een frequentie van 1,6 kHz met een duur van 20 ps worden gegenereerd. De LED's werden gepulseerd met een snelle MOSFET veld effect transistor. Gelijktijdige opnamen met verschillende indicatoren kan worden uitgevoerd door multiplexen in de tijd de LED's. Helaas, licht uitgezonden door LED's moeilijker zijn om op een vezeloptische vergelijking met een laserbundel. Dus de belangrijkste nadeel van onsing LEDs is dat hun emissie profielen hoekverplaatsingen (± 15 °) van de hoofdas, en een extra optische worden gebruikt om dit te corrigeren.

In alle optische configuraties eerder beschreven, wordt het gereflecteerde excitatielicht met behulp van een dichroïsche spiegel. De bundel wordt vervolgens gefocusseerd door een asferische lens en een microscoopobjectief op een multimode glasvezel die is gepositioneerd op het weefsel. Volgens een epifluorescentie opstelling de dichroïsche spiegel dient ook om de excitatie scheiden van het uitgestraalde licht. Het uitgestraalde licht spectrum reist terug door een barrière filter om eventuele gereflecteerde excitatie verwijderen. Tenslotte wordt het uitgezonden licht zich een objectief op een fotodetector (figuur 1).

De transductie van licht naar elektrische stroom wordt uitgevoerd door silicium avalanche fotodiodes. Deze diodes hebben een snelle reactie en een hoge gevoeligheid waardoor weinig licht detectie. Defotostroom van de avalanche fotodiodes kan worden geamplificeerd in twee manieren: a transimpedantieversterker met een resistief terugkoppelelement (Figuur 1e) of door een integrator om actuele zetten in een spanning (Figuur 1f). Met de eerste benadering, de uitgangsspanning evenredig is met de fotostroom en de terugkoppelweerstand. Een typisch voorbeeld van de resistieve detectie van picoseconde laserpulsen wordt getoond in figuren 2a, 2b en 2c. Panel 2a illustreert de uitgang van de transimpedantieversterker en paneel 2b een tijdexpansie van de met een sterretje (*) interval. Een piekvolgende algoritme toegepast om de piek (rood) en de basis (groen) voor de fluorescente respons ¹² te detecteren. De meting van de fluorescentie base bevat informatie van zowel de donkerstroom van de avalanche fotodiode en de storingen die bij omgevingstemperatuur light en elektromagnetische koppeling. Een weergave van pieken en basen is weergegeven in figuur 2c. Deze figuur toont de fluorescentie uitgezonden door de kleurstof (Rhod-2) gebonden aan Ca ²⁺ tijdens de cardiale cyclus van een kloppend hart parkiet.

In de tweede werkwijze wordt de uitgangsspanning van de integrator is een functie van de huidige en capacitieve terugkoppeling (figuur 2d, 2e en 2f). Figuur 2f toont twee opeenvolgende integratie cycli: de eerste met geen externe verlichting en de tweede met toegepaste lichtpulsen van een pulserende LED. Een gedetailleerde beschrijving wordt gegeven in de figuren 2g en 2h. Deze benadering, hoewel meer bewerkelijke, verschaft een grotere S / N door het ontbreken van thermische ruis in de terugkoppelcondensator. Het instrument bevat een timing stadium dat alle controle- en multiplexing van het excitatielicht genereert en beveelt de headstage integratie en reset perioden. Dit wordt meestal uitgevoerd met een digitale signaalverwerkingsschakeling die ook voert een digitale differentiatie van het geïntegreerde uitgangssignaal door het berekenen van een online regressie van de gegevens. Bij gebruik van een resistieve terugkoppeling, kan elke A / D acquisitie board gebruikt.

Tenslotte maken LFFM techniek is zeer veelzijdig en kan worden aangepast voor het opnemen van meer dan één gebied. Het toevoegen van een bundelsplitser in het lichtpad stelt ons in staat om het licht te splitsen in twee optische vezels. Elke optische vezel kan vervolgens op verschillende gebieden van een weefsel, onafhankelijk wekken en opnemen emissie van de exogene fluorescerende probes worden geplaatst. Deze wijziging stelt ons in om te beoordelen hoe anatomische regionale verschillen beïnvloeden fysiologische variabelen. Figuur 3 toont een bundelsplitser wordt gebruikt voor de CW excitatielicht zodat twee optische vezels worden gebruikt om transmurale elektrische of intracellulaire meten splitsen [Ca ^2+] levels with minor-invasief. Transmurale signalen kunnen worden opgenomen door één vezel op het endocardium en de andere aan het epicard laag van de ventriculaire wand. Daarom is de LFFM techniek heeft het vermogen om het tijdsverloop van cellulaire signalen in verschillende regio meten en kan worden gebruikt om te testen of regionale veranderingen optreden onder pathologische omstandigheden.

Protocol

Dit protocol en alle muizen handling werd goedgekeurd door de UC Merced Institutional Animal Care en gebruik Comite (No. 2008-201). Experimenten met parkieten werden uitgevoerd in 1999 op basis van de algemene voorwaarden voor het gebruik van dieren vastgesteld door de wetenschappelijke commissie van de Venezolaanse Instituut voor Wetenschappelijk Onderzoek (IVIC).

1. Langendorff Set Up Voorbereiding

1. Bereid Tyrode oplossing met de volgende concentraties opgeloste stof in mM: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 _CaCl2, 1 _MgCl2, 0,33 Na ₂ HPO _4, 10 glucose, 10 HEPES. De pH van de Tyrode-oplossing op 7,4 met NaOH en filtreer de oplossing door een 0,22 urn filter.
2. Laad de Tyrode oplossing in de 60 ml spuiten en alle leidingen van de horizontale Langendorff-up ^{11, 12} in figuur 4. Zorg ervoor dat alle luchtbellen te verwijderen.
3. evenwicht Tyrode oplossing 100% O ₂ met een verzonken plastic "luchtsteen" zoals weergegeven in figuur 4.
   1. Sluit de plastic slang aan op een O ₂ tank.
   2. Voeg een plastic stuk adapter aan op een 5 "tube zakken in de Tyrode oplossing in de 60 ml spuit.
   3. Bevestig een plastic luchtsteen aan het einde van de 5 "buis zodanig O ₂ wil bubble uit in de Tyrode-oplossing.
4. Plaats een niet-absorbeerbaar chirurgisch hechtmateriaal rond een naald gebruikt als canule. De naald is gekoppeld met het verdeelstuk (zie figuur 4) die retro-perfusie met verschillende oplossingen mogelijk maakt. Tenslotte zal het hart aorta wordt een canule in de naald.

2. Dier Voorbereiding en Hart Dissection

1. Weeg en injecteer de muis met heparine (ex. Mouse van het gewicht 20 g, te injecteren met 20 eenheden of 200 pl) 15 min voor euthanasie door cervicale dislocatie. Verdoven parkieten volgens to het gebruik van dieren gebruikershandleidingen van uw IACUC protocol en ga verder met cervicale dislocatie.
   OPMERKING: Gebruik 8 weken oude muizen of 20 g parkieten.
2. Verwijder het hart uit de borstholte na euthanization. Extract parkiet harten op dezelfde wijze als beschreven voor muizen.
   1. Maak de muis borst met ethanol.
   2. Gebruik dissectie schaar, een insnijding in de onderbuik en snijd de zijkanten naar de hals.
   3. Trek de cut weefsel en speld het naar beneden.
   4. Snijd het middenrif. Wees voorzichtig bij het snijden van het membraan om te voorkomen dat schade aan het hart.
   5. Verwijder de longen en het omringende weefsel.
   6. Gebruik een pincet om het hart te scheppen, zonder erin te knijpen. Snijd de aorta zo lang mogelijk.
3. Vervoeren het hart op een kleine wegen boot met ongeveer 1 ml Tyrode oplossing.
4. Een niet-absorbeerbaar chirurgisch hechtmateriaal, bind de aorta op de horizontale Langendorff apparaat via eennaald. Bind het hart aorta met de hulp van twee fijne pincet. Begin retro-perfusie door openen van de klep in serie met de 60 ml spuiten met Tyrode oplossing.
5. Laat het hart stabiliseren 10 minuten. Gebruik deze tijd om bloed en het vetweefsel rond het hart voor het laden van de kleurstof te reinigen. Trek het vetweefsel dichtbij de basis van het hart met een pincet en zaag met kleine dissectie scharen. Zorg ervoor dat u dit te doen onder het oog van een dissectie microscoop.

3. cytosolische Ca ²⁺ Afmetingen: Het voorbereiden van Dye Rhod-02:00

1. Voeg 20 ul van 20% Pluronic (een niet-ionogene oppervlakteactieve stof) in DMSO tot een speciale verpakte plastic buisje van de fabrikant kleurstof bevattende 50 pg van de kleurstof.
2. Meng door en neer te pipetteren, het vermijden bellen.
3. Breng de gemengde DMSO met niet-ionische surfactant en de kleurstof van de bijzondere verpakte plastic flacon in een heldere glazen flacon. Voeg 1 ml Tyrode solutie aan de heldere glazen flacon.
4. Ultrasone trillingen gedurende 15-20 min in een bad ultrasoonapparaat.
5. Perfuseren de kleurstof middels peristaltische pompen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   1. Plaats de kleurstof in de kleurstof kamer.
   2. Gebruik een mechanische klem aan alle andere slangen die verbonden zijn met het verdeelstuk comprimeren. De klem boven het spruitstuk geplaatst. Dit voorkomt terugstroming te voorkomen in de slang verbonden met de 60 ml spuiten.
   3. Schakel de perfusie peristaltische pomp begint circuleert de kleurstof. Sluit direct de 3-wegklep onder de 60 ml spuit.
   4. Plaats een kleine buis die is verbonden met de zuig peristaltische pomp naast het hart om de kleurstof die is geperfundeerd in het hart recirculeren.

4. Intra-SR Ca ²⁺ Afmetingen: Het voorbereiden van Dye Mag-Fluo4AM

1. Bereid Mag-Fluo4AM op dezelfde wijze als Rhod-02:00. Zie sectie 3 voor stapsgewijze instructies.
2. after het laden van de kleurstof, opent de klep in serie met de 60 ml spuiten met Tyrode oplossing voor retro-perfusie beginnen. Zorg ervoor dat de klem te verwijderen boven het spruitstuk.
3. Voeg Tyrode oplossing voor de horizontale trek en opwarmen tot 37 ° C.
4. Retro-perfuseren met Tyrode oplossing gedurende 45 minuten aan de cytosolische kleurstof te verwijderen.

5. Membraan Potentiële Metingen: Het voorbereiden van Dye Di-8-ANEPPS

1. Voeg 5 ml 99% ethanol om de kleurstof flacon die 5 mg van de kleurstof bevat.
2. Aliquot 10 pi in 500 individuele 1 ml plastic flacons met behulp van een repeater pipet.
3. Drogen in een vacuüm snelheid en bewaar bij -20 ° C.
4. Voeg 20 ul van 20% Pluronic in DMSO tot een plastic flesje met 10 ug van het gedroogde kleurstof.
5. Meng door en neer te pipetteren, het vermijden bellen.
6. Breng het mengsel dat met DMSO en Pluronic kleurstof uit de plastic flacon naar een maatcilinder (10 ml). Voeg Tyrode oplossing tot een uiteindelijke volume van 5 ml.
7. Ultrasone trillingen gedurende 20-25 min in een bad ultrasoonapparaat.
8. Perfuseren naar het hart gedurende 30 min met behulp van peristaltische pompen. Raadpleeg de stapsgewijze instructies in paragraaf 3.5.

6. Opnemen Epicardiale Signalen

1. Na het laden van de kleurstof, retro-perfuseren het hart met Tyrode oplossing door het verwijderen van de klem boven het spruitstuk. Open de klep in serie met de 60 ml spuit met Tyrode oplossing. Retro-perfuseren Tyrode oplossing gedurende 10 minuten naar het hart te stabiliseren.
2. Vul het horizontale trek met Tyrode oplossing en zet de Peltier unit de badtemperatuur tot 37 ° C te brengen.
3. Plaats de glasvezel op het oppervlak van het hart.
   1. Leg de glasvezelkabel in een 2 mL pipet en bevestig vervolgens de pipet naar een micromanipulator.
   2. Gebruik de micromanipulator enigszins op de glasvezel tegen het oppervlak van de LV.
4. Extern tempo de heart met een stimulator bestuurd door een golf generator.
   1. Programmeer de golfgenerator een blokgolf te voorzien van een breedte van 1 ms.
   2. Stel de stimulator extern worden gesynchroniseerd en sluit de externe ingang naar de wave generator.
   3. Elke uitgang van de stimulator, sluit een draad met een acupunctuurnaald gesoldeerd aan het einde.
   4. Plaats beide acupunctuurnaalden in de apex van het hart ongeveer 3 mm van elkaar.
   5. Pas nadat de naalden in het weefsel plaatst, zet de uitgang van de stimulator elektrische schokken.
5. In de acquisitie software, passen overname frequentie tot 10 kHz.

7. Opnemen Endocardiale Signalen

1. Zie stap 6,1 en 6,2 om het hart te stabiliseren na het laden van de kleurstof.
2. Met behulp van een scherpe 23Ga punt over de grootte van de glasvezel, maak een klein gaatje in het oppervlak van het hart in de LV in de buurt van het septum.
3. Plaats een intravitreale operatie sclerotomie adapter om te helpen bij het positioneren van de eerste optische vezel in het endocardium met behulp van een micromanipulator.
4. Extern tempo het hart. Zie stap 6.4.
5. In acquisitie software, passen overname frequentie tot 10 kHz.

Resultaten

AP en Ca ²⁺ transiënten in endocardium en epicard

Om signalen te vergelijken in de kamerwand, is een vezeloptische gepositioneerd in het endocardium en de andere in het epicard. Vergelijking van de morfologie van een AP vastgelegd vanaf het endocardium met één van de epicard is de beste manier om de transmurale functie beoordelen. De kamerwand is heterogeen en dus de m...

Discussie

Dit papier is gecentreerd beschrijven lokale gebied fluorescentie technieken om de functie van cardiale myocyten ex vivo te evalueren. Het onderzoek van deze cellen in een gekoppelde omgeving is niet alleen fysiologische, maar is ook zeer geschikt voor het beoordelen orgaan niveau pathologieën. De onderliggende cellulaire gebeurtenissen excitatie-contractie koppeling (ECC) kan worden vastgesteld op het gehele orgel niveau met behulp van moleculaire probes die intracellulaire Ca2 ⁺ dynamiek monitor (R...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sodium chloride	Sigma	7647-14-5
D-(+)-glucose	Sigma	50-99-7
Potassium chloride	Sigma	7447-40-7
HEPES	Sigma	7365-45-9
Sodium phosphate	Sigma	10049-21-5
Calcium chloride solution	Sigma	10043-52-4
Magnesium chloride solution	Sigma	7786-30-3
Sodium hyrdoxide	Sigma	S-8045
0.2 μm nylon membrane filter	Whatman	7402-004
Manifold MPP	Warner	64-0216
21G1.5 Precision glide needle	B-D	305167
Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)	AllMech Tech	LOOK-SP105
Heparin sodium injection 1000USP/mL	AllMech Tech	NDC63323-540-11
DMSO D8779	Sigma	67-68-5
Blebbistatin	Sigma	856925-71-8
Pluronic F-127 20% solution	Biotium	59004
Materflex C/L peristaltic pump	Cole-Parmer	77122-26
Isostim stimulator	World Precision Instruments	A320RC
Waveform generator	Teledyne Lecroy	WaveStation 2012
Ultrasonic cleaner FS20	Fisher Scientific	1533530
Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32"	Component Supply	TET-031A
Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32"	Component Supply	TET-094A
Adapter luer lock to 3-way valve	Cole-Parmer	EW-31200-80
Tee adapters and plastic fittings	Cole-Parmer	6365-90
Plastic clamp	WaterZoo	2465
Peltier	TE Technology	TE-127-2.0-2.5
Rhod-2AM	ThermoFisher Scientific	R1245MP
Di-8-ANEPPS	ThermoFisher Scientific	D3167
Mag-Fluo-4AM	ThermoFisher Scientific	M14206
Acupunture needles	LHASA	TC1.20x13
60 mL BD syringe with luer-lok	Fisher Scientific	14-820-11
LabView	National Instruments
Speed vacuum Eppendorf Vagufuge	Fisher Scientific	07-748-13
Digital signal processing circuit DSP TMS 320	Texas Instrument
Longpass Dichroic mirror 567 nm	ThorLabs	DMLP567L
Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective	Edmund Optics	Stock# 33-437
Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective	Edmund Optics	Stock# 33-438
Longpass colored glass filter 590 nm	ThorLabs	FGL590
Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW
Micromanipulator for laser	Siskiyou	MX130R
Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39	ThorLabs	FT200UMT
LEDs blue	Lumileds	L135-B475003500000
LEDs green	Lumileds	L135-G525003500000
Cube beam splitter, non-polarizing	ThorLabs	BS007
36" Length, Dovetail Optical Rail	Edmund Optics	54-402
2.5" Width, Dovetail Carrier	Edmund Optics	54-404
0.75" Travel, micrometer stage	Edmund Optics	37-983
Dovetail optical rail 3"	ThorLabs	RLA075/M
Dovetail rail carrier 1"	ThorLabs	RC1
Avalanche photodiode Helix 902	Digi-Key	HELIX-902-200
Objective holder XY Translator	ThorLabs	ST1XY-S
Aluminum breadboard 6" x 6"	ThorLabs	MB6
Nexus otpical table 4' x 6'	ThorLabs	T46HK
Stainless steel cap screws	ThorLabs	HW-KIT5/M
Acrylic  sheet	Home Depot/Lowes
Sylgard Silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184
Epoxy gel	Walmart/Home Depot	2-part 5 min clr 1oz
21G1.5 Precision glide needle	B-D	305167
23G Precision glide needle	B-D	305145
Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm	ThorLabs	BA1/M
Wire shelve posts 36"	Alera	AALESW59PO36SR
Wire shelves	Alera	ALESW582424SR
Post and angle clamp	ThorLabs	SWC/M-P5
Glass syringe for dye chamber	Wheaton	W851020
Rubber stopper	Home Science Tools	CE-STOP01C