Voorwaardelijke herprogrammeren van Pediatric Human slokdarmkanker epitheelcellen voor gebruik in Tissue Engineering and Disease Investigation

Summary

Uitbreiding van menselijke kinderen oesofageale epitheelcellen gebruikmaking voorwaardelijke herprogrammering biedt onderzoekers met een patiënt-specifieke populatie van cellen die kunnen worden gebruikt voor de engineering oesofageale constructen autologe implantatie defecten of letsel behandelen en dienen als een reservoir voor therapeutische screeningstesten.

Abstract

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient's symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Introduction

Slokdarmkanker tissue engineering en eosinofiele esophagitis (EoE) hebben de focus van het onderzoek in veel laboratoria de afgelopen tien jaar geweest. Aangeboren afwijkingen, zoals slokdarmatresie worden waargenomen bij ongeveer 1 op 4000 levendgeborenen, waardoor de onvolledige ontwikkeling van de slokdarm leidt tot het onvermogen om te eten ^1. De incidentie en prevalentie van EoE hebben op de stijging sinds de identificatie van de ziekte entiteit 1993. De incidentie van EoE varieerde 0,7-10 / 100.000 per jaar en de prevalentie varieerde 0,2-43 / 100.000 ² geweest. Een aantrekkelijke nieuwe chirurgische benadering va....

Protocol

Slokdarm biopten werden verkregen na geïnformeerde toestemming werd verkregen van de ouders / verzorgers van de pediatrische patiënten en in overeenstemming met de institutionele Review Board (IRB # 13-094).

1. steriliseren van instrumenten en gelatine-oplossing

1. Autoclaaf tang, scheermesjes en scharen voorafgaand aan de behandeling van weefsel om besmetting te voorkomen.
2. Tot 200 ml 0,1% gelatineoplossing te combineren 200 mL gedestilleerd water met 0,2 g gelatine. Autoclaaf en afkoelen voor gebruik.

2. Coating Tissue Culture Plates

1. Ongeveer 2 uur voor celisolatie, voeg genoeg 0,1% gelatine een....

Results

Een overzicht van de belangrijkste stappen bij het isoleren esophageal epitheelcellen van patiënt biopsies wordt samengevat in figuur 1. Kolonies van epitheelcellen wordt gevormd in ongeveer 4-5 dagen en wordt omringd door fibroblast feeder-cellen (Figuur 2A). Aangezien deze kolonies uit te breiden zullen zij fuseren met andere kolonies tot grotere kolonies (figuur 2B) te vormen. Zodra de kweken 70% confluent zijn geworden, moeten ze wor.......

Discussion

De belangrijkste stappen om te isoleren en vergroten esophageal epitheelcellen van patiënt biopsies zijn: 1) voldoende dissociëren biopsie weefsel met minimale celdood; 2) zorgen ROCK inhibitor wordt toegevoegd aan het celkweekmedium bij elke mediumverversing; 3) Gebruik niet meer feeder-cellen dan aanbevolen; 4) handhaven van een schone aseptische cultuur; en 5) passage cellen vlak voor het bereiken van samenvloeiing.

Door de patiënt verschillen in biopsie monsters verkregen voor voorwaarde.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatin From Porcine Skin	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific	6769006
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific	C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulin Solution	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Bovine Serum	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100 mm Dishes	Denville Scientific	T1110-20
150 mm Dishes	Denville Scientific	T1115
50 mL Conicals	Denville Scientific	C1062-9
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher Scientific	BP2944-100
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811E
25 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cells	ATCC	CRL1658