Recente bevindingen suggereren dat bacteriële flagellaire motoren een verscheidenheid aan omgevingssignalen detecteren en als reactie hierop veranderen. De hier besproken bead-assays zullen naar verwachting helpen bij het verklaren van de rol van verandering in cellulaire aanpassing aan omgevingsstressors.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Biofysische karakterisering van flagellaire Motor Functies
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De rol van flagellaire motoren bij bacteriële beweeglijkheid en chemotaxis is goed begrepen. Recente ontdekkingen suggereren dat flagellaire motoren in staat zijn om zich aan te passen in reactie op een verscheidenheid aan omgevingsstimuli en behoren tot de triggers voor oppervlaktekolonisatie en infecties. De precieze mechanismen waarmee motoren zich aanpassen en cellulaire aanpassing bevorderen, zijn waarschijnlijk afhankelijk van belangrijke motorkenmerken. De hier gepresenteerde fotomultiplier-gebaseerde bead-trackingtechniek maakt nauwkeurige biofysische karakterisering van motorfuncties mogelijk, inclusief aanpassingen in motorsnelheden en schakeldynamica. Deze aanpak biedt het voordeel van real-time tracking en de mogelijkheid om het gedrag van motoren gedurende langere perioden te onderzoeken. De besproken protocollen kunnen gemakkelijk worden uitgebreid om flagellaire motoren in een verscheidenheid aan bacteriële soorten te bestuderen.
Inleiding
Flagellaire motoren in staat cellen te zwemmen door roterende spiraalvormige extracellulaire filamenten. De hoeveelheid koppel van de motor kan genereren voor een bepaalde lengte van het flagellum (dat wil zeggen, de viskeuze belasting) bepaalt het zwemmen snelheden. Anderzijds, zijn vermogen om de draairichting schakelaar regelt celmigratie als reactie op chemische stoffen, een proces dat bekend staat als chemotaxis. Chemotaxis en beweeglijkheid zijn virulentiefactoren 1-3, flagellaire motoren zijn goed gekarakteriseerd door de jaren heen 4. Toenemende bewijs nu dat de motor werkt als een mechanosensor - het mechanisch detecteert de aanwezigheid van vaste substraten 5,6. Dit vermogen waarschijnlijk helpt bij het ontstaan oppervlaktekolonisatie en infecties 5,7. Hierdoor mechanismen waardoor de motor detecteert oppervlakken en ingewijden signalering significantieniveau 8,9.
De flagellaire motor kan gemakkelijk worden bestudeerd door tethering de flagellum op een substraat en waarnemen cel rotatie. Dergelijke tethering werd eerst bereikt door Silverman en Simon, die met een polyhook mutant in E. coli en succesvol verbonden haken glassubstraten met anti-haak antilichamen 10 werkte. De gebonden cel assay konden de onderzoekers de antwoorden van de motor-schakelaar bestuderen van verschillende chemische stimuli. Bijvoorbeeld, Segall en collega chemisch gebonden gestimuleerde cellen met behulp van iontoforetische pipetten. De overeenkomstige wijzigingen in de CW vertekening (de fractie van de tijd motoren draaien met de klok mee, CW) stelde hen in staat om de kinetiek van de aanpassing te meten in de chemotaxis netwerk 11,12. Terwijl de tethered cel assay effectief in het bestuderen switch reacties, het was alleen in staat om inzichten in motor mechanica bieden meer dan een beperkt aantal viskeuze lasten 13. Om dit probleem te overwinnen, Ryu en medewerkers aangebonden bolvormige, latex kralen stubs op cellen vast oppervlakken gloeidraad. De kralen warenvervolgens gevolgd met behulp van back-focal interferometrie met zwakke optische vallen 14. Door te werken met kralen van verschillende afmetingen, kunnen onderzoekers de motor te bestuderen over een veel breder scala van lasten. Deze test werd later verbeterd door Yuan en Berg, die een fotovermenigvuldiger-gebaseerde bead-tracking-techniek in combinatie met laser donkerveld belichting ontwikkeld. Hun methode mogelijk volgen van tethered goud nanobeads die zo klein waren (~ 60 nm) dat de externe viskeuze weerstanden waren lager in vergelijking met de interne weerstanden viskeuze rotatie 15,16. Dit leidde tot de metingen van de maximaal haalbare snelheid in E. coli (~ 300 Hz). In V. alginolyticus, soortgelijke kralen assays mogelijk metingen van de spinnen tarieven op tussenliggende viskeuze belasting (~ 700 Hz) 17. Door het inschakelen van de metingen van motorische reacties over het gehele mogelijke waaier van viskeuze lasten (van nul-belasting op near-stal), de kraal-assays mits een belangrijk biofysische hulpmiddel om te begrijpen van de torque generatie proces 18,19.
Onlangs, bewerkt we de Yuan-Berg assay optische pincetten die ons in staat om precieze mechanische stimuli van toepassing op individuele motors 6 omvatten. Met deze techniek hebben we aangetoond dat de kracht-generators de motor draaien dynamisch mechanosensors - ze verbouwen in reactie op veranderingen in viskeuze belastingen. Het is mogelijk dat dergelijke load-sensing triggers celdifferentiatie in zwermen bacteriën, hoewel de mechanismen onduidelijk. Het is ook waarschijnlijk dat de flagellar motoren van andere species zijn ook mechanosensitieve 20, ofschoon direct bewijs ontbreekt. Hier bespreken we de fotovermenigvuldiger-gebaseerde (PMT) benadering voor het volgen van de rotatie van latex bolletjes gebonden aan flagellaire filamenten 15. In vergelijking met het volgen van ultrasnelle camera, de fotovermenigvuldiger-opstelling is voordelig omdat het relatief eenvoudig om één kralen in real time en over lange duragen. Het is vooral handig bij het bestuderen van de lange tijd remodeling in flagellaire motor complexen te wijten aan prikkels uit de omgeving 21. Hoewel we detail protocollen specifiek voor E. coli, kunnen zij gemakkelijk worden aangepast voor het bestuderen flagellaire motoren in andere soorten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Celbereiding
- Groeien overnacht culturen van de gewenste stam die de kleverige flic allel 15,22 in Trypton Broth (TB, 1% pepton, 0,5% NaCl), gevolgd door inoculatie bij 1: 100 verdunning in 10 ml vers TB. Groeien de cultuur bij 33 ° C in een shaker incubator tot OD 600 = 0,5.
- Pellet de cellen bij 1500 xg gedurende 5-7 min en opnieuw dispergeren van de pellet krachtig in 10 ml filter gesteriliseerd motiliteit buffer (MB; 10 mM fosfaatbuffer: 0,05-0,06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 pM methionine, pH 7,0).
- Herhaal stap 1.2 nog twee keer en re-verspreiden de laatste pellet in 1 ml MB.
- Afschuiving de suspensie door het passeren heen en weer ~ 75 maal tussen twee spuiten met 21 tot 23 gauge adapters verbonden met polyethyleen buis (7-12 cm lang, 0,58 mm binnendiameter). Beperk de totale tijd voor het knippen tot 30 - 45 s.
- Centrifugeer de cellen afgeschoven bij 1500 xg gedurende 5-7 min en opnieuw dispergerenpellet in 100-500 gl MB.
2. Schuif Voorbereiding
- Bereid een imaging kamer door sandwichen twee dubbelzijdige plakband tussen een cover-slip en een microscoop glijbaan. Voor chemotaxis assays, in dienst nemen elke microfluïdische kamer dat de uitwisseling van MB en chemische stimulerende middelen mogelijk maakt.
- Voeg 0,01% poly-L-lysine oplossing in de kamer en na 5 min zachtjes spoelen oppervlakken MB (80-100 pl).
- Voeg 40 ul van de celsuspensie in de kamer en voldoende tijd voor bevestiging aan het glasoppervlak (7-8 min). Vloeien unstuck cellen door toevoeging van 100 ul MB aan één zijde van de kamer, terwijl de wicking oplossing met filtreerpapier van de andere kant.
- Voeg 10-15 pi van latex bolletjes in de kamer en laat de kralen voldoende tijd om zich te vestigen en te hechten aan de cellen (7-8 min). Voorzichtig spoelen met 100 pl MB, zoals beschreven in stap 2.3, kralen unstuck te verwijderen. Gebruik een bereik van de kraal-siZes van de experimenten zolang een goed contrast is beschikbaar.
3. Bead Tracking
- Plaats het monster op een microscoop podium en scan het oppervlak beads bevestigd aan een motor. Gebruik een 40X fase doelstelling om opmerkingen te maken, hoewel fase microscopie is niet nodig. Als alternatief, in dienst nemen bright-field imaging zolang voldoende contrast wordt gehandhaafd om duidelijk onderscheid te maken een heldere kraal op een donkere achtergrond.
- Zodra een kraal is geselecteerd, gaat de fase zijdelings aan de korrel positie in een vooraf bepaalde hoek zoals weergegeven in figuur 1B. Positie bolletjes op dezelfde hoek dat de rotatierichting van de kraal goed bekend. De ideale kraal traject is ongeveer cirkelvormig maar elliptisch trajecten ontvankelijk zijn.
- Handhaaf de bemonsteringsfrequentie hoger is dan tweemaal de rotatiefrequentie van de motor om fouten geassocieerd met aliasing te voorkomen. In dit werk, gebruik dan een motor die roteerde bij50 Hz en monster bij frequenties die 10 keer hoger (500 Hz) werden tot een egaal signaal te verkrijgen.
4. Data Analysis
- Centrum en schaal van de PMT uitgangsspanningen en correcte ellipticiteit in de trajecten met affiene transformatie indien nodig 23. Gebruik een power-spectrum analyse rotatiesnelheden 17 te bepalen.
- Bepalen polaire hoeken θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Bepaal de variaties in de snelheid van de motor en schakelen na verloop van tijd door het berekenen van ω
14. - Gebruik een mediaan filter om de motorsnelheid data glad. Een filter venster over twee volledige omwentelingen wordt aanbevolen 23,24.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De fotovermenigvuldiger opstelling is weergegeven in figuur 1A. Het is belangrijk dat de PMT hoge gevoeligheden over het bereik van golflengten verstrooid door de kralen plaats. De PMT's hier in dienst werken in het zichtbare en nabij-infrarode bereik, en waren in staat om het licht verstrooid door kralen verlicht door een halogeen lichtbron detecteren. De optimale lichtomstandigheden en voltages zal variëren van de ene instelling naar de andere. Voor de installatie ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Om vastgebonden kraal-tracking en correcte inschatting van de motor-koppels te vergemakkelijken, dient de volgende gegevens te worden beoordeeld. Bij het uitvoeren van deze metingen met gegeseld cellen, scheren is een cruciale stap. Shearing vermindert de flagellaire filament tot slechts stomp, waardoor wordt gewaarborgd dat de viskeuze belasting van de motor is hoofdzakelijk te wijten aan de korrel en kan worden geschat op 10% fout 16. Shearing verbetert ook de kans op het vinden van cirkelvormige trajecten ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Howard Berg voor het schenken van de bead-tracking microscoop/fotomultipliers en de Texas A&M Engineering Experiment Station voor de fondsen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
Referenties
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
- Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
- Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
- Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
- Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
- Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).
- Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
- Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
- Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
