Intraductale Levering aan de Rabbit borstklier

Samenvatting

Hier beschrijven we een techniek voor de gelokaliseerde toediening van reagentia aan de borstklier van konijnen via een intraductale injectie. Daarnaast beschrijven we een protocol voor visualisatie en bevestiging van de toediening door middel van hoogwaardige echografie met contrastmiddelen.

Samenvatting

Gelokaliseerde intraductale behandelingen voor borstkanker bieden mogelijke voordelen, waaronder efficiënte levering aan de tumor en verminderde systemische toxiciteit en bijwerkingen ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.} Echter, een aantal uitdagingen blijven voordat deze behandelingen op grotere schaal kan worden toegepast. De ontwikkeling en validatie van intraductal therapeutica in een geschikt diermodel vergemakkelijken van de ontwikkeling van intraductal therapeutische strategieën voor patiënten. Terwijl de muis borstklier grote schaal gebruikt als een modelsysteem van borstklier ontwikkeling en tumorigenese, de anatomie verschilt van de menselijke klier. Een grotere diermodel, zoals het konijn, kan dienen als een beter model voor borstklier structuur en intraductale therapeutische ontwikkeling. in contrast aan muizen, waarin tien ductale bomen ruimtelijk verdeeld langs de lichaamsas, elk eindigend in een afzonderlijke speen, het konijn borstklier meer lijkt op de menselijke klier, meerdere overlappende ductale systemen die uitgang via afzonderlijke openingen in één speen. Hier presenteren we minimaal invasieve werkwijzen voor het afleveren van reagentia direct in het konijn borstklier kanaal en visualisatie van de levering zelf met hoge resolutie echografie.

Inleiding

De intraductale afgifte van therapeutische middelen is bestudeerd in diermodellen en in een vroeg stadium menselijke proeven ^{3, 4, 5, 6, 11, 12.} Een recent Fase I studie toonde de veiligheid en de haalbaarheid van intraductal carboplatine of intraductal gepegyleerde liposomale doxorubicine bij vrouwen wachten mastectomie voor de behandeling van invasieve kanker ^2.

Eerdere protocollen voor intraductale afgifte zijn ontwikkeld voor muizen en ratten borstklieren ^{6, 7, 8, 9.} Voor onderzoeksdoeleinden, intraductal tumorcel injecties en de lentivirale vector levering van oncogenen zijn ook uitgevoerd in diermodellenref "> ^{13, 14, 15, 16.} evenwel een ideale in vivo model van de intraductal leveringsproces moet de ontwikkeling van nieuwe klassen van therapeutische verbindingen mogelijk en preklinische beoordeling mogelijk. anatomische verschillen tussen knaagdieren en mensen hebben de vertaling van deze gecompliceerde studies.

In tegenstelling tot muizen, waarbij elk kanaal eindigt in een afzonderlijke speen, de menselijke borst bestaat uit 5-9 onafhankelijke ductale systemen, elk met een aparte opening eindigt bij de speen. Rabbit melkklieren haven vier onafhankelijke ductale systemen, elk afzonderlijk toegankelijk via een van de vier openingen in één speen. Een konijnenmodel beter overeenkomt met de menselijke anatomie en maakt de studie van intraductal geneesmiddelafgifte in een relevante context.

Hier maken we gebruik van twee technieken om intraductal levering beoordelen. De co-toediening van eenvitale kleurstof maakt visualisatie door de huid en zorgt voor een eenvoudige en snelle bevestiging van deze methode. Voor sommige toepassingen kan hogere resolutie in kaart brengen van de kanalen de voorkeur. We presenteren hier een protocol voor echografie van de kanalen door de intraductale levering van een niet-gerichte contrast reagens.

Protocol

Procedures met behulp van proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Texas in Austin.

1. Preoperatieve Voorbereiding

1. Registreer het lichaamsgewicht van elk konijn. Zoals bij alle preklinische studies, bewaken diergewichten regelmatig mogelijke toxiciteit te beoordelen.
2. Vóór verlamming het konijn, vul een 50 ml conische buis met commercieel verkrijgbare echogel en centrifugeren bij 500 xg gedurende 30 s; Er mogen geen zichtbare luchtbellen in de gel na voltooiing van het centrifugeren.
3. Dien glycopyrrolaat subcutaan toegediend in een dosis van 0,1 mg / kg acepromazine en intramusculair met een dosis van 0,75 mg / kg. Wacht 15-20 minuten voor het kalmerende door te voeren, terwijl het toezicht op de vitale functies en gedrag.
   OPMERKING: Glycopyrrolaat is een anti-cholinergisch middel dat bradycardie voorkomt en vermindert respiratoire secreties en GI. Acepromazine is een kalmerend middel dat dient als premedicativoor anesthesie.
4. Dien 35 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazine subcutaan als anestheticum. Aangezien de operator wordt ervaren en kunnen de intraductale afgifte sneller bereiken, het geneesmiddel doseringen verlaagd tot 15 mg / kg ketamine en 3 mg / kg xylazine subcutaan; dit zal de narcose tijd en de tijd die het dier herstellen van de anesthesie verkorten.
5. Controleer en documenteren van de hartslag, SPO _2, temperatuur, ademhaling, en slijm membraan kleur elke 15 min. Solliciteer eye smeermiddel aan beide ogen.
   NB: Alleen personeel die een passende opleiding hebben ondergaan en door IACUC van hun instelling goedgekeurd moeten beheren of te monitoren anesthesie. Het gebruik van een veterinair anesthesiemonitor kan helpen bij het verkrijgen vitale functies en wordt aanbevolen. De veterinaire anesthesie monitor, maar vervangt niet de noodzaak om het dier elke 15 min handmatig te controleren. Zie de instructies van de fabrikant van fof het juiste gebruik van een dierenarts monitor.
6. Controleer of het begin van de anesthesie door een zachte teen knijpen; het konijn moet niet reageren alvorens verder te.
7. scheren voorzichtig caudale buik van het konijn in de omgeving van de derde en vierde paren lies spenen.
8. Met de meerderheid van de haren verwijderd, breng een over-the-counter ontharingscrème om de kaalgeschoren omgeving. Verwijder de crème 10 min na applicatie met vochtige papieren handdoeken bevochtigd met warm water.
   LET OP: Het konijn huid is zeer fragiel / gevoelig. De ontharingscrème worden gebruikt voor niet meer dan 10 min. In feite is het veiliger om een ​​"test spot" probeer op 5 min en alleen achter te laten op langer als proef spot geeft een langere periode nodig is.
9. Veeg het gebied met alcohol doordrenkte gaasjes op de injectieplaats te reinigen.
10. Plaats het konijn op het dorsum in een V-vormige trog gevoerd met een recirculerende warm water deken en een absorberend kussen.

2. Preparation van het contrastmiddel

1. Reconstrueren de ongerichte contrast Reagens volgens de instructies van de fabrikant. Pipet op en neer voorzichtig te mengen.
   Opmerking: Het contrastmiddel gebruikt in dit protocol is stabiel bij kamertemperatuur gedurende 4-6 uur na reconstitutie. Schud de flacon tussen elke retrieval.
   OPMERKING: De volume oplossing dat nodig is hangt af van het aantal kanalen te spuiten. Het konijn heeft 4 ductale openingen per speen en 0,2 ml oplossing voldoende is om een ductale boom van een volwassen New Zealand Wit konijn (Oryctolaguscuniculus) vullen. Aldus kan een totaal volume van 0,8 ml worden geleverd aan een borstklier.

3. intraductale Delivery

1. Zoek de juiste spenen te injecteren; de 3 ^e en 4 ^e paar lies spenen worden aanbevolen, omdat ze gemakkelijk worden gevisualiseerd als het dier wordt geplaatst op haar dorsum.
2. Load 0,2 ml steriele 0,9% zoutoplossing ineen 1 ml Luer-lock tuberculine spuit met een 22 G naald. Gooi de 22 G-naald zodra de zoutoplossing in de spuit en te vervangen door een steriele 25-gauge naald. Veeg het gebied met 85% isopropylalcohol op een gaasje.
3. Met de schuine kant van de naald en de injectiespuit parallel aan het lichaam van het dier, plaatst de schuine kant van de naald in de zijkant van de speen en injecteer langzaam 0,1-0,2 ml zoutoplossing; dit zal zorgen voor een betere visualisatie van de ductale openingen.
4. Load 0,2 ml injectieoplossing in een 1 ml Luer-lock tuberculine spuit.
5. Houd de speen zachtjes met de duim en wijsvinger en til het iets om het te positioneren voor de intraductal injectie; een draagbare oculaire loupe kunnen helpen bij het visualiseren van de ductale openingen.
6. Met behoud van de opgeheven positie van de speen, zorgvuldig canule het kanaal van belang met behulp van een 25 G stompe-tip naald.
7. Na infusen, voorzichtig draai de Luer-lock spuit op de naaf van de stompe-tip infusie naald totdat het is vergrendeld.
8. Til de speen en injecteer de oplossing langzaam om mogelijke schade als gevolg van snel bewegende vloeistof in het kanaal een minimum te beperken; op geen enkel moment moet er weerstand bij het injecteren van de oplossing.

4. Ultrasound Imaging

1. Breng een ruime hoeveelheid gecentrifugeerde ultrasound gel op de huid van het gebied van belang. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de gel, omdat deze de beeldkwaliteit in het gedrang brengt.
2. Stel de beeldvorming diepte 6 mm. Plaats de 21-MHz transducer in contact met de gel en scan het interessegebied in B-modus. Let op het contrast medium in de gescande regio, waaronder de ductale opening en de rest van het kanaal.
   Opmerking: Deze instellingen zijn ontwikkeld voor gebruik met een specifiek fotoakoestische ultrageluidapparaat. Raadpleeg de tabel van materialen voor meer informatie. Het kan nodig zijn om het zendvermogen en imaging scherptediepte andere beeldvormende systemen borstklier optimaliseren passenklier visualisatie.
3. Verwijder de ultrasone gel uit de huid van het dier met een gaasje.

5. postoperatieve zorg

1. Let op de injectieplaats: er mogen geen tekenen van trauma op de speen regio of het omringende weefsel, en zwelling in het gebied rondom de speen geeft waarschijnlijk een mammair vetkussentje injectie plaats succesvol intraductale injectie.
2. Leg het konijn in een borstbeen positie. Indien nodig, geeft 0,2 mg / kg intraveneus yohimbine de marginale oorader; Dit zal het effect van xylazine omkeren en laat het dier sneller te herstellen van de anesthesie.
3. Bewaak het konijn elke 15 min gedurende de herstelperiode tot het dier is alert, responsief, en onderhoudt een borstbeen positie.
   LET OP: Deze procedure mag niet leiden tot weefselschade of zwelling. Als roodheid of zwelling worden waargenomen, toedienen van een dosis van meloxicam 0,1-0,2 mg / kg PO zodra het dier is alert en in staatmedicatie oraal te nemen. Neem contact op met de veterinaire personeel van de instelling voor verdere begeleiding.

Resultaten

Hier laten we zien dat de intraductale afgifte van contrast reagentia de borstklier kanalen van een konijn kan worden bereikt zonder trauma aan het weefsel (Figuur 2). Bij konijnen vier afzonderlijke ductale systemen convergeren op een speen kan derhalve worden benaderd en afzonderlijk belicht met deze methode. Afzonderlijke ductale openingen zijn gemakkelijk gevisualiseerd; let op de pijlpunt het markeren van een tweede ductale opening grenzend aan de canule kanaal in <...

Discussie

Deze methode van intraductal levering aan het konijn uier kan worden gebruikt voor het ultrageluid contrast reagentia en vele andere waterige oplossingen, waaronder vitale kleurstoffen en therapeutica. Eerdere studies hebben aangetoond intraductale afgifte van hormonen ^{17, 18, 19.} In knaagdiermodellen, de intraductale afgifte van nucleïnezuren ^8, chemotherapeutica ^6,

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
MicroMarker niet-doelgerichte contrastreagens	VisualSonics	VS-11694
Luer Lock 1 mL Spuit	BD	309628
Glycopyrrolate 0,2 mg/mL	Wedgewood Compounding Pharmacy	GLYCOP-INJ013VC	6 maanden houdbaarheid, beperkte beschikbaarheid.
Atropine Sulfaat 0,5 mg/mL	Animal Health International	15320764	Als glycopyrrolate niet beschikbaar is. Niet combineren met glycopyrrolate.
Ketamine HCL 100 mg/mL	Animal Health International	21250699	http://www.animalhealthinternational.com/
Acepromazine 10 mg/mL	Animal Health International	17640541
Xylazine 20 mg/mL	Animal Health International	20101547
Yohimbine 0,2 mg/mL	Animal Health International	14588965
Haarverwijderingscrème	Veet		Gevoelige huid oplossing. Beschikbaar via lokale retailers.
Blunt tip infuusnaalden	Sai Infusion Technology	B14-50	http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles
Veterinaire Pulsoximeter	EdanUSA	VE-H100B	http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html
Warm Water Pomp	Gaymar	TP700
Warm Water Deken	Animal Health International	21232696	Maxi-Therm Lite Verwarmingspads
Ultrasound systeem	VisualSonics	Vevo 2100