Gen deletie mutanten gegenereerd door homologe recombinatie zijn de gouden standaard voor genfunctie studies. De OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) methode voor snelle generatie van deletieconstructen wordt beschreven. Agrobacterium gemedieerde schimmel transformatie volgt. Tenslotte wordt een PCR-gebaseerde bevestigingsmethode van gendeleties in zwamtransformanten gepresenteerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Snelle verwijdering Productie in Fungi via
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een nauwkeurige deletie van genen die van belang zijn, terwijl de rest van het genoom onveranderd wordt, biedt het ideale product om de functie van het bepaalde gen in het levende organisme te bepalen. In dit protocol wordt de OSCAR methode beschreven voor nauwkeurige en snelle deletie plasmide constructie. OSCAR berust op het kloningssysteem waarin een enkele recombinase-reactie wordt uitgevoerd die de gezuiverde PCR-geamplificeerde 5 'en 3' flanken van het gen van belang en twee plasmiden, pA-Hyg OSCAR (de markervector) en pOSCAR bevat vector). Bevestiging van de correct samengestelde deletievector wordt uitgevoerd door middel van restrictie-digestie-mapping, gevolgd door sequencing. Agrobacterium tumefaciens wordt dan gebruikt om de introductie van het deletieconstruct in schimmelsporen te bemiddelen (aangeduid als ATMT). Tenslotte wordt een PCR-analyse beschreven om te bepalen of het deletieconstruct geïntegreerd is door homologe of niet-homologe recombinatie, welke gendeletie ofEctopische integratie, respectievelijk. Deze aanpak is succesvol gebruikt voor de verwijdering van talrijke genen in Verticillium dahliae en in Fusarium verticillioides onder andere soorten.
Inleiding
Genetische dissectie is een krachtige methodologie voor het bepalen van het functionele belang van individu of combinaties van genen. Een standaardbenadering om de rol van specifieke genen te begrijpen is de productie van enkele genmutanten ongewijzigd in elk ander gen. De meest krachtige en minst potentiële confounding benadering is compleet en precies deletie van het open lezingsgedeelte van een gen van interesse (GOI ORF) zonder schade aan een andere genfunctie.
Omdat standaardligatiebenaderingen voor het verwijderen van plasmide-generatie meerdere stappen vereisen, zou de rationele voor OSCAR 1 een snellere in vitro- aanpak produceren. Figuur 1 toont het assemblageproces in de OSCAR-aanpak. De hier beschreven werkwijze heeft het voordeel van het combineren van snelle constructie van individuele gendeletievectoren in een enkele multipartreactie in combinatie met daaropvolgende Agrobacterium tumefaciens gemedieerde transfoRmation (ATMT). OSCAR is zeer snel en vergelijkt goed met andere strategieën, zoals het gebruik van Gibson assemblage in gist 2 . De OSCAR-methode is succesvol gebruikt bij verscheidene Ascomycota soorten schimmels. Deze soorten omvatten: Fusarium verticillioides (ongepubliceerd), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 en Dothistroma septosporum 9 en Sarocladium zeae (ongepubliceerd) .
Dit protocol geeft stap-voor-stap instructie voor de methode inclusief primerontwerp, flank-PCR-amplificatie, de OSCAR BP-reactie, de bevestiging van de verwijdering van constructstructuur, transformatieIonen van Agrobacterium met het construct gevolgd door ATMT-gebaseerde overdracht van het deletieconstruct in de schimmelcellen en uiteindelijk differentiëren van schimmeldeletiemutanten van die met ectopisch geïntegreerde deletieconstructen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Primerontwerp voor PCR-versterking van genflanken
- Download naar een tekstverwerkingsbestand de genomische regio van het gen van belang (GOI) inclusief het open leesframe (ORF) en tenminste 2 kb flankeren het gen aan elke kant van FungiDB of andere genomische gegevensbron.
- Markeer de ORF die is bedoeld voor het verwijderen en etiketten starten en stoppen met codons.
- Identificeer en markeer aangrenzende ORF's binnen de gedownloade volgorde.
- Gebruik het 2 kb 5'-uiteinde van de GOI ORF en het primer-ontwerpgereedschap (zie Materialenlijst) om PCR-primerpaar O1 en O2 te ontwerpen om een minimumformaat van 1 kb te genereren. Zorg ervoor dat u geen naburige ORF's hebt.
- Plak de 2 kb 5 'flank in het venster' Sequence Entry '. Klik op het vak 'Aangepaste parameters weergeven'. Voer de volgende aangepaste ontwerpparameters in: Primer TM 58 (min), 60 (opt) en 62 (max); Primer GC 40 (min), 50 (opt) en 60 (max); Primer Maat 22 (min), 24 (opt) en 26(Max); Amplicon Grootte 1250 (min), 1500 (opt) en 2000 (max).
- Kies het resultaat dat de omgekeerde primer (O2) dichtst bij de ORF plaatst. Vang een schermafbeelding van de analyses en kopieer en plak de primersequenties in het tekstverwerkingsdocument.
- Herhaal het proces voor 3'-flank om primers O3 en O4 te genereren, kies dit keer het resultaat waarbij de voorwaartse primer (O3) dichtst bij het doel ORF staat.
- Voeg passende plaatsen toe aan 5'-einden van primers 1 tot en met 4 (zie tabel 1 ).
- Ook ontwerpen en bestellen ORF-specifieke primers die gebruikt worden voor verwijderingsbevestiging in sectie 4 hieronder. Parameters moeten hetzelfde zijn als in stap 1.4.1, behalve als u Amplicon Size 500 (min), 750 (opt) en 1000 (max) gebruikt voor aanpassing van de lengte ORF. Ten slotte, voor het bevestigen van homologe recombinanten, genereren 5 'out en 3' out primers die net buiten de flanken binnen het chromosoom zijn gevonden. Deze "out" primers worden gebruikt bijHygR (210) en hygF (850) respectievelijk ( fig. 2 ).
- Bestel primers.
2. Productie van OSCAR Constructs
- Met behulp van een HiQ- Taq, voer twee reacties uit, één voor de 5'- en 3'-flanken, met behulp van primers (100 μM) O1 en O2 in één reactie en primers O3 en O4 in de tweede. Reactiemengsel bevat het volgende: 29,5 μL steriel gedistilleerd water (SDW), 5 μl 10x LA PCR buffer, 8 μl 2,5 mM dNTP-mix, 5 μl 25 mM MgCl2, 1 μl template (50 ng / μl), 0,5 μl hi- Fidelity Taq , 0,5 μL Primer O1 en 0,5 μL Primer O2 voor 5'-flank (of 0,5 μL Primer O3 en 0,5 μL Primer O4 voor 3'-flank) De reactieomstandigheden zijn als volgt: 94 ° C gedurende 1 minuut, dan 30 cycli van 94 ° C gedurende 30 s, 60 ° C gedurende 30 minuten, 72 ° C gedurende 2 minuten, dan de laatste stappen van 72 ° C gedurende 5 minuten en dan onbepaald bij 10 ° C vasthouden.
- Looppas 0,8%Agarose 1x TAE (40 mM Tris acetaat pH 8,3, 1 mM EDTA) gelelektroforese voor ongeveer 125 Vh in een standaard minigel apparaat om productgrootte en relatieve concentratie te bepalen. Plaats de gel op met non-ethidium vlek volgens de instructies van de fabrikant. Visualiseer op een UV-verlichting.
- Als 5'- en 3'-flankproducten ongeveer gelijk zijn aan concentratie, combineer ze ze en gebruik een affiniteitskolom kit (of PEG neerslag 90 μL gecombineerde PCR producten, 240 μl TE buffer pH 7,5, 160 μl 30% polyethyleenglycol PEG8000 30 mM MgCl 2 ) de PCR-producten co-zuiveren volgens het protocol van de fabrikant. Als ze niet van gelijke concentratie zijn, combineer alle lage concentratieproducten met een geschatte gelijke hoeveelheid product uit de hogere opbrengstreactie.
- Gebruik een spectrofotometer om de gezuiverde DNA-concentratie te meten.
- BP-reactie uitvoeren door het volgende te mengen: 1 μL 60 ng / μl pOSCAR, 2 μL 60 ng /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 μL van 60 ng / μL gecombineerde flanken, 1 μl clonase. Incubeer gedurende 16 uur bij 25 ° C. Beëindig de reactie door 0,5 μl eiwitase K toe te voegen en gedurende 10 minuten bij 37 ° C te incuberen.
- Transformeer hoge competentie E. Coli cellen. Zowel commercieel beschikbare bevoegde cellen als huishoudelijke DH5a CaCl2 bevoegde cellen werden succesvol gebruikt als ontvangers zoals beschreven door de instructies van de fabrikant. Plaat op laag natrium (0,5 g / L NaCl) LB bevattende 100 μg / ml spectinomycine (Spec).
- Identificeer het juiste construct door DNA miniprepen 10 van de hierboven gevormde kolonies uit te voeren. Doe dubbele spijsvertering met Hin dIII en Kpn I als volgt: pipet 5 μL DNA, 2 U van elk enzym, 2 μL geschikte 10x buffer met SDW tot een 20 μL totaal volume. Hierdoor wordt de insert (ongeveer 4,5 kb met 1,5 kb genflanken) van de vector vrijgegeven ( ongeveer 7 kb) en snijdt alle sites inFlanken die voorspelbare bandgroottes kunnen geven.
- Sequence 11 selecteert klonen die een passend bandpatroon tonen.
3. Agrobacterium tumefaciens Gemedieerde Transformatie (ATMT) van Fungi
- Transformeer Agrobacterium tumefaciens stam AGL1 met OSCAR deletie construct 12 .
- Transformeerzwam met AGL1 die het GOI OSCAR deletieplasmide bevat. Doe hiervoor de volgende stappen:
- Bereid een schimmelsporeuspensie met steriel water bij 2 x 10 6 sporen / ml op. Sporen op een hemocytometer of geautomatiseerde celteller kwantificeren. Plaats 500 μL hiervan in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Deze set-up is voor 4 transformatieplaten.
- Gebruik een blauwe steriele wegwerplus om een gemakkelijk zichtbare gobbe te maken (dient ongeveer 20% van de lusdiameter te bedekken) van het verwijderingsplasmide dat AGL1 bevat van 2-3 dagen oud LB-Spec 100 medium (zie MAterials Lijst voor samenstelling) met platen en mengen in de spore suspensie. Vortex tot bacteriële cellen zijn goed gedispergeerd ( ongeveer 5 minuten gemiddelde snelheid).
- Pipette 100 μL van de conidia-Agro suspensie op het midden van een cellulosemembraanfilter geplaatst op elk van vier 6 cm Petrischalen die co-cultivatiemedium bevatten 12 .
- Spread de suspensie met steriele glaskralen (ongeveer 4) om het hele oppervlak van het membraanfilter te bedekken. Alternatief verdeel de vering met behulp van een traditioneel verdeelgereedschap. Laat het membraanfilter gedurende ongeveer 10 minuten in een kap drogen, wikkel met paraffinefilm. Herhaal stappen 3.2.2 en 3.2.3 om meerdere transformaties op te zetten.
- Incubeer de plaat gedurende 2 dagen bij kamertemperatuur, omgekeerd.
- Breng het membraanfilter over op 6 cm Aspergillus selectiemedium 12 platen die hygromycine B (Hyg) bevatten 150 μg / ml, 200 mM cefotaxime en 100 μg / mlmoxalactam. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5-7 dagen voor het isoleren van Hyg-resistente kolonies.
- Met steriele tandstokjes, zet vermeende transformanten over op 6 cm Aardappel Dextrose Agar (PDA) platen die 150 μg / mL Hyg, 100 μg / ml kanamycine bevatten.
4. Verwijderen mutantidentificatie door PCR
- Extract DNA voor PCR uit transformanten door thermolyse 13 .
- Zodra transformanten colonies op de PDA uit stap 3.2.7 vormen, gebruik dan een steriele tandstok om een kleine hoeveelheid (2 mm x 2 mm) mycelium of gistcellen van de kolonie in 100 μl lysisoplossing (50 mM natriumfosfaat, pH 7,4, 1 mM EDTA, 5% glycerol) in een microcentrifugebuis.
- Incubeer het mengsel gedurende 20-30 minuten bij 85-90 ° C. Bewaar het ruwe extract dat genomisch DNA bevat bij -20 ° C tot gebruik in stap 4.2.
- Voer 4 PCR reacties per transformant uit, één elk tot dHomologe recombinatie van respectievelijk de 5 'en 3' flanken eteren voor de selecteerbare marker (hygromycine fosfotransferase in dit geval) en een voor de GOI ORF.
OPMERKING: We gebruiken doorgaans goedkope low-accuracy Taq voor deze reacties. Reactie condities zijn zoals beschreven in stap 2.1 hierboven en bevatten SDW 20 μl, 10x Taq buffer 2,5 μL, dNTPS (10 mM) 0,5 μl, zelfgemaakte Taq 14 , 0,5 μl, Primer A (100 μM) 0,5 μl, Primer B (100 μM ) 0,5 μl, sjabloon 0,5 μl. Lagere concentratie primer voorraden (10 μM) kunnen even goed gebruikt worden. - Doe een agarosegel ( bv. 0,8%) van de PCR-producten. Deletiemutanten produceren de Hyg-band maar niet een ORF-product. Ektopische integanten zullen beide bands tonen. Wildtype zal alleen de ORF-band produceren.
- Bewaar deletiemutanten permanent (en een ectopische transformant of twee voor controles) voor toekomstig gebruik.
OPMERKING: 15% glycerol wordt gebruikt om sOnze stammen op lange termijn bij -80 ° C gescheurd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De OSCAR methode, in een enkele reactie, genereert een plasmide dat de flanken van het doelgen bevat dat verwijderd wordt rond de selecteerbare markeringskassette. De productie van verwijderingsconstructies met behulp van OSCAR is zeer efficiënt. Het systeem kan echter gedeeltelijke constructen produceren die sommige maar niet alle drie fragmenten bevatten (de twee genflanken en de selecteerbare marker). Over het algemeen bevatten de meeste E. coli transformanten het juiste OSCA...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een stapconstructie van Agrobacterium -Recombinatie-ready-plasmiden (OSCAR) is met succes toegepast bij een steeds groter aantal Ascomycota-schimmels. De methode zou ook gemakkelijk van toepassing kunnen zijn op de Basidiomycota en soorten van andere schimmelfyla (met geschikte promotoren die selecteerbare merkergenen aandrijven), waarbij Agrobacterium gemedieerde transformatie en homologe recombinatie mogelijk zijn. Er zijn extra markeringsvectoren gegenereerd om keuzes van anti-schimmelverbindingen t...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken de volgende leerlingen van de lagere en middelbare school voor hun werk om OSCAR mutanten te genereren in Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez Ashley Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le en Angel Pham.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selectie, samenstelling: 1% tryptone, 0,05% NaCl, 0,5% gistextract, 1,5% agar voor vast medium | ||
| Co-cultivatiemedium | ATMT transformatie-inductie (Referentie 12) | ||
| Aspergillus minimaal medium met Hygromycine | Selectie van schimmeltransformant | ||
| PDA-medium | Acumedia | 7149A | Single spore slantbuisjes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Isolatie van schimmeltransformant, PDA bevattend 150 μg/mL hygromycine B en 100 μg/mL Kanamycine | ||
| Glazen kralen | Genlantis | C400100 | Verspreiding op een plaat |
| Nitrocellulosefilters (47 mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-cultiveren voor ATMT |
| Verschillende centrifugebuizen | Meerdere preparaten | ||
| Petri-schotel (diverse) | Kweek van bacteriën en schimmels | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selecteerbare marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5α One Shot Competent E. colicellen | Life Technologies | 12297-016 | BP reactie transformatie |
| ccdB overleving E. coli cellen | Life Technologies | A10460 | Onderhoud van pOSCAR |
| Houtsen transfersticks | Streken van kolonies | ||
| Tandenstokers | Koloniaal plukken | ||
| Microcentrifuge | Pelleting van bacteriën, etc. | ||
| Preparatieve centrifuge | Verzameling van schimmelsporen | ||
| Dissectiemicroscoop | Isolatie van enkele sporen | ||
| Automatische celteller | Berekening van sporessuspensie | ||
| Compoundmicroscoop | Hemocytometer celtelling | ||
| QIAquick PCR-zuiveringskit | Qiagen | 28104 | Zuivering van PCR-genflank product |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taqpolymerase voor OSCAR flank generatie |
| Hygromycine B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycine | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxime | TCI America | C2224 | |
| Kanamycine | 11815032 | ||
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Postkleuring agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR-zuiveringskit (Cat. Nr. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R of One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R van Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzymmix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Gebruikt voor het assembleren van deletieconstructie in pOSAR |
Referenties
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
- Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
- Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
- Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
- Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
- Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960(2015).
- Chettri, P. Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).
- Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172(1990).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).
- Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
- McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , Springer International Publishing. 361-384 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
