3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Samenvatting

Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.

Samenvatting

Kraakbeen techniek blijft een uitdaging vanwege de moeilijkheden bij het creëren van een in vitro functionele ingreep vergelijkbaar met de natieve weefsel. Een benadering recentelijk onderzocht voor de ontwikkeling van autologe vervangingen omvat de differentiatie van stamcellen tot chondrocyten. Dit chondrogenese, een verdichtingsgraad van de stamcellen nodig initiëren; dus hebben we aangetoond dat de haalbaarheid van magnetisch condenseren cellen, zowel in dikke steigers en scaffold-vrij, via geminiaturiseerde magnetische veldbronnen cel- Aantrekkers. Deze magnetische benadering werd ook gebruikt om de totale fusie te begeleiden en steiger-vrij, georganiseerd bouwen, driedimensionale (3D) weefsels enkele millimeters groot. Naast het hebben van een verbeterde afmeting, het weefsel gevormd door magnetisch aangedreven fusie gepresenteerd een significante toename van de expressie van collageen II, en een soortgelijke trend werd waargenomen voor aggrecan expressie. Als het natieve kraakbeen werd onderworpen aan krachten thoed beïnvloed zijn 3D-structuur, werd dynamische rijping ook uitgevoerd. Een bioreactor die mechanische stimuli biedt werd gebruikt om de cultuur van het magnetisch gezaaid steigers over een periode van 21 dagen. Bioreactor rijping grotendeels verbeterd chondrogenese in de cellularized steigers; de extracellulaire matrix verkregen onder deze omstandigheden was rijk aan collageen II en aggrecan. Dit werk beschrijft de innovatiepotentieel van magnetische condensatie van gelabelde stamcellen en dynamische rijping in een bioreactor verbeterde chondrogene differentiatie, zowel scaffold-vrij binnen polysaccharide steigers.

Inleiding

Magnetische nanodeeltjes worden al gebruikt in de kliniek als contrastmiddelen voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI), en hun therapeutische toepassingen blijven uitbreiden. Zo is onlangs aangetoond dat gelabelde cellen kunnen worden gemanipuleerd in vivo toepassing van een extern magnetisch veld en kunnen worden gericht en / of gehouden op een gedefinieerde plaats van de implantatie ^{1, 2, 3.} Regeneratieve geneeskunde, kunnen zij worden gebruikt om georganiseerde weefsels in vitro ^4, omvattende vasculaire tissue ^{5, 6, 7, 8} bot en kraakbeen ⁹ ingenieur.

Gewrichtskraakbeen wordt ondergedompeld in een avasculaire omgeving, waardoor reparatie van de extracellulaire matrixcomponenten zeer beperkt indien schade optreedt. Om deze reden, research is momenteel gericht op de techniek van hyaline kraakbeen vervangingen die in de defectplaats kunnen worden geïmplanteerd. Om een autoloog vervanging produceren sommige onderzoeksgroepen verkennen van het gebruik van autologe chondrocyten als bron van cellen ^{10, 11,} terwijl anderen benadrukken het aantal mesenchymale stamcellen (MSC) te differentiëren tot chondrocyten ^{12, 13.} In eerdere studies hier recapituleerde, hebben we gekozen voor MSC, als hun beenmerg sampling is vrij eenvoudig en niet het offer van gezonde chondrocyten, die dreigen te verliezen hun fenotype ¹⁴ vereisen.

Een vroege stap essentieel voor het initiëren van de chondrogene differentiatie van stamcellen is hun condensatie. Celaggregaten worden gewoonlijk gevormd met behulp van centrifugatie of micromassakweek ^15; Maar deze condensatieprodukten werkwijzen neither presenteren potentieel cel clusters binnen dikke scaffolds of de potentie om de fusie van aggregaten regelen creëren. In dit artikel beschrijven we een innovatieve benadering condenseren stamcellen via MSC magnetische labeling en magnetische aantrekking. Deze techniek is bewezen dat scaffold-vrije 3D constructen via de fusie van aggregaten met elkaar vormen van een millimeter schaal kraakbeenweefsel ⁹ te verkrijgen. Magnetische zaaien van dikke en grote steigers benadering maakte ook de mogelijkheid om de omvang van de gemanipuleerde weefsel, het ontwerp van een vorm gemakkelijker bruikbaar voor implantatie en diversificatie van het potentieel voor klinische toepassingen herstel van kraakbeen. Hier hebben we gedetailleerd protocol voor de magnetische zaaien van MSC in poreuze draagstructuren samengesteld uit natuurlijke polysacchariden, pullulan, dextran en, steigers eerder gebruikte stamcellen ^{16, 17} beperken. Chondrogene differentiatie was finally uitgevoerd in een bioreactor continu voedingsstoffen en gasdiffusie waarborgen in de matrixkern van de steigers gezaaid met een hoge dichtheid aan cellen. Naast het verstrekken van voedingsstoffen, chondrogene groeifactoren en gas aan de cellen, de bioreactor bood mechanische stimulatie. Kortom, de magnetische technologie gebruikt om stamcellen te beperken, gecombineerd met dynamische rijping in een bioreactor, aanzienlijk kan verbeteren chondrogene differentiatie.

Protocol

1. De bouw van de Magnetic Devices

OPMERKING: De inrichtingen gebruikt voor het zaaien van cellen variëren afhankelijk van de toepassing (figuur 1). Om aggregaten te vormen, wordt het aantal cellen dan 2,5 x 10 ⁵ / aggregaat, zodat de magnetische kop zeer dunne (750 pm in diameter) moet zijn. De 1,8 cm ^2/7 mm dik steigers zaad, moeten de magneten groter (3 mm diameter) en zorgt celmigratie door de poriën van de scaffold.

1. Constructie van een inrichting met micro-magneet voor aggregaatvorming (Figuur 1A)
   1. Maak micro-gaten met een 0,8-mm doorsteken aluminiumplaten (3 cm in diameter en 6 mm dik).
   2. Plaats een magnetische punt (750 um diameter) in elk gat van de plaat.
   3. Plaats deze schijf over een permanente neodymium magneet, die magnetisatie zorgt tot verzadiging.
2. Bouw van een inrichting voor steiger zaaien ( Figuur 1B)
   1. Gesneden harde polystyreen in 2,4 ^cm2 vierkantjes.
   2. Plaats 9 magneetjes (3 mm diameter 6 mm) op gelijke afstand over een oppervlak van 1,6 ^_cm2.
   3. Plaats dit apparaat over een permanente neodymium magneet.

2. Stem Cell Labeling

OPMERKING: Stamcellen werden gemerkt met 0,1 mM magnetische nanodeeltjes gedurende 30 minuten (2,6 ± 0,2 pg ijzer / cel) aan aggregaten, terwijl ze werden gemerkt met 0,2 mM magnetische nanodeeltjes gedurende 30 min (5 ± 0,4 pg ijzer / cel) aan zaad steigers. Deze nanodeeltjes concentraties en incubatietijden zijn eerder gebruikt en gepubliceerd MSC en andere cellen ^{18, 19,} en er is vastgesteld dat nanopartikels beïnvloed noch cellevensvatbaarheid noch MSC differentiatievermogen. De massa ijzer opgenomen door de stamcellen werd gemeten via single-cell magnetophoresis ^{19, 20.}

1. Cultuur menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) volledig mesenchymale stamcellen celkweekmedium (MSCGM) bij 37 ° C en 5% _CO2 tot nabij confluentie (~ 90%).
2. Bereid de magnetische labelingoplossing door mengen 0,1 of 0,2 mM maghemiet-citraat gecoate ijzeroxide (γFe ₂ O _3; kern: 8 nm diameter) in serumvrij McCoy's 5A medium gemodificeerd op Roswell Park Memorial Institute (RMPI) zonder glutamine en met 5 mM natriumcitraat.
3. Gooi het medium, de cellen met serumvrij RPMI-medium te spoelen zonder glutamine en voeg 10 ml ijzeroxide nanodeeltjes oplossing per 150 ^cm2 kweekfles, het minimale volume nodig om alle cellen te bedekken.
4. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% _CO2 en gooi het nanodeeltje oplossing. Spoelen gedurende 5 minuten met serumvrij RPMI medium zonder glutamine de nan internaliserenoparticles nog aan het plasmamembraan.
5. Gooi het RPMI-medium en voeg 25 ml compleet medium per kolf MSCGM. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% _CO2.

3. Magnetic Cell Seeding

1. Vers bereid het chondrogene medium met behulp Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoog glucose met L-glutamine door toevoeging van 50 uM L-ascorbinezuur 2-fosfaat, 0,1 uM dexamethason, 1 mM natriumpyruvaat, 0,35 mM L-proline, 1% universele kweek supplement met insuline, humaan transferrine en seleenzuur (ITS-Premix), en 10 ng / ml transformerende groeifactor-beta 3 (TGF-β3).
2. Maak de cellen met behulp van magnetische 8 ml 0,05% trypsine-EDTA per 150 ^cm2 kweekfles en centrifugeer de gedissocieerde cellen bij 260 xg gedurende 5 minuten. Zuig het medium en tel de opnieuw gesuspendeerde cellen.
3. Plaats een glazen bodem celkweek Petrischaal (35 mm) boven beide magnetische inrichtingen.
4. om magnetically aggregaten vormen, voeg 3 ml chondrogene medium aan de petrischaal en voorzichtig het kleinst mogelijke volume (maximaal 8 pl) met 2,5 x 10 ⁵ gemerkte cellen per aggregaat (maximaal 16 aggregaten worden gestort) deponeren. Laat de petrischaal gedurende 20-30 min zonder verplaatsen, zodat het sferoïden te vormen, en plaats de volledige inrichting, zoals de petrischaal met 16 aggregaten in de incubator bij 37 ° C en 5% _CO2.
5. Formulierbesturingselement aggregaten volgens hetzelfde protocol en vervang het volledige medium met chondrogene medium zonder TGF-β3.
   1. Om de 3D-aggregaat construct te genereren, plaatst 2 aggregaten in contact op dag 8-8 wambuizen vormen en inleiding van de fusie. Op dag 11, samen te voegen 2 doubletten tot 4 vierling te vormen. Tenslotte zekering 4 vierling op dag 15 om de uiteindelijke structuur te verkrijgen.
   2. Tegelijkertijd, vormen aggregaten door centrifugeren 2,5 x 10 ⁵ gelabelde stamcellen 26015; g gedurende 5 min in 15 ml buizen met 1,5 ml chondrogene medium met of zonder TGF-β3 (voor het monster en controle, respectievelijk).
6. Zaad steigers magnetisch, plaatst elke steiger gedroogd in een petrischaal. Gebruik polysaccharide poreuze stellages van pullulan / dextraan ^21. Voor elke steiger verdunnen 2 x 10 ⁶ gemerkte stamcellen in 350 pl chondrogene medium zonder TGF-β3 voorzichtig pipetteren de cellen op de scaffold.
   1. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C te geven volledige cel penetratie in de scaffold en vervolgens voorzichtig 3 ml chondrogene medium toevoegen of zonder TGF-β3 (voor het monster of controle, respectievelijk) naar de petrischaal.
   2. Incubeer de cellularized schavot de magneetinrichting bij 37 ° C en 5% _CO2 gedurende 4 dagen mogelijk te maken celmigratie door het scaffold poriën en insluiting.
7. Tegelijkertijd, zaad steigers met 2 x 10 ⁶ gelabelde stamcellen volgens dezelfde werkwijze en incubeer zonder de magneet gelijkmatig gezaaid steigers als positieve controles krijgen.

4. differentiatie tot chondrocyten

NB: Na 4 dagen incubatie, verwijder de magneten en voortzetting van de chondrogene rijping hetzij in een petrischaal (statische omstandigheden) of in een bioreactor (dynamische omstandigheden). Negatieve controlemonsters worden gerijpt in statische omstandigheden met chondrogene medium zonder TGF-β3.

1. In statische omstandigheden, houden de cellularized steigers of aggregaten in dezelfde petrischaal. Verander het chondrogene medium twee keer per week gedurende 21 dagen.
2. In dynamische omstandigheden, de voorbereiding van de bioreactor.
   1. Gesneden siliconen slang op de juiste lengte volgens het protocol van de fabrikant.
   2. Autoclaaf alle materialen: 500 ml kweekkamer, slangen, 2-weg rotators en kooien.
   3. Plaats de bioreactor onderdelen in een steriele microbiologische veiligheid station. Sluit de slang aan op de 2-weg rotoren en om de cultuur kamer volgens de instructies van de fabrikant.
   4. overdragen cellularized scaffolds voorzichtig in gesteriliseerde kooien met een steriele spatel. Plaats 2 steigers per kooi. Wanneer de kooien zijn bereid, invoegen in de naalden van het deksel te bewegen tijdens verdere rotatie te houden. Vul het kweekkamer met chondrogene medium en sluit het deksel met de kooien.
3. Schakel de peristaltische pomp naar de buis met chondrogene medium te vullen en om luchtbellen te verwijderen.
4. Plaats en zet de gevulde kamer in de motor van de bioreactor en zet de computer, waarbij de rotaties van de beide armen en de kamer regelt.
5. Breng een rotatiesnelheid van 5 omwentelingen per minuut (rpm) aan zowel de arm en de kamer. Stel de peristaltische pomp met een stroomsnelheid van 10 rpm gedurende continue toevoer van de cellularized steigers.

5. RNA-extractie en genexpressieanalyse

OPMERKING: Voorafgaand aan RNA-extractie, verwerken de steigers met een enzymatische oplossing.

1. Bereid 1 ml enzymoplossing door toevoeging van 100 pl pullulanase (40 U / ml) en 50 pl van dextranase (60 mg / ml) aan 850 ml serumvrij DMEM medium.
2. Spoel de steigers tweemaal met serumvrij DMEM medium, gooi het medium en voeg 800 ul van de enzymoplossing per scaffold. Incubeer 15-30 minuten bij 37 ° C onder zacht schudden.
3. Wanneer het skelet volledig is opgelost, breng de oplossing die de cellen aan een 1,5 ml buis, centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min voorzichtig zuig het medium tweemaal spoelen met steriele 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), centrifuge 300 xg gedurende 10 min en resuspendeer de cellen in de RNA-isolatie oplossing.
4. Het RNA van de aggregaten te extraheren, plaatst de sferoïden in het RNA-isolatie oplossing enze volledig verpletteren toepassing van een homogenisator voordat RNA-extractie.
5. Isoleer het RNA met behulp van een kit voor totaal RNA extractie volgens de instructies van de fabrikant.
6. Synthetiseren complementair DNA 400 ng totaal RNA met behulp van reverse transcriptase volgens de instructies van de fabrikant, met behulp van 250 ng willekeurige primers, 1 pl dNTP mix (10 mM elk), en 40 U / ml RNase inhibitor; het eindvolume van 20 pi reactie. Na afloop van de reactie, voeg 80 ul gedistilleerd water tot een eindvolume van 100 ul te verkrijgen.
7. Voor kwantitatieve polymerasekettingreactie (PCR) gebruikt een PCR mengsel dat een fluorescerend reagens om de relatieve expressie van de genen van belang, zoals aggrecan (AGC) en collageen II (Col II) te kwantificeren, waarbij 10 x verdunde cDNA. Normaliseren van de niveaus van genexpressie van de referentie-gen ribosomaal eiwit, Groot, P0 (RPLP0). Voeren berekeningen met 2 ^{- AACt} formule, Waarbij AACt = ACT gedifferentieerde toestand - gemiddelde van ACT controleconditie, en elk OCT vertegenwoordigt de CT van het gen van interesse - de CT van het referentiegen (RPLP0).
8. Bepalen statistische metingen als gemiddelde waarden ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Voer de analyse met n ≥ 2 onafhankelijke experimenten. Met t-toets om de statistische verschillen tussen gecentrifugeerd en pellets magnetische fusies (* p <0,05) geanalyseerd. Bepaal de betekenis van een Kruskal-Wallis test (één parametrische ANOVA) statistische verschillen tussen gedifferentieerde steigers en de besturing stellage (* p <0,05) geanalyseerd.

6. Histologische analyse

1. Spoel de cellularized steigers of aggregaten met steriel 1 x PBS, zet ze in 10% formaline-oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en spoel met 1 x PBS.
2. Verwijder het PBS, sluit de monsters in optimale snG temperatuur verbinding (oktober), en bevriezen per isopentaan bad ondergedompeld in vloeibare stikstof. Bewaar het monster bij -20 ° C. Snijd de monsters met een cryostaat tot 8 urn vriescoupes van de aggregaten of 12 pm voor cellularized steigers te verkrijgen.
3. Vlekken op de cryosecties met 0,5% toluïdineblauw gedurende 2 minuten, spoelen met kraanwater, dehydrateren met 100% ethanol, verduidelijkt met tolueen, en zet de glaasjes met een fixeermiddel voor lichtmicroscopie.

Resultaten

Ten eerste kunnen aggregaten afzonderlijk worden gevormd met behulp van micro-magneten door het neerslaan van 2,5 x 10 ⁵ gelabelde stamcellen (figuur 2A). Deze enkele aggregaten (~ 0,8 mm in grootte) kunnen vervolgens worden gefuseerd tot grotere structuren door sequentiële magnetisch geïnduceerde fusie. Bijvoorbeeld op dag 8 van chondrogene rijping aggregaten in contact in paren wambuizen vormen geplaatst; vierlingen werden verzameld op dag 11 door het samenv...

Discussie

Ten eerste, omdat de hier gepresenteerde technieken vertrouwen op de internalisering van magnetische nanodeeltjes, een belangrijk punt is de uitkomst van de nanodeeltjes als ze eenmaal lokaliseren in de cellen. Weliswaar ijzer nanodeeltjes mogelijke toxiciteit of verminderde differentiatievermogen afhankelijk van hun grootte, bekleding en blootstellingstijd ^{19, 22} kunnen leiden. Toch hebben verschillende studies geen invloed op de cellulaire fysiologie zichtbaar...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3)	PHENIX - University Paris 6	Made and given by C. Ménager	Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge
Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds	LIOAD - University Nantes	Made and given by C. Le Visage	Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2.
TisXell Regeneration System	QuinXell Technologies	QX900-002	Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber
Cage for scaffolds: Histosette II M492	VWR	720-0909
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501	Three independant batches have been used
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL)	Life Technologies	15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
Sodium pyruvate solution 100 mM	Sigma	S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C
TGF-beta 3 protein 10 µg	Interchim	30R-AT028
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranase from Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
NucleoSpin RNA Extraction Kit	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Reverse Transcriptase	Life Technologies	18064-014
Random Primer - Hexamer	Promega	C1181	500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample
Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor	Promega	N2511	40 U/µL: put 1 µL per sample
PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Step One Plus Real-Time PCR System	Life Technologies	4381792
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
OCT solution	VWR	361603E
Isopentane	Sigma	M32631
Toluidine blue O	VWR	1.15930.0025
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Toluene	VWR	1.08323.1000
Mounting medium Pertex	Histolab	840
RPLP0 Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'
Aggrecan Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
Collagen II Primer for qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'