Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ontwikkeling van een Economische DNA Delivery System door "Acufection" en de toepassing ervan op Skin Research

6.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55206

⸱

19 april 2017

 ,  , 
1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol is een kosteneffectief alternatief voor expressie van naakt plasmide DNA in muizenhuid. Het algemene doel van het protocol is immuun-gerelateerde genen in huidweefsel aan de functionele rol van een specifiek gen in huidontsteking bakenen.

Samenvatting

Ontregeling van de immuunrespons in de huid wordt in verband gebracht met tal van menselijke huid aandoeningen. Rechtstreekse overdracht van immuun-gerelateerde genen in huidweefsel is een fascinerende benadering van immuunmodulatie van cutane ontsteking in muismodellen van ziekten bij de mens te onderzoeken. Hier presenteren we een kosteneffectieve protocol dat naakt DNA in muizenhuid geleverd en leidt tot transgenexpressie. De werkwijze is bedacht "acufection", duidt acu-lek gemedieerde DNA-trans fection. Acufection te voeren, werd muizenhuid eerst toegediend met DNA in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en daarna licht geprikt met een bundel acupunctuurnaalden om de absorptie van DNA en transfectie in cellen te vergemakkelijken. Het plasmide DNA wordt vermoedelijk door de keratinocyten en dendritische cellen (DC's) in de huid genomen en expressie gebracht eiwit. Mechanische prik met de naalden op zich niet leiden tot beschadiging van de huid of induceren keratinocyten activering. De uitdrukkingvan de getransfecteerde genen gedetecteerd in de huid zowel transcriptionele en translationele niveaus na acufection gedurende 2 dagen en onderhouden tot 7 dagen. De primaire doelstelling van de ontwikkeling van deze acufection methode was een niet eerder gedefinieerd isovorm van IL-15 te onderzoeken. Met deze werkwijze wordt een alternatief gesplitste IL-15 isovorm met gedeeltelijk verwijderde exon 7 (IL-15ΔE7) werd tot expressie gebracht in de huid en vervolgens behandeld met een Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), ontsteking veroorzaken. -Acufection geleverd IL-15ΔE7 huid onderdrukte proliferatie van keratinocyten, epidermale dikte en rekrutering van neutrofielen in IMQ geïnduceerde huidontsteking. Met de toenemende belangstelling voor het identificeren van de regulerende mechanismen van huidontsteking, het protocol beschreven verschaft een kosteneffectieve en veelzijdig alternatief voor gen kanonsysteem of microzaaien voor DNA afgifte in vivo. Het kan mogelijk maken ontdekking van de functie van een nieuwgen in de huid of voor het onderzoeken van nieuwe behandeling van huidziekten.

Inleiding

Skin is de eerste verdedigingslinie van het lichaam. Keratinocyten (KCS) zijn het belangrijkste celtype in de huid van mensen en muizen. In reactie op prikkels uit de omgeving (bijvoorbeeld zonlicht, zuurstof, chemicaliën en pathogene invasie) worden KCS geactiveerd en produceren een breed scala van pro-inflammatoire cytokines en chemokines zoals IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α en GM-CSF 1. Samen leiden zij de rekrutering van immuuncellen op de huid. Verergerd huidontsteking wordt vaak geassocieerd met talrijke menselijke ziekten, waaronder acute ectopische contact dermatitis en chronische T-cel gemedieerde inflammatie (zoals allergische contact dermatitis en psoriasis) 2. Modulerend pro-inflammatoire reacties in de huid door remming KC activering aannemelijk benadering voor de behandeling van huidontsteking. Dit protocol beschrijft een nieuwe benadering van een cytokine gen in de epidermis transiënte expressie te brengen om immune res bestuderenPonse voortvloeiend uit dergelijke behandeling in de huid.

De epidermis componeert de meest oppervlakkige laag van de huid. Het dient als een fysieke barrière houden externe stoffen zoals nucleïnezuren en pathogenen die in de diepere lagen van de huid. Verschillende naaldvrije technieken zijn vastgesteld voor epidermale DNA-overdracht 3, 4. DNA in oplossing of in verband met kationische liposomen of adenovirusvectoren is rechtstreeks op de epidermis gemodificeerd met technieken zoals het verwijderen van het stratum corneum of de behandeling met reagens ontharen. Verwijdering van de verhoornde epitheel vergemakkelijkt DNA die de epidermale barrière en interactie met keratinocyten en Langerhans cellen immuunresponsen 5 induceren. Terwijl een groot oppervlak is beschikbaar voor DNA-overdracht en deze aanpak niet naalden te betrekken, zijn er nadelen, waaronder de eisde grote hoeveelheden DNA (10-100 ug), harde behandeling van de huid door strippen en inconsistente resultaten in het induceren van immunologische respons in de geïmmuniseerde dieren zonder DNA afgifte booster 6. Micropartikels gemedieerde intracellulaire afgifte van naakt DNA aan de huid is getoond zeer efficiënt en reproduceerbaar is voor het induceren immuunreactie 7, 8 zijn. Een draagbare genpistool werd gebruikt om de huid doelwitplaats met plasmide-DNA beklede gouddeeltjes 2 urn diameter in grootte door middel van stromend helium luchtstroom 9 bombarderen. Het plasmide DNA wordt vermoedelijk door KCsand dendritische cellen (DC's) die in de huid en het eiwit tot expressie lokaal of transport naar drainerende lymfeknopen door DCs 10. Hoewel het gen pistool systeem is eenvoudig en vereist beperkte technische ervaring, de kosten voor de voorbereiding en het leveren van de "DNA bullet "(dat wil zeggen goud poeders, helium gas) en het genenpistool zelf is van algemene toepassing beperkt. Bovendien is de eis van een heliumgas afgiftesysteem beperkt de gemakkelijke gengeweer transport wanneer de proeven op verschillende plaatsen worden uitgevoerd. microzaaien aangetoond is dat een hogere efficiëntie van genoverdracht dan enkele injectie en deeltjesbombardement 11 bereiken. microzaaien gebruikt een tatoegeringskanon om DNA te leveren aan de huid zonder het gebruik van deeltjes kralen 11. Oscillerende de micronaalden op de huid met behulp van deze benadering waarschijnlijk direct schrapen het celmembraan en daardoor overdragen DNA om meerdere cellen tegelijk. echter, pijn bij het grote aantal injecties met 0,254 mm diameter naalden nadeel.

Hier geven we een alternatieve benadering van DNA-afgifte in vivo. De "acufection" protocol we hier beschreven, verschaft een economische en efficiënte manier om plasmide DNA te leveren in de huid van muizen. In het kort, tien acupunctuurnaalden (0,2 mm diameter x 13 mm lang) werden gebonden in een bundel met plakband. Een volume van 10 pi PBS met 10 pg plasmide DNA dat het transgen van interesse werd op het geschoren, ontharingsmiddelen crème behandelde flank huid. Via de acupunctuurnaald bundel over het oppervlak (1 cm x 1 cm) van de huid oscilleren, werden de keratine in de hoornlaag losgemaakt en het plasmide-DNA op het oppervlak werd geabsorbeerd in de epidermis. Beschadiging van de huid werd gecontroleerd en bleek minimaal te zijn. Expressie van het getransfecteerde gen in de acufected huid werd bevestigd door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) en ELISA. Het immuunsysteem modulerende effecten van acufection geleverde IL-15ΔE7 op huidontsteking werden aangetoond met behulp van de IMQ behandelde muismodel 12. Terwijl acufection blijkt te zijn een gemakkelijke en minder dema zijnnding werkwijze voor DNA afgifte in vivo, de optimale hoeveelheid DNA voor verschillende genen en de tijd op de huid prikken moeten zorgvuldig worden geoptimaliseerd om reproduceerbare resultaten te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Vrouwelijke muizen met 8 - 12 weken oud werden gebruikt voor deze studie. C57 / BL6 wildtype (WT) en IL-15 deficiënte (IL-15 - / -) muizen werden gekocht bij National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan en Taconic Farm resp. IL-15-deficiënte (IL-15 - / -) en IL-15-dominante (+/- IL15 en IL15 + / +) toonde een 1: 3 verhouding in de tweede generatie van het kruis van IL-15 +/- heterozygoten. Het genotype van IL-15 - / - muizen werd bevestigd door PCR-analyse. De muizen werden in de specifiek pathogeenvrije (SPF) faciliteit in Laboratory Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine onderhouden. Alle dierlijke procedures inclusief de verdoving materialen en methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met het dier protocol door de National Taiwan University College of Medicine en het College van Volksgezondheid Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) (beëdigde verklaring van goedkeuring van Animal Protocol 20.130.225) goedgekeurd.

1. Bereiding van Acupunctuurnaalden

OPMERKING: Acupunctuurnaalden zijn medische hulpmiddelen bestaan uit een handgreep en een naalduiteinde (Figuur 1A). De diameters van de acupunctuurnaald varieerden van 0,2 mm (36 G) tot 0,35 mm (28 G). Wij selecteren de beste punt van de naald om mogelijke overmatige celbeschadiging tijdens het prikken van de huid te voorkomen. Er zijn 4 verschillende lengten van de naald 0,2 mm, waarvan 13 mm (0,5 inch), 25 mm (1,0 inch), 40 mm (1,5 in) en 50 mm (2,0 in) lang. Een bundel van 10 naalden met een lengte van 13 mm aangebracht de beste optimale grip oscilleren van de naald op C57BL / 6 muizen huid. De parameters kunnen worden aangepast indien de werkwijze wordt toegepast op de huid van grotere dieren of uitgevoerd door onderzoekers met grotere handen.

  1. Verwijderen acupunctuurnaalden uit de steriele, pyrogeenvrije pakket. Plaats de naalden op een steriel laken.
  2. -Haft labeling tape 10 naalden samenbinden ina bundel (Figuur 1B).
    OPMERKING: De naalden 10 zijn geometrisch ingericht om een ​​cilindervorm te vormen. Gebruik bij voorkeur een stuk paraffinefilm de inrichting te stabiliseren voordat het kleefband. Zorg ervoor dat alle de naald punten zijn op hetzelfde vlak. Met behulp van een bundel in plaats van een enkele naald vergemakkelijkt maximale DNA infusie door het vergroten van het contactoppervlak tussen de naalden en de huid.

2. Bereiding van een grote hoeveelheid en endotoxine-vrij plasmide DNA

  1. Transformatie chemisch competente bacteriële cellen met het plasmide-DNA.
  2. Selecteren en beënt een bacteriekolonie in 3 ml LB medium met antibiotica en incubeer bij 37 ° C in een schudder overnacht.
  3. Schaal van de cultuur door het verdunnen van de bacteriecultuur 1: 100 in 250 ml LB-medium met antibiotica en schudden overnacht bij 37 ° C
  4. Bereid een grote hoeveelheid DNA met een hoog quality, endotoxine plasmideselectie voorbereiding kit volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Acufection protocol vereist hoge zuiverheid en een grote hoeveelheid plasmide-DNA. Gebruik van een hoge kwaliteit, wordt endotoxine vrij en kolom gezuiverd plasmide-DNA aanbevolen.
  5. Elueer DNA in steriel water. WINKEL DNA in kleine porties bij -20 ° C tot gereed voor acufection.
    LET OP: Vermijd herhaalde vries-en-dooi van DNA om consistente plasmide DNA meningsuiting te waarborgen.
  6. Verdun plasmide DNA tot 1 mg / ml in steriel PBS gedurende acufection.

3. Procedure voor Acufection

OPMERKING: De optimale hoeveelheid DNA en het gebied van het doel huidoppervlak is afhankelijk van de genen en moeten verder worden geoptimaliseerd. Prikken kracht en het aantal keren los de hoornlaag van de huid kan ook variëren afhankelijk van de huiddikte. Dienen zorgvuldig te worden bepaald na evaluatie van het expressieniveau van genen acufected transcripts door qRT-PCR.

  1. Weeg de muizen en dienen tribroomethanol (400 ug per gram lichaamsgewicht) door peritoneale injectie.
    OPMERKING: 2,2,2-tribroomethanol is een injecteerbaar anestheticum dat gewoonlijk gebruikt in muizen. Oplossingen worden bereid door het oplossen van een niet-farmaceutische kwaliteit 2,2,2-tribroomethanol (2,5 g) in gedestilleerd water (200 ml) die 2,5% 2-methyl-2-butanol.
  2. Gebruik dierenarts oogheelkundige zalf op de ogen tot droog onder narcose te voorkomen.
    OPMERKING: verdovend effect wordt opgewekt in 1-2 min. Controleer de teen knijpen reflex om voldoende diepte van de anesthesie voor de operatie te verzekeren.
  3. Scheer de dorsale flank huid en toepassing ontharingscrème op keratineproteïnen oplossen in de haarschacht.
    LET OP: Het gebruik van ontharingscrème om haar te verwijderen zal infusie van DNA in de huid te vergemakkelijken.
  4. Gebruik water doordrenkte watten af ​​te vegen de ontharingscrème.
    Attentie: de ontharingscrème is oplosbaar in water. Volledige verwijdering van de crème will voorkomen dat een vettige ondergrond en zorgen voor een betere prikken resultaat.
  5. Gebruik een steriel wattenstaafje gedrenkt in 70% ethanol om het huidoppervlak te desinfecteren.
  6. Markeer het doelgebied (1 cm x 1 cm) op de onthaarde huid met een afgemeten stencil. LET OP: Het merken van de doellocatie zal helpen om de naald bundel van toepassing up-and-down binnen een afgebakend gebied. Dit is belangrijk om de levering van dezelfde hoeveelheid DNA waarborgen een specifiek oppervlak tot experiment te experimentvariant minimaliseren.
  7. Plaats een 10 ul druppel plasmide-DNA (10 ug) op de gemarkeerde huid.
    OPMERKING: De hoeveelheid DNA voor acufection varieert met verschillende genen en het type expressievector. De hoeveelheid DNA gebruikt moet zorgvuldig worden getitreerd voor het uitvoeren van het experiment van belang. De 10 pl is een klein vloeistofdruppel en het ligt goed op de geschoren en onthaard huid zonder afrollen tijdens het prikken. Omvatten een controlegroep van muizen behandeld met 10 uL lege vector-DNA te vergelijken met een muizencufected de studie gen.
  8. Houd de acupunctuurnaald bundel (Figuur 1B) en prik het gemarkeerde oppervlak met een op en neer gaande beweging voor 100 keer of tot het vochtgehalte van DNA in PBS op de huid verdwijnt. OPMERKING: Sommige roodheid van de huid oppervlak kan optreden. Vermijd het maken van diepe sneden dat bloedt. Het aantal op- en neer bewegingen prikken op het huidoppervlak wordt functioneel bepaald wanneer het vocht van DNA in PBS (10 pl) verdwijnt op de huid. We besloten om 100 keer in 30 s, omdat het de meest consistente resultaten uit acufection geleverd genen heeft gegeven. Eventueel kunnen de naalden worden hergebruikt voor maximaal 6 doelhuid prikt (1 cm x 1 cm elk). Spoel de naalden in 70% ethanol en PBS tussen acufection. Wissel naar nieuwe naalden wanneer ze saai of voor verschillende plasmide-DNA om kruisbesmetting te voorkomen.
  9. Plaats acufected muizen op een verwarmingselement om de lichaamstemperatuur te handhaven tot wakker.
  10. Terug muizen om hun kooi als zeweer voldoende bewustzijn. Opmerking: Houd acufected muizen in afzonderlijke kooi (minder dan 5 dieren per kooi) van de kooi-un acufected muizen.
  11. Zet waterfles plaats en zet de kooi naar de IVC (individueel geventileerde kooi) rek.

4. Post-operatieve Zorg

  1. Voor de eerste 48 uur na de procedure nauwlettend muizenmaagjes ongemak zoals gedragsveranderingen (rusteloosheid, agitatie of eetstoornis) of afwijking vertoont (ruwe vacht of gebogen houding).

5. Imiquimod (IMQ) Behandeling van IL-15ΔE7-acufected Skin

OPMERKING: Transcriptionele expressie en eiwitproductie van acufected gen detecteerbaar op dag 3. Muizen acufected met plasmide plaats kan worden behandeld met verschillende stimulerende 3 dagen na transfectie. We illustreren hier door het behandelen van de IL-15ΔE7-acufected huid van muizen met IMQ crème. IMQ een imidazoquinolin amine goedgekeurd fof de behandeling van externe genitale en perinatale wratten 13. Topische behandeling IMQ is aangetoond dat humane psoriasis-achtige huidaandoeningen bij de muis met de manifestatie van schilferige huid, epidermale proliferatie en dermale neutrofielinfiltratie 12, 14, 15.

OPMERKING: De plasmidevector bevat full-length muis IL-15 cDNA gereguleerd door elongatie factor-1 α (pEF), geflankeerd door een IL-2 signaalpeptide en een FLAG-vlag aan de C-terminus (pEF-IL- 15, 5859 basenparen), die werd geconstrueerd zoals beschreven door Bamford et al. 16. Het plasmide wordt gebruikt als een IL-15 matrijs voor de eerste 16 aminozuren verwijderen bij resten 33-48 in exon 7 van het IL-15 gen voor IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5811 baseparen) van SOE (synthese door overlappende extensie) PCR methode 17. Bacteriële kolonies die succesvol warengetransformeerd met IL-15ΔE7 werden geverifieerd door restrictie-enzymdigestie, gevolgd door DNA-sequentiebepaling 12, 18. Een grote hoeveelheid endotoxine-vrij plasmide-DNA werd bereid zoals beschreven in het protocol stap 2.

  1. Verdoven acufected muizen door intraperitoneale injectie van tribroomethanol (400 ug per gram lichaamsgewicht) en breng vet oogheelkundige zalf op de ogen tot droog onder narcose voorkomen. Controleer de teen knijpen reflex om voldoende diepte van de anesthesie te verzekeren voor de start van de operatieve procedures. OPMERKING: Aangezien een 2 cm x 2 cm huid zullen gedurende IMQ wordt 2 doses pIL-15ΔE7 plasmide-DNA (10 pg in 10 pi PBS per dosis) acufected on 2 doelwitplaatsen (1 cm x 1 cm elk).
  2. Mark flankeren skin (2 cm x 2 cm) die het acufected gebied.
  3. Gebruik wattenstaafje applicator topisch toepassen IMQ crème op het gemarkeerde oppervlak. Opmerking: stap 5.1 wordt alleen de eerste dosis (60 mg / dosis) uitgevoerd.De volgende opeenvolgende doses worden toegepast op niet-verdoofde muizen.
  4. Documenteer de veranderingen van IMQ-behandelde dorsale huid dagelijks met een high definition camcorder. Opmerking: Een persoon houdt de muis terwijl een ander opneemt. Stilstaande beelden zijn geschoten en bewerkt op een later tijdstip.
  5. Euthanaseren muizen door het injecteren van een overdosis tribroomethanol (800 ug per gram lichaamsgewicht) gevolgd door cervicale dislocatie op dag 4 en dag 7 na IMQ behandeling. De huid is uitgesneden en verwerkt (Stappen 4,1-4,5).

6. Homogenaat of Mouse Skin

  1. Met een paar chirurgische schaar om een ​​horizontale snede van de basis van de staart te maken. Overgaan bilateraal aan de basis van de achterpoot en blijven die verticaal langs de flank aan de basis van de voorpoot.
  2. Zorgvuldig schil de huid van het onderliggende weefsel van posterior naar de voorste. Gebruik de schaar om de dorsale huid af te snijden. Plaats de huid op een steriele petrischaal.
  3. Gebruik een scalpel om doelwit te snijdenhuid en bevriezen onmiddellijk in vloeibare stikstof. Opmerking: Dezelfde afmeting van acufected huid zonder (1 cm x 1 cm) of IMQ behandeling (2 cm x 2 cm) wordt voor elke muis experiment tot experiment variaties te minimaliseren.
  4. Plaats de bevroren huidweefsel in het midden van een pre-gekoelde 2-vaks mortel met handvatten en een stamper. Gebruik een leiding hamer op de mortel op het weefsel te verpulveren.
  5. Plaats snel de verpulverde weefsel naar een nieuwe buis met 500 ui cellysisreagens voor RNA extractie of een buisje dat 50 ui PBS en 1 x proteaseremmer cocktail eiwitlysaat verkrijgen.

7. H & E en immunohistochemische kleuring van buitenhuiddeel

  1. Plaats het huidweefsel in een cassette en dompel dit in 4% paraformaldehyde gedurende de nacht.
  2. Embed en weefsel sectie, die in ons geval werd uitgevoerd door het Pathology Laboratory van de LAC, NTU. Opmerking: Het gedeelte is gesneden in een dikte van 5 urn. Plaats weefsel sections op positief geladen dia's.
  3. Verhit de objectglaasjes bij 65 ° C gedurende 15 minuten.
  4. Plaats de dia's in een kleuring rack. Dompel het rek in corresponderende tank met xyleen vervanging van 5 minuten tweemaal gevolgd door achtereenvolgende onderdompeling in 100%, 95%, 80%, 75%, 60% en 50% ethanol (5 min elk) voor rehydratatie. Dompel de dia's in leidingwater gedurende 3 minuten voor kleuring.
  5. Voer hematoxyline en eosine. Opmerking: H & E kleuring werd uitgevoerd op verzoek verkrijgbaar bij Pathology Laboratory van de LAC, NTU.
  6. Voor immunohistochemische kleuring, blokkeren de sectie met blokkeeroplossing bij kamertemperatuur gedurende 5 min niet-specifieke achtergrondkleuring te verminderen. Opmerking: De blokkade oplossing wordt commercieel ontwikkeld met immunokleuring technieken. Geen enkel dier serum is opgenomen in dit artikel.
  7. Dompel de dia in PBS te spoelen het blok oplossing.
  8. Verdun het blok in PBS om 1:10 en voeg 2% foetaal runderserum (FBS) (verdunningsoplossing).
  9. Pipetteer de geschikt verdunde primaire antilichaam op de sectie en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Antilichamen werden verdund in verdunningsoplossing. Antilichaamconcentraties voor deze kleuring werden geoptimaliseerd bij 1: 800 en 1: 200 voor Ki67 (kloon SolA15) en Ly6G (kloon 1A8), respectievelijk. Deze concentraties worden gevonden om verschillende vlekken zonder achtergrond kleuring te tonen.
    1. Vlek één seriële sectie in dezelfde doorgang met dezelfde oplossing weglaten van het primaire antilichaam om te controleren op niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam.
  10. Was schuift drie maal in TBS plus 0,1% Tween-20 (TBST oplossing) gedurende 5 minuten elk. oplossing verandering tussen wasbeurten.
  11. Pipet een druppel gemerkte polymeren elke sectie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten. Opmerking: Het gelabelde polymeer wordt commercieel bereid door aminozuurpolymeren met peroxidase en secundair antilichaam dat is gereduceerd tot een Fab' fragment. Het reagens is gebruiksklaar voorimmunohistochemische kleuring van weefselsecties muis.
  12. Was schuift driemaal in TBST gedurende 5 minuten elk. oplossing verandering tussen wasbeurten.
  13. Pipette 3,3'-oplossing diaminobenzindine tetrahydrochloride (DAB) op weefselsectie en laat bij kamertemperatuur tot een bruin neerslag zichtbaar onder helderveld microscopie. Opmerking: De tijd voor DAB neerslaan in aanwezigheid van peroxidase is ongeveer 30 minuten.
  14. Dompel dia's in het water te peroxidase activiteit te stoppen. Dip dia's in methyl groene oplossing voor de nucleaire kleuring. Was schuift drie keer in PBS gedurende 5 minuten elk.
  15. Plaats een dekglaasje via gekleurde coupe die is bedekt met permanente montage medium (8 pl per groep).

8. Foto en analyse van gekleurde weefselsectie sectie

  1. Visualiseren H & E gekleurde en IHC weefselcoupes onder een helderveld microscoop. Maak foto behulp ladingsgekoppelde inrichting (CCD) camera op de microscoop. voor qKWANTITATIEVE analyse kunnen imaging software worden gebruikt
    1. Scan de hele gekleurde secties met behulp van een scanscope met een 20X objectief.
    2. Meet de epidermale dikte minder dan 1 mm segment van de epidermis en tel het aantal Ki67-immuunreactieve cellen in het segment.
      OPMERKING: Kwantitatieve analyse wordt uitgevoerd met behulp van microscopie automatisering en software voor beeldanalyse. Epidermale dikte wordt bepaald door de afstand tussen de basale laag en de buitenste laag van de epidermis.
    3. Tel het aantal Ly6G-immuunreactieve cellen in het dermale gebied (230 x 270 pm2 rechthoek) direct onder topische IMQ behandelde huid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Terwijl sommige roodheid was duidelijk binnen het eerste uur na prikken met acupunctuurnaalden, de huid gewist op dag 2 en geen negatieve huidreactie tot dag 7 waargenomen na prikken (figuur 2A). Naald prikken geïnduceerde zeer lage orthokeratosis epidermale en dermale minimale infiltratie door H & E analyse vergeleken met onbehandelde huid (Figuur 2B). De epidermale dikte (figuur 2C) en het aan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De meest kritische stap om de expressie van het plasmide-DNA acufected waarborgen is gelijkmatig oscilleren en draai de hoornlaag van de huid. Terwijl zachtjes duwen de naald zonder dat de huid, moet de kracht hard genoeg om het oppervlak te drukken. Absorptie van DNA in 10 ui oplossing op een 1 cm x 1 cm oppervlak te vergemakkelijken moet de naalden oscilleren op en neer ongeveer 100 keer 30 seconden. Men kan de kracht die moet de huid prikken bepalen en door vaststellend het aantal keren dat nodig is om de beste expre...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen financiële belangen te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidie ​​van het ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Wij danken Drs. Betty Wu-Hsieh en Chien-Kuo Lee bij NTU, Leigh Zerboni aan de Stanford University en Dr. Peter Hoffmann aan de Universiteit van Hawaii voor het lezen van het manuscript, Yun Chien bij NTU voor technische bijstand, en Dr Wen-Chi Wei op landbouw biotechnologie Research Center bij Academia Sinica voor technisch advies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Accu Handy NeedleAccu36Gx0.5Medisch hulpmiddel
NairTM LotionChurch & DwightN/AGebruik om haar te verwijderen
Shandon Xyline substituteThermo Fisher Scientific6764506Deparaffinisatie
Avertin (2,2,2-Tribromethanol)Sigma-AldrichT4,840-2Anesthesie
2-methyl-2-butanolSigma-Aldrich152463Oplosmiddel voor de oplossing van avertin
DifcoTM LB bouillon, MillerBD244620Propagatie en onderhoud van E. coli voor moleculaire biologie
Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kiteBioscience88-7215Meet IL-15 eiwit
Anti-muis Ly6GBioLegend127601Antilichaam gebruikt voor immunohistochemische kleuring
anti-muis Ki-67eBioscience14-5698-80Antilichaam gebruikt voor immunohistochemische kleuring
Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)Nichirei Biosciences414341FReagens om achtergrondsignaal in muis-op-muis kleuring te blokkeren
DAB Peroxidase (HRP) Substraat KitVector LaboratoriesSK-4100Peroxidase substraat voor immunohistochemische kleuring
Ultra V blokThermo Fisher ScientificTA-060-UBVermindering van niet-specifieke achtergrondkleuring
MethylgroenSigma-AldrichM8884Kernkleuring
Vecta MountTMVector LaboratoriesM-5000Permanent bewaren van histochemische kleurstoffen
Protease remmer cocktail tablettenRoche04-693-116-001Rem protease activiteit in celextract
Aldara crème3M ParmaceuticalsN/A5% imiquimod crème
Bessman Tissue PulverizerSpectrum Labs189475Gebruik om huidweefsel te pulveriseren
ABI7900HT cyclerThermo Fisher ScientificN/Akwantitatieve real-time PCR-assay
CamcorderPanasonicHDC-SD60Beelddocumentatie
Axio Scope.A1ZEISSN/AHeldere veld microscopie

Referenties

  1. Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
  2. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
  3. Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
  4. Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
  5. Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
  6. Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
  7. Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
  8. Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
  9. Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
  10. Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
  11. Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
  12. Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
  13. Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
  14. van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
  15. Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
  16. Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
  17. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  18. Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
  19. Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
  20. Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
  21. Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

MuizenhuidPlasmid DNAAcupunctuurnaaldjesIL 15 isovormTLR7 agonistImiquimod behandelingqRT PCR analyseImmunohistochemische kleuring
Ontwikkeling van een Economische DNA Delivery System door "Acufection" en de toepassing ervan op Skin Research
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.