Een functionele evaluatie van de motorische eindplaat (NMJ) kan verschaffen essentiële informatie over de communicatie tussen spieren en zenuwen. Hier beschrijven we een protocol uitvoerig evalueren zowel de spier de NMJ functionaliteit met behulp van twee verschillende spier-zenuw preparaten, d.w.z. soleus-ischialgie en membraan-phrenic.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meten van de motorische eindplaat functionaliteit
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Functionaliteit van de motorische eindplaat (NMJ) speelt een cruciale rol bij de studie van de ziekten waar de communicatie tussen motor neuron en spier met gezichtsstoornissen, zoals veroudering en Amyotrofische laterale sclerose (ALS is). Hier beschrijven we een experimenteel protocol dat kan worden gebruikt voor het meten van NMJ functionaliteit door het combineren van twee soorten elektrische stimulatie: directe spierstimulatie membraan en de stimulatie door middel van de zenuw. De vergelijking van de spier reactie op deze twee verschillende stimulaties kunnen worden gedefinieerd, op het functionele niveau, mogelijke veranderingen in de NMJ die tot daling van de functionele in spier leiden.
Ex vivo preparaten zijn geschikt voor goed gecontroleerde studies. Hier beschrijven we een intensieve protocol voor het meten van verschillende parameters van spier- en NMJ functionaliteit voor de soleus-ischialgie zenuw voorbereiding alsmede voor de bereiding van de membraan-phrenic zenuw. Het protocol duurt ongeveer 60 minuten en onafgebroken wordt uitgevoerd door middel van een op maat gemaakte software die de kramp kinetiek eigenschappen, de relatie van de kracht-frequentie voor zowel spieren en zenuw stimulaties en twee parameters specifiek voor NMJ functionaliteit, d.w.z. transmissie storing en intratetanic vermoeidheid meet. Deze methode werd gebruikt voor het detecteren van schade in de soleus en het middenrif spier-zenuw preparaten met behulp van SOD1G93A transgene muis, een experimenteel model van ALS dat overal overexpresses de mutant anti-oxidant enzym superoxide dismutase 1 (SOD1).
Inleiding
De motorische eindplaat (NMJ) is een chemische synapse gevormd door de verbinding tussen de motorische eindplaat van de spiervezel en de motor neuron axon terminal. De NMJ heeft aangetoond dat een cruciale rol spelen bij communicatie tussen spieren en zenuwen aangetast is, zoals gebeurt in veroudering of Amyotrofische laterale sclerose (ALS). Zoals spieren en zenuwen in een bidirectionele manier1,2 communiceren, zijnde kundig voor meten NMJ gebreken los van spier gebreken kunnen nieuwe inzichten in hun pathofysiologische samenspel. Inderdaad, deze functionele evaluatie kan helpen om te beoordelen of morfologische of biochemische veranderingen verminderen transmissie signalering van functionaliteit.
De vergelijking van spier contractiele reactie ontlokte door zenuwstimulatie en de reactie van de dezelfde spier opgeroepen door directe stimulatie van het membraan is voorgesteld als een indirecte meting van NMJ functionaliteit. Inderdaad, sinds membraan stimulatie door-pasjes transmissie signalering, eventuele verschillen in de twee contractiele reacties kunnen worden toegeschreven aan veranderingen in de NMJ. Deze aanpak is uitgebreid voorgesteld voor ratten3,4,5,6,7, en ook gebruikt om informatie te verzamelen over muis modellen8,9,10,11,12.
Hier beschrijven we in detail een procedure voor accijnzen en testen van twee spier-zenuw preparaten, d. w. z. de soleus-ischialgie en membraan-phrenic voorbereidingen. Met behulp van een op maat gemaakte software, we ontwierpen een continu testen protocol dat combineert de meting van de verschillende parameters die kenmerkend zijn voor zowel NMJ en spier-functionaliteit, waardoor opbrengst een uitgebreide evaluatie van NMJ schade apart van die van de spier. Met name meet het protocol de twitch force, de kinetiek van de spier, de kracht-frequentie curve voor directe en zenuw stimulaties, de transmissie storing13 voor zowel een afvuren en de tetanic frequenties en de intratetanic vermoeidheid7.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de Sapienza Universiteit van Rome-Unit of Histology and Medical Embryology en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de huidige versie van de Italiaanse wet betreffende de bescherming van dieren.
1. Experimentele opstelling
- Stel het experimentele systeem in, bestaande uit 1 actuator/transducer, 2 stimulatoren, 1 in-vitro spierapparaat, 1 preparatiebad, 1 zuigelektrode, 1 digitale oscilloscoop, 1 stereomicroscoop, 1 koudlichtverlichtingssysteem, 1 acquisitiekaart, 1 aansluitblok en een persoonlijke computer.
OPMERKING: De aansturingssoftware is hier geprogrammeerd in LabView en is ontworpen om een hoge flexibiliteit, nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de stimulaties te garanderen. Voor elke stimulatie kan de gebruiker de pulsbreedte, frequentie en duur selecteren, en bepalen of deze aan het membraan of via de zenuw wordt toegediend. De gebruiker kan ook de lengte van de rustperiode voor elke stimulatie selecteren.
2. Evaluaties van de contractiele eigenschappen van de NMJ van de soleus- en diafragmaspieren
- Opwarmen van het systeem
- Bereid de Krebs-Ringer-buffer voor14 en plaats deze in een bad van het montageapparaat en in het voorbereidingsbad voor weefsel. Plaats een schaal van 60 mm, voorbereid met 4 ml siliconen, in het voorbereidingsbad voor weefsel.
- Schakel het circulerende waterbad in en stel de temperatuur in op 30 °C voor de soleusspier en op 27 °C voor de diafragmaspier.
- Laat een mengsel van 95% O2 - 5% CO2 in beide baden stromen.
- Schakel de actuator/transducer en de twee pulsstimulatoren in en stel de stroomwaarden in op 300 mA voor membraanstimulatie en op 5 mA voor zenuwstimulatie.
OPMERKING: Er is eerder aangetoond dat een stroomwaarde van 300 mA geen significante contractie van de zenuwtakken induceert wanneer D-tubocurarine aan de oplossing wordt toegevoegd15. De stroomwaarde van 5 mA komt overeen met de hoeveelheid stroom die nodig is om de spier via de zenuw te stimuleren zonder overlap te creëren met de membraanstimulatie die via de oplossing wordt geïnduceerd. Aangezien de afstand tussen de zuigelektrode en de spier afhankelijk is van de zenuwlengte, moet deze stroomwaarde vóór elk experiment zorgvuldig worden afgesteld, zoals hieronder beschreven.
- Dissectie van soleus en diafragma
- Offer de muis op door middel van cervicale dislocatie om lijden te minimaliseren en exciseer onmiddellijk de spieren voor testen als volgt.
- Soleus-ischiadicus preparatie, dissectie en opstelling
- Sproei 70% ethanol op het muizenpoot en verwijder de huid die het poot bedekt. Maak met een schaar een incisie in het bovenste deel van het poot en trek vervolgens de huid stevig weg. Isoleer de achillespees van de tibia en knip vervolgens de achillespees door met een schaar.
- Klem de pees stevig vast met een pincet en trek voorzichtig de m. gastrocnemius samen met de m. soleus weg. Zodra de proximale pees van de soleus is blootgelegd, knipt u het gehele kuitgedeelte door met een schaar, terwijl u de achillespees vasthoudt. Plaats het weefselmonster onmiddellijk in het voorbereidingsbad voor weefsel.
- Plaats het voorbereidingsbad onder de stereomicroscoop en fixeer het kuitgedeelte aan de siliconenschaal met roestvrijstalen pennen met een diameter van 0,20 mm. Klem de proximale pees van de soleus met een pincet vast en trek deze voorzichtig weg om de ischiadische innervatie bloot te leggen.
- Zodra de innervatie is blootgelegd (Figuur 1), verwijdert u voorzichtig het omringende weefsel om ongeveer 5 mm van de zenuw bloot te leggen. Gebruik een fijne schaar om de zenuw door te knippen. Terwijl de soleus stevig op de proximale pees wordt vastgeklemd met een pincet, trekt u deze opnieuw weg en exciseert u deze door de achillespees met een schaar door te knippen.
- Haal een nylon draad door het gat van de hefboomarm van de actuator/transducer. Maak een lus aan het uiteinde van de draad en pak de achillespees vast voordat u de draad terugtrekt totdat de spier het bad van het montageapparaat bereikt. Klem de proximale pees vast in de vaste klem en bind de nylon draad rond de hefboomarm. Laat de spier equilibreren in de oplossing.
- Bepaal de initiële optimale lengte (L0).
- Rek eerst de spier uit om deze voor te belasten op 10 mN (deze waarde garandeert op basis van ervaring de maximale twitchkracht). Rek vervolgens de spier voorzichtig verder om de voorbelasting te wijzigen en stimuleer deze met een reeks enkelvoudige pulsen. De optimale lengte is bereikt wanneer de maximale twitchkracht wordt gemeten.
- Diafragma-phrenicus preparatie, dissectie en opstelling
- Sproei 70% ethanol op de huid van de muis. Verwijder de huid die de diafragmaspier bedekt door met een schaar een incisie over het sternum te maken en de huid stevig weg te trekken.
- Knip met een schaar de buik horizontaal onder het sternum door en verwijder voorzichtig de darmen en organen met een pincet. Gebruik een dikke schaar om de wervelkolom door te knippen.
- Knip de ribben ongeveer 1 cm boven het sternum door en ga horizontaal te werk. Verwijder voorzichtig de buitenste organen met een pincet en knip de wervelkolom door om een cirkelvormige ring van ribben te verkrijgen die het diafragma bevat.
- Was de preparatie in een schaal met Krebs-Ringer-buffer en plaats deze vervolgens in de siliconenschaal in het voorbereidingsbad voor weefsel, met de bovenkant naar boven en het sternum naar voren gericht.
- Verwijder met behulp van de stereomicroscoop voorzichtig de longen en de resterende organen; de nervus phrenicus zal aan de rechterkant zichtbaar zijn (Figuur 2A).
- Trim de ribben zodat er een ring van ongeveer 2 mm overblijft langs het gehele diafragma.
- Fixeer met een pincet één roestvrijstalen pen met een diameter van 0,20 mm op de centrale pees van het diafragma op het punt dat overeenkomt met de phrenicus-innervatie, en een andere pen op de ribben op dezelfde as om de betreffende diafragmastrook te identificeren.
- Fixeer twee extra pennen op de centrale pees en nog eens twee pennen op de ribben aan weerszijden van de geselecteerde strook om het diafragma uit te leggen. Maak de nervus phrenicus indien nodig schoon van het omringende bindweefsel met een pincet.
- Knip het diafragma met een gebogen mesje aan weerszijden van de innervatie door om een pees-spier-rib strook te verkrijgen, zoals getoond in Figuur 2B.
- Haal een nylon draad door het gat van de hefboomarm van de actuator/transducer. Maak een lus aan het uiteinde van de draad en pak de pees vast voordat u de draad terugtrekt totdat de spier het bad van het montageapparaat bereikt.
- Klem de ribben vast in de vaste klem en bind de nylon draad rond de hefboomarm.
- Laat de spier equilibreren in de oplossing en bepaal de initiële optimale lengte (L0).
- Rek de spier uit om deze voor te belasten op 5 mN. Rek de spier voorzichtig verder om de voorbelasting te wijzigen en stimuleer deze met een reeks enkelvoudige pulsen. De optimale lengte is bereikt wanneer de maximale twitchkracht wordt gemeten.
Figuur 1 - Soleus-nervus ischiadicus-preparaat. Soleus-nervus ischiadicus tijdens de chirurgische operatie voor de functionele tests. De nervus ischiadicus wordt blootgelegd met een pincet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 - Preparaat van het diafragma-nervus phrenicus. De afbeelding toont een fase van de excisie van het diafragma-nervus phrenicus preparaat (A) en de strip die gemonteerd moet worden voor functionele tests (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- NMJ-eigenschappen afzonderlijk van spiercontractiliteit meten
- Stel de optimale stroomintensiteit in voor de stimulatie via de zenuw en verifieer dat de stroompulsen die via de zuigelektrode worden afgegeven geen spiercontractie veroorzaken door stroomspreiding in het bad.
- Plaats de zuigelektrode nabij de spier en trek de zenuw naar binnen. Stimuleer de spier met een reeks enkelvoudige pulsen terwijl de stroomintensiteit voorzichtig wordt verhoogd (beginnend bij 5 mA). De optimale stroomwaarde is bepaald wanneer de twitchkracht maximaal is.
- Duw de zenuw uit de elektrode en geef enkele enkelvoudige pulsen af. Zorg ervoor dat de spier niet samentrekt door overlap met de membraanstimulatie via de oplossing. Trek de zenuw opnieuw naar binnen.
- Start het programma en selecteer het invoerbestand om het gewenste testprotocol uit te voeren.
OPMERKING: Het invoerbestand bevat alle stimulatieparameters die nodig zijn om het volledige protocol uit te voeren. Hoewel dezelfde protocolstructuur wordt gebruikt voor de twee spieren, verschillen de stimulatieparameters afhankelijk van of het protocol betrekking heeft op de soleus- of diafragmaspieren.- Soleus-nervus ischiadicus stimulatie (zie Tabel 1)
- Gebruik de volgende pulsbreedtes voor alle elektrische stimulaties: 1.4 ms voor stimulatie van de nervus ischiadicus en 0.1 ms voor directe soleusstimulatie. Het volledige protocol duurt ongeveer 65 min.
- Diafragma-nervus phrenicus stimulatie (zie Tabel 2)
- Gebruik de volgende pulsbreedtes voor alle elektrische stimulaties: 1.8 ms voor stimulatie van de nervus phrenicus en 0.2 ms voor directe diafragmastimulatie. Het volledige protocol duurt ongeveer 55 min.
- Meet aan het einde van het experimentele protocol de lengte en het natte gewicht van de spier met respectievelijk een analoge schuifmaat met een nauwkeurigheid van 0.05 mm en een precisieweegschaal met een nauwkeurigheid van 0.1 mg.
- Bereken de dwarsdoorsnede (CSA) door de spiermassa te delen door het product van de optimale vezellengte (Lf) en de dichtheid van skeletspierweefsel van zoogdieren (1.06 mg/mm3)16.
OPMERKING: Lf wordt verkregen door L0 te vermenigvuldigen met de verhouding vezellengte/spierlengte (0.71 voor de soleusspier16 en 1 voor de diafragmaspier17).
- Bereken de dwarsdoorsnede (CSA) door de spiermassa te delen door het product van de optimale vezellengte (Lf) en de dichtheid van skeletspierweefsel van zoogdieren (1.06 mg/mm3)16.
- Soleus-nervus ischiadicus stimulatie (zie Tabel 1)
- Stel de optimale stroomintensiteit in voor de stimulatie via de zenuw en verifieer dat de stroompulsen die via de zuigelektrode worden afgegeven geen spiercontractie veroorzaken door stroomspreiding in het bad.
| Type experiment | Frequentie | Duur | Herhalingen | Spiers- of zenuwstimulatie | Doel |
| (Hz) | (s) | ||||
| Twitch | Enkelvoudige puls | 1 | Spier | Twitchkracht en kinetiek | |
| Rust | 30 | ||||
| Twitch | Enkelvoudige puls | 1 | Zenuw | ||
| Rust | 30 | ||||
| Twitch | Enkelvoudige puls | 1 | Spier | ||
| Rust | 30 | ||||
| Twitch | Enkelvoudige puls | 1 | Zenuw | ||
| Rust | 120 | ||||
| Niet-gefuseerde tetanus | 40 | 0.8 | 1 | Zenuw | Kracht-frequentiecurves voor zenuw- en spierstimulaties |
| Rust | 180 | ||||
| Niet-gefuseerde tetanus | 60 | 0.8 | 1 | Spier | |
| Rust | 180 | ||||
| Gefuseerde tetanus | 80 | 0.8 | 1 | Zenuw | |
| Rust | 180 | ||||
| Niet-gefuseerde tetanus | 20 | 0.8 | 1 | Spier | |
| Rust | 180 | ||||
| Niet-gefuseerde tetanus | 60 | 0.8 | 1 | Zenuw | |
| Rust | 180 | ||||
| Gefuseerde tetanus | 80 | 0.8 | 1 | Spier | |
| Rust | 180 | ||||
| Niet-gefuseerde tetanus | 20 | 0.8 | 1 | Zenuw | |
| Rust | 180 | ||||
| Niet-gefuseerde tetanus | 40 | 0.8 | 1 | Spier | |
| Rust | 300 | ||||
| Vermoeidheidsparadigma | 35 | 0.8 | 1 spierstimulatie gevolgd door 14 zenuwstimulaties met telkens een rusttijd van 1.2 s, 20 keer herhaald | Falen van neurotransmissie (NF) | |
| Rust | 900 | ||||
| Vermoeidheidsparadigma | 80 | 0.8 | 1 spierstimulatie gevolgd door 14 zenuwstimulaties met telkens een rusttijd van 1.2 s, 20 keer herhaald | Falen van neurotransmissie (NF) en intratetanische vermoeidheid (IF) | |
Tabel 1 - Protocol voor stimulatie van de mus soleus en nervus ischiadicus. De tabel vermeldt de opeenvolging van tests die het volledige protocol vormen voor het testen van preparaten van de mus soleus en nervus ischiadicus.
| Type experiment | Frequentie | Duur | Herhalingen | Spier- of zenuwstimulatie | Doel |
| (Hz) | (s) | ||||
| Twitch | Enkele puls | 1 | Spier | Twitchkracht en kinetiek | |
| Rust | 30 | ||||
| Twitch | Enkele puls | 1 | Zenuw | ||
| Rust | 30 | ||||
| Twitch | Enkele puls | 1 | Spier | ||
| Rust | 30 | ||||
| Twitch | Enkele puls | 1 | Zenuw | ||
| Rust | 120 | ||||
| Onvolledige tetanus | 60 | 0.5 | 1 | Zenuw | Kracht/frequentiecurves voor zenuw- en spierstimulaties |
| Rust | 120 | ||||
| Volledige tetanus | 100 | 0.5 | 1 | Spier | |
| Rust | 180 | ||||
| Onvolledige tetanus | 40 | 0.5 | 1 | Zenuw | |
| Rust | 120 | ||||
| Onvolledige tetanus | 20 | 0.5 | 1 | Spier | |
| Rust | 120 | ||||
| Onvolledige tetanus | 80 | 0.5 | 1 | Zenuw | |
| Rust | 150 | ||||
| Onvolledige tetanus | 80 | 0.5 | 1 | Spier | |
| Rust | 150 | ||||
| Onvolledige tetanus | 20 | 0.5 | 1 | Zenuw | |
| Rust | 120 | ||||
| Volledige tetanus | 100 | 0.5 | 1 | Spier | |
| Rust | 150 | ||||
| Volledige tetanus | 100 | 0.5 | 1 | Zenuw | |
| Rust | 180 | ||||
| Onvolledige tetanus | 60 | 0.5 | 1 | Spier | |
| Rust | 300 | ||||
| Vermoeidheidsprotocol | 35 | 0.33 | 1 spierstimulatie gevolgd door 14 zenuwstimulaties met telkens een rusttijd van 0.67 s, 20 keer herhaald | Falen van de neurotransmissie (NF) | |
| Rust | 900 | ||||
| Vermoeidheidsprotocol | 80 | 0.33 | 1 spierstimulatie gevolgd door 14 zenuwstimulaties met telkens een rusttijd van 0.67 s, 20 keer herhaald | Falen van de neurotransmissie (NF) en intratetanische vermoeidheid (IF) | |
Tabel 2 - Protocol voor stimulatie van het diafragma en de nervus phrenicus. De tabel bevat de reeks tests die het volledige protocol vormen voor het testen van preparaties van het diafragma en de nervus phrenicus.
3. Data-analyse
OPMERKING: Bereken aan het einde van het protocol alle gewenste parameters als volgt.
- Vanuit enkelvoudige pulsstimulatie
- Bereken de twitchkracht (mN; maximale actieve kracht gegenereerd tijdens de twitch) en de specifieke twitchkracht (mN/mm2). Bereken dit door de initiële preloadwaarde af te trekken van de maximale door de spier gegenereerde kracht. Bereken de specifieke twitchkracht als de twitchkracht gedeeld door de CSA van de spier.
- Bereken de tijd tot maximale spanning (TTP) (ms) als de tijd vanaf het vrijgeven van de puls tot de twitchkracht.
- Bereken de halve relaxatietijd (1/2RT) (ms) als de tijd vanaf de twitchkracht tot 50% van de twitchkracht.
- Bereken dF/dt (mN/ms) als de maximale waarde van de krachtafgeleide tijdens de contractiefase.
- Bereken -dF/dt (mN/ms) als de maximale waarde van de krachtafgeleide tijdens de relaxatiefase.
- Vanuit pulstreinstimulaties
- Bereken de ongefuseerde kracht (mN) en de specifieke ongefuseerde kracht (mN/mm2). Bereken dit door de initiële preloadwaarde af te trekken van de maximale door de spier gegenereerde kracht. Bereken de specifieke ongefuseerde kracht als de ongefuseerde kracht gedeeld door de CSA van de spier.
OPMERKING: De ongefuseerde kracht is de maximale actieve kracht die wordt gegenereerd tijdens een pulstrein met een frequentie die lager is dan de tetanische frequentie. - Bereken de tetanische kracht (mN) en de specifieke tetanische kracht (mN/mm2); de maximale kracht is de maximale actieve kracht die wordt gegenereerd tijdens een pulstrein afgegeven op tetanische frequentie. Bereken dit door de initiële preloadwaarde af te trekken van de maximale door de spier gegenereerde kracht. Bereken de specifieke tetanische kracht als de tetanische kracht gedeeld door de CSA van de spier.
- Stel de kracht-frequentiecurve op. Zet de waarde van de kracht (of specifieke kracht) verkregen voor elke stimulatie uit tegen de toenemende stimulatiefrequentie. Normaal gesproken begint dit met de enkelvoudige pulsstimulatie en eindigt dit bij de tetanische frequentie.
- Bereken de ongefuseerde kracht (mN) en de specifieke ongefuseerde kracht (mN/mm2). Bereken dit door de initiële preloadwaarde af te trekken van de maximale door de spier gegenereerde kracht. Bereken de specifieke ongefuseerde kracht als de ongefuseerde kracht gedeeld door de CSA van de spier.
- Vanuit vermoeidheidsparadigma's
- Bereken het falen van de neurotransmissie (NF) als:
waarbij MF de afname van de kracht is na spierstimulatie en F de afname van de kracht is na zenuwstimulatie, gemeten bij de eerste pulstrein na spierstimulatie. - Bereken de intratetanische vermoeidheid (IF) als:
waarbij Flp de kracht is die door de spier wordt gegenereerd bij de laatste stimulatiepuls, en Fm de maximale kracht is die door de spier wordt gegenereerd tijdens dezelfde pulstrein. Wat betreft de zenuwstimulatie: bereken de intratetanische vermoeidheid bij de eerste pulstrein direct na de directe stimulatie.
- Bereken het falen van de neurotransmissie (NF) als:
4. Statistische analyse
OPMERKING: De statistische analysemodellen moeten worden gekozen op basis van of de spierrespons op zowel zenuw- als membraanstimulaties wordt vergeleken binnen hetzelfde diermodel of tussen 2 verschillende diermodellen18,19.
- Gebruik de Student's t-toets voor TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt indien u enkel spierresponsen op directe en indirecte stimulaties vergelijkt. Indien u spierpreparaten vergelijkt die zijn verkregen van 2 verschillende muisstammen, gebruik dan een 2-weg ANOVA met stimulatietype en muisstam als vaste factoren. Wanneer de 2-weg ANOVA een significant resultaat geeft, gebruik dan meervoudige vergelijkingstesten om statistische verschillen op te sporen.
- Voor de kracht-frequentiecurve (indien u enkel spierresponsen op directe en indirecte stimulaties vergelijkt), gebruik een 2-weg ANOVA met stimulatietype en stimulatiefrequentie als vaste factoren. Gebruik indien nodig meervoudige vergelijkingstesten.
- Indien u spierpreparaten vergelijkt die zijn verkregen van 2 verschillende muisstammen, gebruik dan een 3-weg ANOVA met stimulatietype, stimulatiefrequentie en muisstam als vaste factoren.
- Wanneer de 3-weg ANOVA een significant effect geeft van de factoren dierstam en stimulatietype, gebruik dan een 2-weg ANOVA om significante verschillen tussen telkens 2 groepen te identificeren. Zo kunnen bijvoorbeeld verschillen worden beoordeeld tussen de spierrespons van de 2 groepen op membraanstimulatie, of tussen de spierrespons op directe en indirecte stimulaties binnen één groep.
- Indien u spierpreparaten vergelijkt die zijn verkregen van 2 verschillende muisstammen, gebruik dan een 3-weg ANOVA met stimulatietype, stimulatiefrequentie en muisstam als vaste factoren.
- Intratetanische vermoeidheid
OPMERKING: Aangezien het protocol is ontworpen om vermoeidheid op te wekken als reactie op zenuwstimulatie, zelfs bij controlemuizen, kan deze parameter alleen worden gebruikt om verschillen tussen 2 muisstammen te onderzoeken; een statistische analyse binnen een enkele groep zou altijd significante verschillen opleveren.- Om twee groepen te vergelijken, gebruik een 3-weg ANOVA met stimulatietype, tijd en muisstam als vaste factoren. Wanneer de 3-weg ANOVA een significant effect geeft van de factoren dierstam en stimulatietype, gebruik dan een 2-weg ANOVA om significante verschillen tussen telkens 2 groepen te identificeren, zoals bij de kracht-frequentiecurve.
- Voor falen van de neurotransmissie, gebruik een 2-weg ANOVA met dierstam en tijd als vaste factoren. Indien dit significante resultaten geeft, gebruik dan meervoudige vergelijkingstesten om statistische verschillen op te sporen.
OPMERKING: Aangezien deze parameter slechts één waarde per muisstam oplevert, kunnen verschillende muismodellen hiermee worden vergeleken. - Voor spiergewicht, lengte en CSA, gebruik de Student's t-toets om verschillen te onderzoeken bij het vergelijken van spier-zenuwpreparaten van verschillende diermodellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het protocol we beschreven informatie over functionele denervation in verschillende neuromusculaire ziekten of veroudering-sarcopenie. Dit protocol kan worden gebruikt om te bepalen of (en zo ja, op welk niveau) spier veranderingen zijn te wijten aan selectief veranderingen die zich in de spier zelf of in de neuromusculaire transmissie voordoen. De gegevens hieronder zijn de resultaten van een eerdere werk van onze groep18, uitgevoerd op het SOD1G93A tra...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het experimentele protocol hierboven beschreven biedt een ideale manier van meten en discriminerende functionele wijzigingen die hebben plaatsgevonden in de spier direct of niet indirect op het niveau van de motorische eindplaat. Aangezien deze techniek is gebaseerd op een indirecte meting van NMJ functionaliteit, kan het niet worden gebruikt om vast te stellen als een defect is gerelateerd aan morfologische veranderingen of aan biochemische veranderingen. Daarentegen biedt het een effectieve manier om te bepalen of wijz...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Werk in de auteurs laboratorium werd gesteund door de Fondazione Roma en Telethon (verlenen neen. GGP14066).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | puls stimulator (zenuw) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | puls stimulator (spier) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | met een zelfgemaakte referentie |
| Oscilloscoop | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscoop | Nikon | SMZ 800 | |
| Koude lichtverlichting | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisitiekaart | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connectorblok | National Instruments | NI 2110 | |
| Persoonlijke computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz met Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonaat Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | fysiologische buffer |
| Natriumbicarbonaat | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calciumchloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | watervrij, poeder, ≥97% |
| HEPES-buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99,5% (titratie) |
| Schalen 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyreen |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostaat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pomp | Newa Mini | MN 606 | voor aquarium |
| Hittebestendige Thermokabel | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Emmer | elke 10 liter | Polypropyleen | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Menggas | |
| #5 Pincet | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | zenunextcisie |
| Scherpe schaar | Fine Science Tools | 14059-11 | spierverwijdering |
| Fijne schaar | Wagner | 02.06.32 | extern van het dier |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Nylondraad Ø0.16 mm | elke |
Referenties
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
