Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Summary

Hier presenteren we een veelzijdige montagemethode die langetermijn tijds-gelaps beeldvorming mogelijk maakt van de ontwikkeling van het achterste lichaam van levende zebravisembryo's zonder de normale ontwikkeling te verstoren.

Abstract

Zebravisembryo's vormen een ideale experimenteel systeem om complexe morfogenetische processen te bestuderen vanwege hun gemakkelijke toegankelijkheid en optische transparantie. Vooral achterste lichaam rek een essentieel proces in embryonale ontwikkeling waarbij meerdere weefsel vervormingen werken samen om de vorming van een groot deel van de lichaamsas sturen. Om dit proces te observeren door langdurige time-lapse imaging moet een bevestigingstechniek waarmee voldoende steun monsters in de juiste positie te houden gedurende de overbrenging naar de microscoop en verkrijging gebruiken. Daarnaast moet de montage ook voldoende bewegingsvrijheid voor de uitgroei van de achterste lichaamsgebied zonder aantasting van de normale ontwikkeling. Tenslotte moet een zekere veelzijdigheid van de montagewijze beeldvormende worden vrijgemaakt voor diverse imaging setups. Hier presenteren we een bevestigingstechniek voor beeldvorming van de ontwikkeling van achterste lichaam elongation in de zebravis D. rerio. Deze techniek houdt montage embryo zodanig dat de kop en dooierzak regio vrijwel volledig opgenomen in agarose, terwijl de achterste lichaamsgebied te rekken en normaal te ontwikkelen. We zullen zien hoe dit kan worden aangepast voor rechtop, omgekeerd en verticale light-sheet microscopie set-ups. Hoewel dit protocol is gericht op montage embryo's voor beeldverwerking met het achterste lichaam, kan het gemakkelijk worden aangepast voor de live imaging meerdere aspecten van zebravis ontwikkeling.

Introduction

Achterste lichaam rek een essentieel proces in embryonale ontwikkeling van het embryo zich een groot deel van de lichaamsas vormen. Het is een voorbeeld van een complex morfogenetisch proces waardoor meercellige gedrag optreden coördinerend de morfogenese op het niveau van afzonderlijke weefsels genereren. Deze differentiële weefsel vervormingen dan samenwerken om de verlenging van het achterste lichaam te genereren in de hele structuur niveau. Om te begrijpen hoe deze processen worden aangestuurd en gecoördineerd tijdens de ontwikkeling, moeten we in staat zijn om deze processen op verschillende schalen te volgen (dat wil zeggen op het niveau van moleculen, cellen, celpopulaties en weefsels) en deze rechtstreeks verband houden met de morfogenese van de gehele structuur .

Zebravis embryo's zijn ideaal voor imaging achterste lichaam rek als hun optische transparantie en de geringe afmetingen zorgt voor de toepassing van minimaal invasieve licht imaging benaderingen zeer geschikt voor live beeldvorming. ¹ Dit werd aangetoond door een aantal recente publicaties die gebleken werpen op achterste lichaam ontwikkeling op moleculair niveau, ² enkele cellen, ³ en inter-weefsel gedrag, ⁴ en op het niveau van de celpopulatie en hele organen. ⁵

Geavanceerde imaging technieken zoals confocale, multi-foton microscopie en selectieve vliegtuig verlichting microscopie (SPIM) worden waardoor de lange termijn beeldvorming van ontwikkelingsprocessen met een verminderde werking van het licht toxiciteit en foto-bleken. Robuuste technieken voor de bevestiging van levende monsters nodig heeft drie doelen: 1) voldoende steun aan de bemonsteringen in de juiste positie te houden gedurende de overbrenging naar de microscoop en tijdens acquisitie, 2) voldoende bewegingsvrijheid van het monster om de uitgroei van het achterste lichaam regio zonder dat zijn normale ontwikwikkeling, en tenslotte 3) een zekere mate van veelzijdigheid van de montage-methode om imaging staan ​​op diverse imaging set-ups.

Dit protocol introduceert een bevestigingstechniek voor het afbeelden van de ontwikkeling van de zebravis D. rerio. Deze techniek houdt montage embryo zodanig dat de kop en dooierzak regio vrijwel volledig opgenomen in agarose, terwijl het achterste lichaamsgebied te rekken en normaal te ontwikkelen. Als zodanig is het ook een geschikte methode voor de lange termijn beeldvorming van andere delen van het lichaam ontwikkelen als agarose maakt beeldvormend standaardfitting beeldvormingstechnieken. Dit protocol demonstreert montage van embryo's in een zijwaartse richting, maar het is ook mogelijk om embryo's in alteratieve oriëntaties monteren. Het zal verder zien hoe u de methode voor het rechtop, omgekeerd en verticale light-sheet microscopie opstellingen aan te passen.

Protocol

1. Voorbereiding van de Solutions en trok glazen naald

1. Wordt 25x voorraadoplossing van tricaïne (3-amino benzoëzuurethylester, ook wel ethyl 3-aminobenzoaat) en 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8,8 en breng deze oplossing bij pH 7. Aliquot van 4 ml en bewaar bij -20 ° C.
   LET OP: De verdoving tricaïne werkt bij voorkeur op neurale-voltage-gated natriumkanalen waardoor spiertrekkingen en beweging ⁶ blokkeren.
2. Maak een werkoplossing van tricaïne bij een uiteindelijke concentratie van 0,17 mg / ml in E3 embryo medium. ⁷
   LET OP: Maak de tricaïne werkende oplossing ex tempore als de pH van deze oplossing drijft.
3. Los het lage smeltpunt agarose tot een uiteindelijke concentratie van 1,5% in E3 embryo medium in een 50 ml buis door verwarming van de oplossing in een magnetron. Laat deze oplossing in evenwicht tot 42-45 ° C in ofwel een waterbad of bench-top incubator. Als voorbereiding van grote schotels voor verticalelight-sheet imaging (stap 4), maak dan een extra 25 ml van 1% -norm smeltende agarose in E3 embryo medium.
4. Gebruik borosilicaatglas met filament capillairen met een afmeting van 1,20 mm OD, ID 0,69 mm, lengte 10 mm.
5. Als haarvaten worden getrokken van het type verwarming filament naald puller in de tabel van de apparatuur en reagentia, gebruik de volgende instellingen beschreven: Heat 600, Pull 120, Velocity 50, Time 225, Pressure 500. Met een paar scherpe tang, breken de naald net voorbij het punt waar het buigt om een ​​schone en scherpe naald voor het oriënteren embryo's en het verwijderen van overtollige agarose creëren. Een micro-scalpel kan ook worden gebruikt om overtollige agarose te verwijderen.

2. Inbedding van embryo's voor Inverted of Upright Microscopy

1. Breng de embryo's tot aan de juiste fase in E3 embryo medium. ⁷
2. Aan het vereiste stadium dechorionate embryo met een paar scherpe tang onder een binoculaire dissecTing microscoop.
3. Incubeer de dechorionated embryo gedurende tenminste 5 min in tricaïne werkoplossing.
4. Zodra de gesmolten agarose oplossing afgekoeld tot 45 ° C, gebruikt een glazen Pasteur pipet om de dechorionated embryo direct in de 50 ml buis met minimale overdracht van E3 medium.
5. Verwijder embryo samen met ongeveer 1 ml van de montage medium en voeg ong. 100 ui samen montage medium met het embryo van de centrale cirkel van een 35 mm glazen bodem petrischaal met een 10 mm microwell.
6. Aangezien het fixeermiddel plaatst, beweegt het embryo naar de rand van de cirkel van agarose met de staart naar buiten (Figuur 1A). Gebruik de capillaire naald voor het embryo handhaven de gewenste zijwaartse richting totdat de gel volledig is ingesteld. Om het achterste lichaam ontwikkeling, zorg om het embryo in als zijwaartse een oriëntatie mogelijk te oriënteren. Daarom onderhouden van de embryo in deze positie door zorgvuldige adjustments met de capillaire naald.
   OPMERKING: meerdere embryo's kunnen worden toegevoegd aan de montage schotel op dit punt, indien nodig. Als dit het geval brengt de laagsmeltende agarose in de schaal eerst en voeg het embryo naar het midden van de agarose druppel. Druk vervolgens de embryo's op de randen van de glazen ring en oriënteren in de gewenste positie. Tot zes embryo's kunnen op deze manier voor de agarose wordt gestold worden gemonteerd.

3. Verwijdering van Excess Agarose Around the Posterior Body

NB: Dit deel beschrijft de procedure waarmee agarose uit de regio rond het achterste lichaam wordt verwijderd. Bij achterste lichaam rek, is het belangrijk dat de staart kan groeien-out normaal. Door het verwijderen van de agarose nadat het embryo volledig is opgenomen door agarose, wordt het embryo links omsloten door het kopgebied en ongeveer de helft van de dooierzak.

1. Nadat de agarose druppel heeft ingesteld, overspoelen de petri dish met de tricaïne werkende oplossing.
2. Onder een microscoop ontleden verrekijker met een verzonden licht base, pas de spiegel positie en de hoek van invallend licht, zodat het sterke contrast maakt de bezuinigingen in de agarose duidelijk worden gezien door de operatie.
3. Uitvoeren gesneden 1 (figuur 1) Gebruik de capillaire naald of micro-scalpel om de agarose halverwege langs de dooier snijden, vanaf een plaats juist achter het vormen hart veld de positie van de somite 5 (de 5 ^e anterior somite).
4. Start de eerste cut grenst aan de vorming van het hart, zoals aangegeven, en de volledige weg door de agarose aan het glas.
5. Houd de capillaire of micro-scalpel diep in de agarose, en langzaam zag op en neer, terwijl begint een lange snee boven het embryo te maken, zoals getoond figuur 1. Gesneden zo dicht mogelijk bij het embryo mogelijk zonder doorboren het embryo of de dooier.
6. Vervolgens bezuinigen 2 en 3 (figuur 1 ), Uitgaande van de positie ten opzichte van de embryo en met de gesneden gaat helemaal naar beneden naar de glazen bodem schotel. Voeg 2 gesneden zodat het raakt aan de eerste 5 somieten die volledige dorsalward ontvouwing van het achterste lichaam. Voeg snij 3 bij een 90 ° hoek met het oppervlak dooier en vanaf de Heartfield.
   Opmerking: Het snijden van de agarose tot de rand van het glas cirkel (zie figuur 1) helpt bij het verwijderen van de agarose als een volledig blok (stap 3,6). Dit is echter niet noodzakelijk.
7. Vanaf de kruising van bezuinigingen 1 en 3, maak een langzame diagonale snede aan het einde van de snede 2, terwijl langzaam te tillen boven het oog op het plein van agarose rond de achterste lichaam los te maken.
   Notities: In sommige gevallen wordt dit vrijgegeven in een blok en de operatie in één keer voltooid. In andere gevallen kan het enkele pogingen ondernemen om dis-lodge alle agarose rond het embryo.
8. Met een paar scherpe tang, verwijder de verdreven bsloten agarose uit het embryo medium. Om te helpen bij dit proces, beweegt de stukken agarose aan de kant van de schaal en het gebruik van de wand van de petrischaal ondersteuning tijdens het optillen van de stukken agarose.

Figuur 1: Schema's van Montage Set-ups. (A) Het diagram toont de positie van de gemonteerde embryo in het centrum glasring van een petrischaal. Aan de rechterkant is een gezoem van de embryo met elke opeenvolgende snede door de omliggende agarose getoond met dottted rode lijnen. (B) De gemonteerde embryo wordt schematisch in zijaanzicht het weergeven van de gemakkelijke toegang voor zowel omgekeerd en rechtop doelstellingen. (C) Een soortgelijke digram toont hoe embryo's kunnen worden gemonteerd voor verticale licht sheet beeldvorming set-ups. Gelieve click hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

9. Als spiertrekkingen niet volledig geblokkeerd is op dat punt, druppels tricaïne toe te voegen uit de voorraad oplossing van 4 mg / ml, pH 7.

4. Montage van embryo's voor Vertical Light-sheet Microscopy

Opmerking: Dit is een variatie op de hierboven beschreven werkwijze die het mogelijk maakt voor de toegang van meerdere doelen voor beeldvorming steekproefsgewijs verticaal georiënteerde SPIM. Het idee achter deze wijziging is het monster iets hoger dan de bodem van de schaal te heffen, zodat gemakkelijk naar de twee imaging doelen.

1. Vóór montage monster, laag een 100 mm plastic petrischaal met 1% agarose in E3 medium tot een hoogte van 5 mm en laat opstijven.
2. Een druppel van 1 ml laag-smeltpunt agarose naar het midden van de schaal en laat opstijven.
3. Embedden embryo's in laag-smeltpunt agarose zoals in hoofdstuk 2. Echter, dit keer, verwijder het embryo uit de 50 ml buisagarose met een kleinere druppel van oplossing (0,5 ml) en plaats deze kleine druppel boven de 1 ml vallen in het midden van de schaal.
4. Gebruik de capillaire naald om het embryo te plaatsen in het midden van het druppeltje en de correcte positie te houden totdat gel ingesteld.
5. Overspoelen de schotel met tricaïne werkende oplossing en verwijder de overtollige agarose zoals in hoofdstuk 3, maar zonder te snijden door middel van het kussen van de 1% -norm agarose.

Results

Het protocol hierboven geschetste Gegevens een veelzijdige techniek voor de montage van de zebravis embryo's voor de lange termijn time lapse imaging. Een voorbeeld hiervan wordt getoond in figuur 2A en geanimeerde / video Figuur 1. Embryo's werden geïnjecteerd op de 1 cellig stadium met mRNA dat codeert voor het fluorescerende eiwit photoconvertible kikumeGR. Aan het 15 somiet fase werden zij geplaatst zoals hierboven beschreven en afgebeeld ged...

Discussion

Deze montage techniek maakt het mogelijk embryo's nog steeds tijdens de overdracht aan de microscoop en op lange termijn time-lapse imaging experimenten gericht op het volgende achterste lichaam rek bij meerdere lengteschalen worden gehouden. Bovendien is veelzijdig doordat het zorgt voor beeldvorming zowel rechtop en ondersteboven microscopie opstellingen en een suggestie gedaan voor hoe dit verder kan worden aangepast om verticaal georiënteerde SPIM.

Een kritische stap in dit protocol ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
VERBRUIKSBARE ITEMS
Schotels met glazen bodem	Mattek	P35-1.5-10-C	35 mm Petri schaal, 10 mm microput. Nr. 1.5 dekglas
Kapillaren voor injectienaalden	Sutter	BF 120-94-10	We gebruiken orosilicate glas met filament, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, lengte 10 cm. Echter, filament naalden zijn niet noodzakelijk en de meeste standaard injectienaalden zouden moeten werken.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather wegwerp oogafschaar met plastic handvat
Pasteur Pipetten			230 mm lang
REAGENTIA
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Agar-agar met laag smeltpunt	Sigma-Aldrich	A9414
APPARATUUR
Fijne pincetten	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Naaldtrekker	Sutter	P97	Naaldtrekker met verwarmingsfilament
Binoculaire dissectiemicroscoop	Leica	S8 Apo