Methodenartikel

Meten van de motorische eindplaat functionaliteit

DOI:

10.3791/55227

⸱

6 augustus 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Sapienza University of Rome, 2Institute Pasteur Cenci-Bolognetti, DAHFMO-Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een functionele evaluatie van de motorische eindplaat (NMJ) kan verschaffen essentiële informatie over de communicatie tussen spieren en zenuwen. Hier beschrijven we een protocol uitvoerig evalueren zowel de spier de NMJ functionaliteit met behulp van twee verschillende spier-zenuw preparaten, d.w.z. soleus-ischialgie en membraan-phrenic.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Functionaliteit van de motorische eindplaat (NMJ) speelt een cruciale rol bij de studie van de ziekten waar de communicatie tussen motor neuron en spier met gezichtsstoornissen, zoals veroudering en Amyotrofische laterale sclerose (ALS is). Hier beschrijven we een experimenteel protocol dat kan worden gebruikt voor het meten van NMJ functionaliteit door het combineren van twee soorten elektrische stimulatie: directe spierstimulatie membraan en de stimulatie door middel van de zenuw. De vergelijking van de spier reactie op deze twee verschillende stimulaties kunnen worden gedefinieerd, op het functionele niveau, mogelijke veranderingen in de NMJ die tot daling van de functionele in spier leiden.

Ex vivo preparaten zijn geschikt voor goed gecontroleerde studies. Hier beschrijven we een intensieve protocol voor het meten van verschillende parameters van spier- en NMJ functionaliteit voor de soleus-ischialgie zenuw voorbereiding alsmede voor de bereiding van de membraan-phrenic zenuw. Het protocol duurt ongeveer 60 minuten en onafgebroken wordt uitgevoerd door middel van een op maat gemaakte software die de kramp kinetiek eigenschappen, de relatie van de kracht-frequentie voor zowel spieren en zenuw stimulaties en twee parameters specifiek voor NMJ functionaliteit, d.w.z. transmissie storing en intratetanic vermoeidheid meet. Deze methode werd gebruikt voor het detecteren van schade in de soleus en het middenrif spier-zenuw preparaten met behulp van SOD1G93A transgene muis, een experimenteel model van ALS dat overal overexpresses de mutant anti-oxidant enzym superoxide dismutase 1 (SOD1).

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De motorische eindplaat (NMJ) is een chemische synapse gevormd door de verbinding tussen de motorische eindplaat van de spiervezel en de motor neuron axon terminal. De NMJ heeft aangetoond dat een cruciale rol spelen bij communicatie tussen spieren en zenuwen aangetast is, zoals gebeurt in veroudering of Amyotrofische laterale sclerose (ALS). Zoals spieren en zenuwen in een bidirectionele manier1,2 communiceren, zijnde kundig voor meten NMJ gebreken los van spier gebreken kunnen nieuwe inzichten in hun pathofysiologische samenspel. Inderdaad, deze functionele evaluatie kan helpen om te beoordelen of morfologische of biochemische veranderingen verminderen transmissie signalering van functionaliteit.

De vergelijking van spier contractiele reactie ontlokte door zenuwstimulatie en de reactie van de dezelfde spier opgeroepen door directe stimulatie van het membraan is voorgesteld als een indirecte meting van NMJ functionaliteit. Inderdaad, sinds membraan stimulatie door-pasjes transmissie signalering, eventuele verschillen in de twee contractiele reacties kunnen worden toegeschreven aan veranderingen in de NMJ. Deze aanpak is uitgebreid voorgesteld voor ratten3,4,5,6,7, en ook gebruikt om informatie te verzamelen over muis modellen8,9,10,11,12.

Hier beschrijven we in detail een procedure voor accijnzen en testen van twee spier-zenuw preparaten, d. w. z. de soleus-ischialgie en membraan-phrenic voorbereidingen. Met behulp van een op maat gemaakte software, we ontwierpen een continu testen protocol dat combineert de meting van de verschillende parameters die kenmerkend zijn voor zowel NMJ en spier-functionaliteit, waardoor opbrengst een uitgebreide evaluatie van NMJ schade apart van die van de spier. Met name meet het protocol de twitch force, de kinetiek van de spier, de kracht-frequentie curve voor directe en zenuw stimulaties, de transmissie storing13 voor zowel een afvuren en de tetanic frequenties en de intratetanic vermoeidheid7.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het ethische comité van Sapienza University of Rome-Unit of Histology and Medical Embryology en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de huidige versie van de Italiaanse wet op de bescherming van dieren.

1. Experimentele opstelling

  1. Stel het experimentele systeem op, bestaande uit 1 actuator/transducer, 2 stimulators, 1 in-vitro spierapparaat, 1 voorbereidend weefselbad, 1 zuigelektrode, 1 digitaal oscilloscoop, 1 stereomicroscoop, 1 koude lichtverlichter, 1 acquisitiekaart, 1 connectorblok en een personal computer.
    OPMERKING: Hier werd de opdrachtsoftware geprogrammeerd in LabView en is ontworpen om hoge flexibiliteit, nauwkeurigheid en herhaalbaarheid van de stimulaties te garanderen. Voor elke stimulatie kan de gebruiker de pulsbreedte, frequentie, duur selecteren en beslissen of deze wordt afgegeven aan het membraan of via de zenuw. De gebruiker kan ook de lengte van de rustperiode voorafgaand aan elke stimulatie selecteren.

2. Evaluatie van de NMJ-contractiele eigenschappen van soleus- en diafragmaspieren

  1. Systeem opwarmen
    1. Bereid de Krebs Ringer-buffer14 voor en plaats deze in een bad van het montageapparaat en het voorbereidende weefselbad. Plaats een 60 mm schaal voorbereid met 4 ml siliconen in het voorbereidende weefselbad.
    2. Zet het circulaterende waterbad aan en stel de temperatuur in op 30 °C voor de soleusspier en op 27 °C voor de diafragmaspier.
    3. Laat 95% O2 - 5% CO2 mengsel in beide baden stromen.
    4. Zet de actuator/transducer en de twee pulsstimulators aan en stel de stroomwaarden in op 300 mA voor membraanstimulatie en op 5 mA voor zenuwstimulatie.
      OPMERKING: De stroomwaarde van 300 mA is eerder aangetoond om geen significante contractie op de zenuwtakken te induceren wanneer D-tubocurarine aan de oplossing wordt toegevoegd15. De stroomwaarde van 5 mA komt overeen met de hoeveelheid stroom die nodig is om de spier via de zenuw te stimuleren zonder overlapping te creëren met de door de oplossing geïnduceerde membraanstimulatie. Aangezien de afstand tussen de zuigelektrode en de spier afhankelijk is van de zenuwlengte, moet deze stroomwaarde voor elk experiment zorgvuldig worden aangepast, zoals hieronder wordt beschreven.
  2. Dissectie van de soleus en diafragma
    1. Offer de muis aan door cervicale dislocatie om het lijden te minimaliseren en verwijder onmiddellijk de spieren voor het testen zoals hieronder beschreven.
    2. Soleus-sciatic voorbereiding, dissectie en opstelling
      1. Spuit 70% ethanol op de muizenpoot en verwijder de huid die de poot bedekt. Maak een incisie in het bovenste deel van de poot met een schaar en trek vervolgens de huid stevig. Isoleer de achillespees van de scheenbeen en snijd vervolgens de achillespees door met een schaar.
      2. Klem de pees stevig vast met een tang en trek voorzichtig de gastrocnemiusspier samen met de soleus. Zodra de proximale pees van de soleus is blootgelegd, snijdt u het hele kalf door met een schaar terwijl u nog steeds de achillespees vasthoudt. Plaats het weefselmonster onmiddellijk in het voorbereidende weefselbad.
      3. Plaats het voorbereidende bad onder de stereomicroscoop en bevestig het kalf aan de siliconenschaal met behulp van roestvrijstalen pennen met een diameter van 0,20 mm. Klem met een tang de proximale pees van de soleus vast en trek er voorzichtig aan om de sciatische innervatie bloot te leggen.
      4. Zodra de innervatie is blootgelegd (Figuur 1), verwijder voorzichtig het omringende weefsel om ongeveer 5 mm van de zenuw bloot te leggen. Gebruik een fijne schaar om de zenuw door te snijden. Terwijl u de soleus stevig op de proximale pees klemt met een tang, trekt u er opnieuw aan en snijdt u deze door het snijden van de achillespees met een schaar.
      5. Leid een nylondraad door het gat van de hefbomenarm van de actuator/transducer. Maak een lus aan het einde van de draad en grijp de achillespees voordat u de draad terugtrekt totdat de spier het bad van het montageapparaat bereikt. Klem de proximale pees vast in de vaste klem en zet de nylondraad om de hefbomenarm. Laat de spier in evenwicht komen in de oplossing.
      6. Bepaal de initiële optimale lengte (L0).
        1. Rek de spier eerst uit om deze voor te laden met 10 mN (deze waarde garandeert de maximale twitch-kracht (gebaseerd op ervaring)). Trek vervolgens voorzichtig aan de spier om de voorbelasting te veranderen en stimuleer deze met een reeks enkele pulsen. De optimale lengte is bereikt wanneer de maximale twitch-kracht wordt gemeten.
    3. Diafragma-frenische voorbereiding, dissectie en opstelling
      1. Spuit 70% ethanol op de muizenhuid. Verwijder de huid die de diafragmaspier bedekt door een incisie boven het borstbeen te maken met een schaar en door de huid stevig te trekken.
      2. Snijd met een schaar de buik horizontaal onder het borstbeen door en verwijder voorzichtig de darm en de organen met een tang. Gebruik een paar dikke schaar om de ruggengraat door te snijden.
      3. Snijd de ribben ongeveer 1 cm boven het borstbeen door en ga horizontaal verder. Verwijder voorzichtig de buitenste organen met een tang en snijd de ruggengraat door om een ​​cirkelvormige ring ribben te verkrijgen die het diafragma bevatten.
      4. Was de voorbereiding in een schaal met

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol we beschreven informatie over functionele denervation in verschillende neuromusculaire ziekten of veroudering-sarcopenie. Dit protocol kan worden gebruikt om te bepalen of (en zo ja, op welk niveau) spier veranderingen zijn te wijten aan selectief veranderingen die zich in de spier zelf of in de neuromusculaire transmissie voordoen. De gegevens hieronder zijn de resultaten van een eerdere werk van onze groep18, uitgevoerd op het SOD1G93A tra...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het experimentele protocol hierboven beschreven biedt een ideale manier van meten en discriminerende functionele wijzigingen die hebben plaatsgevonden in de spier direct of niet indirect op het niveau van de motorische eindplaat. Aangezien deze techniek is gebaseerd op een indirecte meting van NMJ functionaliteit, kan het niet worden gebruikt om vast te stellen als een defect is gerelateerd aan morfologische veranderingen of aan biochemische veranderingen. Daarentegen biedt het een effectieve manier om te bepalen of wijz...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Werk in de auteurs laboratorium werd gesteund door de Fondazione Roma en Telethon (verlenen neen. GGP14066).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dual-Mode Lever System Aurora Scientific Inc.300Bactuator/transducer
High-Power Bi-Phase Stimulator Aurora Scientific Inc.701Bpuls stimulator (zenuw)
High-Power Bi-Phase Stimulator Aurora Scientific Inc.701Cpuls stimulator (spier)
In vitro Muscle Apparatus Aurora Scientific Inc.800A
Preparatory tissue bathRadnoti158400
Monopolar Suction ElectrodeA-M Systems573000met een zelfgemaakte referentie 
Oscilloscoop TektronixTDS2014
StereomicroscoopNikonSMZ 800
Koude lichtverlichting Photonic OpticsPL 3000
AcquisitiekaartNational InstrumentsNI PCIe-6353
ConnectorblokNational InstrumentsNI 2110
Persoonlijke computerAMD Phenom II x4 970Processor 3.50 Ghz met Windows 7
LabView 2012 softwareNational Instruments
Krebs-Ringer Bicarbonaat Buffer Sigma-AldrichK4002 fysiologische buffer
NatriumbicarbonaatSigma-AldrichS5761 
Calciumchloride CaCl2Sigma-AldrichC4901watervrij, poeder, ≥97%
HEPES-bufferSigma-AldrichH3375≥99,5% (titratie)
Schalen 60mm x 15mmFalcon353004Polystyreen
SiliconeSylgard 184 Silicone Elastomer Kit  0.5Kg.
ThermostaatDennerleDigitalDuomat 1200
PompNewa MiniMN 606voor aquarium
Hittebestendige ThermokabelLucky Reptile61403-150/60Hz 50W
Emmerelke 10 literPolypropyleen
O2 + 5%CO2siadMenggas
#5 Pincet Fine Science Tools11252-202 items
Spring Scissors - 8 mm BladesFine Science Tools15024-10zenunextcisie
Scherpe schaar Fine Science Tools 14059-11spierverwijdering
Fijne schaarWagner02.06.32extern van het dier
Student Scalpel Handle #3Fine Science Tools 91003-12 
Scalpel Blades #10Fine Science Tools 10010-00
Scalpel Blades #11Fine Science Tools 10011-00
Nylondraad Ø0.16 mmelke

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
  2. Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
  3. Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
  4. Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
  5. Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
  6. Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
  7. Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
  8. Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
  9. Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
  10. Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).
  11. Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
  12. Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
  13. Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
  14. Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
  15. Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
  16. Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
  17. Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
  18. Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
  19. Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
  20. Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neuromuscular Junction FunctionalityElectrical StimulationEx Vivo PreparationSoleus Sciatic NerveDiaphragm Phrenic NerveForce Frequency RelationshipNeurotransmission FailureIntratetanic FatigueTwitch Kinetics PropertiesSOD1 G93A Mouse

Gerelateerde artikelen