Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

gerichte

16.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55263

⸱

26 januari 2017

 , 
1Biology Department, Hendrix College

In dit artikel

Samenvatting

Een strategie voor het genereren van mutaties in histongenen op hun endogene locatie in Saccharomyces cerevisiae wordt gepresenteerd.

Samenvatting

We beschrijven een op PCR en homologe recombinatie gebaseerd systeem voor het genereren van gerichte mutaties in histongenen in knopvormende gistcellen. De resulterende mutante allelen bevinden zich op hun endogene genomische plaatsen en er worden geen exogene DNA-sequenties achtergelaten in het genoom na de procedure. Aangezien in haploïde gistcellen elk van de vier kernhiston-eiwitten wordt gecodeerd door twee niet-allelele genen met sterk homologe open leesframes (ORF's), kan het targeten van mutagenese specifiek naar een van de twee genen die een bepaald histon-eiwit coderen problematisch zijn. De strategie die we hier beschrijven omzeilt dit probleem door gebruik te maken van sequenties buiten, in plaats van binnen, de ORF van de doelgenen voor de homologe recombinatiestap. Een ander kenmerk van dit systeem is dat de DNA-regio's die de homologe recombinatieprocessen aansturen zeer uitgebreid kunnen worden gemaakt, waardoor de kans op succesvolle integratie-gebeurtenissen toeneemt. Deze kenmerken maken deze strategie bijzonder geschikt voor histongenen mutagenese, maar kunnen ook worden aangepast voor mutagenese van andere genen in het gistgenoom.

Inleiding

De vier kern histon-eiwitten H2A, H2B, H3, H4 en spelen een centrale rol in de verdichting, organisatie en functie van eukaryote chromosomen. Twee sets van elk van deze histonen vormen de histon octameer, een moleculaire spoel dat de verpakking van ~ 147 basenparen van DNA rond zichzelf richt, uiteindelijk resulterend in de vorming van een nucleosoom 1. Nucleosomen actief deel aan een verscheidenheid van chromosoom processen, zoals de regulering van gentranscriptie en de vorming van heterochromatine en euchromatine in chromosomen, en als zodanig zijn de focus van intens onderzoek in de loop van de afgelopen decennia. Een aantal mechanismen beschreven waarmee nucleosomen kan worden gemanipuleerd op een manier die uitvoering van specifieke processen vergemakkelijken - deze mechanismen omvatten posttranslationele modificatie van histon residuen, ATP-afhankelijke nucleosoom remodeling en ATP-onafhankelijke nucleosoom reorganisatieen montage / demontage 2, 3.

De gist Saccharomyces cerevisiae is een bijzonder krachtige modelorganisme voor het begrijpen van histone functie in eukaryoten. Dit is grotendeels te wijten aan de hoge mate van evolutionaire conservering van het histon eiwitten gehele domein Eukarya en de ontvankelijkheid van gist aan een verscheidenheid van genetische en biochemische experimentele benaderingen 4. Omgekeerde genetische technieken in gist zijn op grote schaal gebruikt om de effecten van specifieke histon mutaties op de verschillende aspecten van chromatine biologie bestuderen. Voor deze soorten experimenten is het vaak de voorkeur om cellen waarin het mutant histonen tot expressie gebracht vanaf hun eigen genomische loci, zoals expressie van autonome plasmiden gebruik kan leiden tot abnormale intracellulaire niveaus van histon eiwitten (vanwege variërende aantallen plasmiden in cellen) en gelijktijdige wijziging van chromatine environments, die uiteindelijk de interpretatie van de resultaten kan verwarren.

Hier beschrijven we een PCR-gebaseerde techniek die het mogelijk maakt voor gerichte mutagenese van histon genen op hun oorspronkelijke genomische locaties die geen kloneringsstap en resulteert in het genereren van de gewenste mutatie (s) zonder overgebleven exogene DNA-sequenties in het genoom vereist. Deze techniek maakt gebruik van een efficiënte homologe recombinatie systeem in gist en heeft een aantal kenmerken gemeen met andere soortgelijke technieken ontwikkeld door andere groepen - vooral de Delitto Perfetto, plaatsspecifieke genomische (SSG) mutagenese en kloneren vrij-PCR allel vervangingsmethoden 5, 6, 7. De techniek beschrijven we de beeldverhouding dat maakt het bijzonder geschikt voor mutagenese van histon-genen. In haploïde gistcellen, elk van de vier kernhistonen wordt gecodeerd door twee niet-allelic en zeer homologe genen: bijvoorbeeld, histon H3 wordt gecodeerd door de HHT1 en HHT2 genen, en de open leesramen (ORFs) van beide genen dan 90% identiek in sequentie. Deze hoge mate van homologie kunnen experimenten ontworpen om specifiek op een van de twee-histon coderende genen voor mutagenese bemoeilijken. Dat voornoemde werkwijzen vereisen vaak het gebruik van ten minste enkele sequenties binnen het ORF van het doelwitgen homologe recombinatie drijven de techniek hier beschreven maakt gebruik van sequenties die het ORF van het histon-genen (die veel minder sequentiehomologie delen) voor de recombinatie stap, waardoor de kans op succesvolle targeting van mutagenese verhogen tot de gewenste locus. Bovendien kan de homologe gebieden die recombinatie rijden zeer omvangrijk zijn, wat verder bijdraagt ​​aan efficiënte gerichte homologe recombinatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: De experimentele strategie voor gerichte in situ mutagenese histon-gen omvat verschillende stappen (samengevat in figuur 1). Deze stappen omvatten: (1) Vervanging van het doel histon-gen het URA3-gen, (2) Productie en zuivering van PCR-producten die overeenkomen met twee gedeeltelijk overlappende fragmenten van het doel histon-gen onder toepassing van primers die het op gewenste mutatie (s), (3 ) Fusion PCR van de twee gedeeltelijk overlappende fragmenten volledige grootte PCR producten te verkrijgen voor integratie, (4) Co-transformatie van volledige grootte PCR producten en ruggengraat plasmide en selectie voor markering op plasmide (5) scherm voor 5-FOA-resistente transformanten, (6) Zuivering van 5-FOA-resistente kolonies en verlies van plasmide backbone, en (7) Moleculaire analyses om te testen op een goede integratie van het mutante allel.

figure-protocol-1
Figuur 1: Overzicht van de strategie voor Gerichte in situ Mutagenese van histon genen in gist. In dit voorbeeld het doelgen is HHT2, maar andere kern histon-gen kan ook worden gemutageniseerd met behulp van deze strategie. (A) haploïde gistcellen herbergen twee histon-H3 coderende genen (HHT1 en HHT2) en twee histon H4 coderende genen (HHF1 en HHF2) opgesteld als aangegeven in de figuur (de HHT1 en HHF1 genen zijn gelokaliseerd op chromosoom II en HHT2 en HHF2 genen zijn gelokaliseerd op chromosoom XIV - telkens de pijlen in de richting van transcriptie). In de eerste stap van de procedure, het ORF van het HHT2 gen wordt vervangen door het URA3-gen, die tot een hht2Δ :: URA3 stam. (B) In deel 1, is een wildtype kopie van het HHT2 gen uit een genomisch DNA monster wordt gebruikt als matrijs voor twee PCR reacties generatE de twee gedeeltelijk overlappende fragmenten van het gen. De omgekeerde primer voor de eerste reactie een of meer niet passende nucleotiden (aangegeven met een rode cirkel) die overeenkomen met de gewenste mutatie (s) in het genoom worden ingebracht. De voorwaartse primer voor de tweede reactie is het equivalent mismatch in een omgekeerde complementaire configuratie (ook aangeduid met een rode cirkel). De twee PCR-producten gegenereerd in deel 1 (producten a en b) worden vervolgens als matrijzen gebruikt voor fusie PCR met behulp van twee primers die hybridiseren aan producten A en B in de wijze getoond in deel 2. Dit resulteert in de generatie van full-size PCR producten (product c in deel 3) het herbergen van de gewenste mutatie (s). (C) De hht2Δ :: URA3 stam dan co-getransformeerd met de zo groot PCR-producten en een plasmide backbone (a HIS3- gemerkt plasmide in dit voorbeeld) en cellen worden geselecteerd op de aanwezigheid van het plasmide (op medium dat histidine in dit voorbeeld). Transformanten worden vervolgens op 5-FOA resistentie - resistente cellen zijn kandidaten voor een homologe recombinatiegebeurtenis die leidt tot de integratie van het PCR-product en excisie van het URA3-gen hebben ondergaan, zoals getoond. Daaropvolgende verlies van de ruggengraat plasmide door mitotische celdeling leidt tot de uiteindelijke gewenste histon mutante stam. We hebben dat selectie van de ruggengraat plasmide, gevolgd door screening op 5-FOA resistentie resulteert in een veel hogere frequentie identificatie correcte integratiegebeurtenissen vergelijking met directe selectie op 5-FOA platen, die meestal identificeert cellen die spontane URA3 mutaties verworven gevonden. (Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie 14). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Vervanging van de Target Histon Gene met de URA3Gen

  1. Voer standaard PCR-gemedieerde eenstaps genverstoring vervanging van het ORF van target histon-gen met de URA3 gen 8, 9.
    Opmerking: Het gebruik van gistcellen die de ura3Δ0 wordt aanbevolen als deze mutatie verwijdert de gehele ORF endogene URA3, waardoor integratie van het PCR-product te vermijden in de URA3-locus 8. Als alternatief kan de K. lactis URA3 gen effectief worden gebruikt voor het genereren van de histone vervangende één URA3 achtergrond als functioneel in S. cerevisiae maar heeft slechts gedeeltelijke sequentiehomologie met het S. cerevisiae URA3-gen. De stam moet ook auxotroof zijn voor ten minste één verbinding die het mogelijk maakt selectie van het plasmide ruggengraat in de transformatie experiment (zie stap 4 van het protocol). Deze stap is niet nodig als een target histon geneΔ :: URA3stam is al beschikbaar.

2. Generation en zuivering van PCR producten die overeenstemmen met twee gedeeltelijk overlappende Fragmenten van de Target Histon Gene met behulp van primers herbergen van de gewenste mutatie (s)

  1. PCR-producten genereren die overeenkomen met twee gedeeltelijk overlappende fragmenten van de gewenste histon-gen.
    1. Bereid twee PCR reacties als volgt:
      1. 1 pl template-DNA, 5 μl10 pM forward primer, 5 μl10 uM reverse primer, 0,5 ui (1,25 U) thermostabiele: om PCR-producten die overeenkomen met de eerste helft van het gen (product een in figuur 1B), het opzetten van de volgende reactie te genereren DNA polymerase, 10 pl 5x DNA polymerase buffer, 5 pl dNTP mengsel (2 mM elk) en 23,5 pl dH 2 O.
        OPMERKING: De template DNA kan genoom DNA afkomstig van een wildtype stam van het doelwit histon gen geïsoleerd met behulp van standaard proprocedures 10. Ter compensatie van verschillen in DNA-concentratie en het niveau van verontreinigingen in verschillende genomische preparaten, is het raadzaam om de reacties te optimaliseren door hetzij onverdund DNA of verschillende verdunningen van het genomische preparaten (bijvoorbeeld, 1:10 en 1: 100). De voorwaartse primer moet hybridiseren met een gebied stroomopwaarts van het doelwitgen. De reverse primer moet hybridiseren binnen het ORF, worden ~ 40 nucleotiden lang, en bevat de gewenste mutatie (s) ergens in het midden ervan (zie Figuur 1B-1 en Representatieve resultaten sectie voor voorbeelden). Het gebruik van een high fidelity DNA polymerase wordt aanbevolen om tarieven van ongewenste mutaties in de synthese van de PCR producten te verminderen.
      2. PCR producten die overeenstemmen met de tweede helft van het gen (product B in figuur 1B) te genereren, het opzetten van een reactie zoals aangegeven in 2.1.1.1 maar met verschillende primers.
        LET OP: De voorwaartse primer moet hybridiseren binnen het ORF, worden ~ 40 nucleotiden lang, en bevat de gewenste mutatie (s) ergens in het midden ervan. Merk op dat de mutatie (s) in deze primer is het omgekeerde complement van de mutatie (s) in de reverse primer in stap 2.1.1.1. De reverse primer moet hybridiseren met een gebied stroomafwaarts van het bedoelde gen (zie Figuur 1B-1 en Representatieve resultaten sectie voor voorbeelden).
    2. Leg de reacties in een thermocycler met de volgende instellingen: 94 ˚C 30 sec; 30 cycli van de volgende instellingen: 98 C 10 sec, 60 ˚C 5 sec, 72 ° C 1,5 min; en 72 ° C 10 min.
      Opmerking: Optimalisatie van PCR parameters die nodig zijn voor specifieke primersets en target histon gen.
  2. Run 20-50 pl van het materiaal van de PCR-reacties op een 0,9% laag smeltpunt agarose gel in 89 mM Tris-base, 89 mM boorzuur, 2,5 mM EDTA (TBE) buffer.
  3. Snijd agarosegel secties met de PCR producten uit gel met een schone scalpel of scheermesje en dragen elk een 1,5 ml microcentrifugebuis. Bewaar agarose gedeelten met PCR-producten bij -20 ° C tot gebruik.

3. Fusie PCR van de twee gedeeltelijk overlappende fragmenten te verkrijgen Full Size PCR producten voor integratie

  1. Bereid matrijs voor PCR reacties
    1. Smelt agarosegel secties van stap 2.3 door het plaatsen van de microcentrifugebuizen in een warmte-blok set bij 65 ° C gedurende 5 minuten (of tot volledig gesmolten). Vortexbuizen elke 1-2 min om het smelten te vergemakkelijken.
    2. Transfer een ingestelde gesmolten agarose uit elk monster (bijvoorbeeld 50 pl elk voor een totaal van 100 ui) in een microcentrifugebuis en door vortexen gemengd. Met dit als de matrijs in het fusie-PCR reacties. Plaats de buis bij -20 ° C tot gebruik.
  2. Amplificeren een grote hoeveelheid volledige grootte PCR-product (product cfiguur 1B)
    1. Opgericht zes PCR-reacties, elk met de volgende componenten: 2 pl matrijs-DNA, 10 pl 10 pM forward primer, 10 pi 10 uM reverse primer, 1 ui (2,5 U) thermostabiel DNA-polymerase, 20 pl 5x DNA polymerase buffer, 10 pl dNTP mengsel (2 mM elk), en 47 gl dH 2 O.
      Opmerking: Het aantal reacties kunnen worden gewijzigd afhankelijk van de PCR efficiëntie. Het matrijs-DNA (zie 3.1.2) worden verwarmd tot 65 ° C tot het gesmolten, gemengd door vortexen, en de laatste toegevoegd aan de PCR-mix. Eenmaal toegevoegd, meng grondig, maar voorzichtig door pipetteren de oplossing op en neer meerdere malen. Ter compensatie van verschillen in DNA-concentratie in de verschillende monsters, wordt aanbevolen om eerst de reacties te optimaliseren door hetzij onverdund sjabloon of verschillende verdunningen van het sjabloon (bijvoorbeeld 1:10 en 1: 100). De twee primers gebruikt moet hechten aan de twee gedeeltelijk overlappende fragmenten van het doelgen als ziekustrated in Figuur 1B-2 en zijn zodanig ontworpen dat de uiteindelijke PCR producten ten minste 40 baseparen aan beide zijden homoloog zijn aan de flankerende gebieden van het URA3 ORF dat homologe recombinatie stap (zie paragraaf Representatieve resultaten voor voorbeelden) rijdt zal. Het gebruik van een high fidelity DNA polymerase wordt aanbevolen om tarieven van ongewenste mutaties in de synthese van de PCR producten te verminderen.
    2. Plaats de buizen in een thermocycler met de volgende instellingen: 94 ˚C 30 sec; 30 cycli van de volgende instellingen: 98 C 10 sec, 50 ° C 15 sec, 72 ° C 1,5 min; en 72 ° C 10 min.
      OPMERKING: Optimalisatie van PCR parameters vereist zijn voor specifieke primersets en target histon-gen.

4. Co-transformatie van Full Size PCR Producten en Backbone Plasmid en selectie voor Marker op Plasmid

  1. Concentratie van PCR producten
    1. Zwembad de six PCR reacties (600 pi totaal) uit stap 3.2.2 in een enkele microcentrifugebuis en meng door vortexen.
    2. Splits de steekproef in drie 200 ui porties in microcentrifugebuizen. Precipiteren van het DNA in elke buis door toevoeging van 20 pl 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 550 pl 100% ethanol. Meng de oplossing grondig en plaats op ijs gedurende ten minste 15 min. Verzamel DNA door centrifugatie bij ~ 14.000 xg gedurende 10 minuten, spoel de pellet met 200 pl 70% ethanol en drogen.
    3. Resuspendeer elk DNA pellet in 25 ul van dH 2 O en bundelen tot een enkele buis (voor een totaal van 75 ui).
  2. Gist cotransformatie
    1. Bereid 10 ml overnacht cultuur van de stam gegenereerd in deel 1 in gistextract pepton dextrose (YPD) vloeibaar medium 11.
    2. De volgende ochtend, enten 400 ml YPD vloeibaar medium met 8 ml van de verzadigde kweek gedurende de nacht en incubeer door schuddenbij 30 ° C gedurende 4-5 uur om cellen logaritmische groeifase voeren.
    3. Verzamel de cellen door centrifugatie bij ~ 3220 xg gedurende 10 min, gooi het vloeibare medium en resuspendeer de cellen in 1 volume van 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 M lithium acetaat oplossing (TE / LiAc) .
    4. Verzamel de cellen door centrifugatie bij ~ 3220 xg gedurende 10 min en gooi de TE / LiAc.
    5. Resuspendeer de cellen in 1 ml TE / LiAc.
    6. Stel de volgende reactie cocktail in een microcentrifuge buis: 800 pi cellen uit stap 4.2.5, 40 ui gekookt 10 mg / ml zalmsperma DNA, totaal 12,5 ug ruggengraat plasmide DNA en 75 pl geconcentreerde PCR product uit stap 4.1.3.
      OPMERKING: zalmsperma DNA worden gekookt gedurende 5 minuten en geplaatst op ijs gedurende ten minste 5 minuten vóór gebruik in de reactie. Totale ruggengraat plasmide-DNA toegevoegd tot een minimum (~ 80 pi of minder) worden gehouden. Zie Representatieve resultaten sectie voor een voorbeeld van een backbone plasmaID kaart.
    7. Meng de cocktail buis grondig en hoeveelheid gelijkmatig in acht microcentrifugebuizen (Buizen 1-8).
    8. Stel de volgende twee controlegroepen transformatie reageerbuisjes:
      1. Buis 9 (geen PCR product control): 100 pi cellen uit stap 4.2.5, 5 ui gekookt 10 mg / ml zalmsperma DNA (gekookt gedurende 5 min; zie stap 4.2.6 Note), in totaal 1,56 ug ruggengraat plasmide-DNA en geen PCR product toegevoegd.
      2. Buis 10 (geen DNA controle): 100 pi cellen uit stap 4.2.5, 5 ui gekookt 10 mg / ml zalmsperma DNA (zie stap 4.2.6 opmerking) geen ruggengraat plasmide DNA toegevoegd, en er geen PCR-product toegevoegd.
      3. Meng beide buizen grondig, maar voorzichtig door en neer te pipetteren meerdere malen.
    9. Incubeer de tien buizen bij 30 ° C gedurende 30 min.
    10. Aan elke buis, voeg 1,2 ml 40% polyethyleenglycol (PEG 3350) in TE / LiAc. Meng goed met een P-1000 pipet totdat de oplossing homogeen is.
    11. Incubeer de buizen bij 30 tien° C gedurende 30 minuten. Voorzichtig de oplossing te mengen door en neer te pipetteren en incubeer buisjes bij 42 ° C gedurende 15 minuten.
    12. Verzamel de cellen door het draaien van de buizen in een microcentrifuge bij ~ 14.000 xg gedurende 30 sec. Gooi de vloeistof en resuspendeer de cellen in 1 ml steriele dH 2 O.
    13. Verzamel de cellen door het draaien van de buizen in een microcentrifuge bij ~ 14.000 xg gedurende 30 sec. Gooi de vloeistof en resuspendeer de cellen in 500 pi steriel dH 2 O.
    14. Zwembad tubes 1-8 samen (totaal volume van 4 ml) en meng door en neer te pipetteren.
    15. Plaat 200 pi van het bovenstaande mengsel over elk van twintig volledige uitval minimaal mediumplaten 11 (platen 1-20) voor selectie van de ruggengraat plasmide.
    16. Plaat 200 ul van het mengsel uit buis 9 en 200 pi mengsel van buis 10 elk op zijn eigen selectie plaat (platen 21 en 22, respectievelijk).
    17. Incubeer de platen bij 22 30 ° C gedurende 3-5 dagenselecteren op plasmide transformanten.
    18. Inspecteer transformatieplaten na 3-5 dagen incubatie. Ongeveer 5000 kolonies moet zichtbaar op platen 1-21 (zie Representatieve resultaten voor een voorbeeld) en er geen kolonies moet aanwezig zijn op de plaat 22 zijn.

5. Scherm voor 5-FOA-resistente transformanten

  1. Transfer cellen van platen 1-20 (en transformatie plaat 21 als controle) tot 5-fluororotinezuur (5-FOA) platen 11 door replica-plating 12 om te screenen op verlies van het URA3-gen als gevolg van integratie van de PCR producten op de gewenste plaats.
    1. Verwijder de plaat deksel en druk op de plaat met kolonies op een steriele fluweel. Overdracht van de cellen van de fluwelen aan een 5-FOA plaat door te drukken op de plaat op het fluweel. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2 dagen.
  2. Naar aanleiding van de 2-daagse incubatie, zorgvuldig te inspecteren de 5-FOA platen voor growth.
    LET OP: Een kandidaat integratie evenement zal worden vertegenwoordigd door een kleine asymmetrische "geplet" kolonie op een 5-FOA plate - omgekeerd, kleine papillen groeien op 5-FOA-platen zijn waarschijnlijk representatief voor spontane URA3 mutaties die ontstonden tijdens de groei van kolonies op de transformatieplaten, en dus waarschijnlijk niet de gewenste integratiegebeurtenis (zie figuur 3 in het gedeelte Representatieve resultaten voor nadere uitwerking van dit punt en voor enkele voorbeelden) vertegenwoordigen.

6. Zuivering van 5-FOA-resistente kolonies en het verlies van Backbone Plasmid

  1. Met behulp van steriele tandenstokers, kies de kandidaat-kolonies van de 5-FOA platen in stap 5.2 en streak beschreven voor enkele kolonies op YPD-platen. Incubeer gedurende 2-3 dagen bij 30 ° C.
  2. Na de incubatie, replica - plaat elk YPD zuivering plaat om een frisse YPD plaat, een drop-out plaat zonder uracil om te controleren op verliesvan het URA3-gen en een tweede drop-out plate te controleren op de aanwezigheid of afwezigheid van het plasmide ruggengraat. Incubeer gedurende 1-2 dagen bij 30 ° C.
  3. Na de incubatie, te identificeren een kolonie van elke kandidaat monster dat groeit op de YPD plaat, maar niet groeien op beide drop-out plaat (zoals een kolonie wordt verwacht dat het URA3-gen te hebben verloren door de recombinatie en verloor de ruggengraat plasmide tijdens mitotische celverdeling). Restreak zulke kolonies op verse YPD platen. Deze kolonies zijn de inburgeraars en zal in stap 7 worden geanalyseerd.

7. Moleculaire Analyses om te testen op een goede integratie van de Mutant allel

  1. Isoleer genomisch DNA van de kandidaat monsters onder toepassing van standaard procedures 10.
  2. Amplify genomische regio omvat het doelgebied.
    1. Stel de volgende PCR-reactie voor elk monster: 0,5 pl template-DNA, 5 ui10 pM forward primer, 5 pl 10 uM reverse primer, 0,5 pl (2,5 eenheden) Taq DNA polymerase, 5 pl 10x Taq DNA polymerase buffer, 5 pl dNTP mengsel (2 mM elk), en 29 gl dH 2 O.
      OPMERKING: Template DNA is genomisch DNA afgeleid uit de kandidaat-monsters. Het verdient aanbeveling om ook twee controlereacties: één gebruikmaking van genomisch DNA afkomstig van de oorspronkelijke histon geneΔ :: URA3 stam als template en andere met genomisch DNA van een wildtype histon-stam als sjabloon. Ter compensatie van verschillen in DNA-concentratie en het niveau van verontreinigingen in verschillende genomische preparaten, is het raadzaam om de reacties te optimaliseren door hetzij onverdund DNA of verschillende verdunningen van het genomische preparaten (bijvoorbeeld, 1:10 en 1: 100). Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat deze primers hybridiseren aan DNA-sequenties buiten het gebied omvat door de vermeende geïntegreerde PCR product - deze wijze de grootte van de PCR producten in deze reactions kan worden gebruikt als een diagnostisch hulpmiddel voor integratie van de producten op de juiste genome plaats (zie Representatieve resultaten voor een voorbeeld).
    2. Leg de reacties in een thermocycler met de volgende instellingen: 94 ° C 3 min; 30 cycli van de volgende instellingen: 94 ° C 45 seconden, 50 ° C 45 seconden, 72 ° C 2 min; en 72 ° C 10 min.
      OPMERKING: Optimalisatie van PCR parameters vereist zijn voor specifieke primersets en target histon-gen.
  3. Verwerking van PCR producten
    1. Run 20 ui van elke reactie op een 0,8% TBE agarosegel.
    2. Beoordeelt de grootte van de PCR producten met behulp van DNA standaarden als referentie om te bepalen of de URA3 gen succesvol is vervangen door de vermeende gemuteerde histon-gen (zie Representatieve resultaten voor een voorbeeld).
      Opmerking: In sommige gevallen, de gewenste mutatie (s) die in de histone genen ofwel creëren of te vernietigen beperking zittene. Als dit het geval is, kan de aanwezigheid van de gewenste mutatie in de PCR-producten van de grootte indicatief juist mogelijk worden beoordeeld door het onderwerpen van de producten aan digestie met de overeenkomstige restrictie-enzym, gevolgd door gel-elektroforese analyse (zie Representatieve resultaten voor een voorbeeld) .
    3. Betreft PCR producten van de grootte indicatief juist mogelijk om DNA-sequentiebepaling om de aanwezigheid van de gewenste mutatie (s) bevestigen en dat er geen aanvullende mutaties zijn geïntroduceerd in het genoom.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We beschrijven het genereren van een hht2 allel tot expressie histon H3 mutant eiwit herbergen een substitutie op positie 53 van een arginine naar een glutaminezuur (H3-R53E mutant) als een representatief voorbeeld van de beoogde in situ mutagenese strategie.

We genereerden een stam waarin het gehele ORF van HHT2 wordt vervangen door de URA3-gen (zie stap 1 van het protocol). Deze stam, yAAD...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hoge sequentie homologie tussen de twee niet-allelische genen die coderen voor elk van de vier kern histon eiwitten in S. cerevisiae haploïde cellen een uitdaging voor onderzoekers die willen specifiek op een van de twee genen voor mutagenese kan vertegenwoordigen. Eerder beschreven gist mutagenese methoden, waaronder Delitto Perfetto, plaatsspecifieke genomische (SSG) mutagenese en kloneren vrij-PCR-allel vervangingsmethoden 5, 6,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

We bedanken Reine Protacio voor de nuttige opmerkingen tijdens de voorbereiding van dit manuscript. We danken de National Science Foundation (subsidienummers 1243680 en 1613754) en het Hendrix College Odyssey-programma voor de financiële ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 kb DNA Ladder (DNA standards)New England BioLabsN3232L
Agarose SigmaA5093-100G
BoriumzuurSigmaB0394-500G
dNTP mix (10 mM elk)ThermoFisher ScientificR0192
EDTA-oplossing (0,5 M, pH 8,0)AmericanBioAB00502-01000
Ethanol (200 Proof)Fisher Scientific16-100-824
Ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat (EDTA)SigmaE4884-500G
Lithiumacetaat dihydraatSigmaL6883-250G
MyCycler Thermal CyclerBioRad170-9703
Poly(ethyleenglycol) (PEG)SigmaP3640-1KG
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase)  en 5x bufferFisher Scientific50-443-960
Salmon sperm DNA-oplossingThermoFisher Scientific15632-011
Sigma 7-9 (Tris-base, poedervorm)SigmaT1378-1KG
Natriumacetaat trihydraatSigma236500-500G
Supra Sieve GPG Agarose (low metting temperature agarose)AmericanBioAB00985-00100
Taq-polymerase en 10x-bufferNew England BioLabsM0273X
ToothpicksFisher ScientificS67859
Tris-HCl (1 M, pH 8,0)AmericanBioAB14043-01000
a-D(+)-GlucoseFisher ScientificAC170080025voor gistmedia
AgarFisher ScientificDF0140-01-0voor gistmedia
PeptoneFisher ScientificDF0118-07-2voor YPD-medium
GistextractFisher ScientificDF0127-17-9voor YPD-medium
4-aminobenzoëzuurSigmaA9878-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
AdenineSigmaA8626-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
Glycine hydrochlorideSigmaG2879-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-AlanineSigmaA7627-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-Arginine monohydrochlorideSigmaA5131-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-Asparagine monohydraatSigmaA8381-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-Asparaginezuur natriumzout monohydraatSigmaA6683-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-Cysteïne hydrochloride monohydraatSigmaC7880-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-Glutaminzuur hydrochlorideSigmaG2128-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-GlutamineSigmaG3126-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-Histidine monohydrochloride monohydraatSigmaH8125-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-IsoleucineSigmaI2752-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-LeucineSigmaL8000-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-Lysine monohydrochlorideSigmaL5626-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-MethionineSigmaM9625-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-PhenylalanineSigmaP2126-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-ProlineSigmaP0380-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-SerineSigmaS4500-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-ThreonineSigmaT8625-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-TryptophaneSigmaT0254-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-TyrosineSigmaT3754-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
L-ValineSigmaV0500-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
myo-InositolSigmaI5125-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
UracilSigmaU0750-100Gvoor compleet minimaal dropout-medium 
AmmoniumsulfaatFisher ScientificA702-500voor compleet minimaal dropout-medium 
Yeast Nitrogen BaseFisher ScientificDF0919-07-3voor compleet minimaal dropout-medium 
5-Fluoroorotinezuur (5-FOA)AmericanBioAB04067-00005voor  5-FOA-medium

Referenties

  1. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  2. Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
  3. Rando, O. J., Winston, F. Chromatin and transcription in yeast. Genetics. 190 (2), 351-387 (2012).
  4. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  5. Storici, F., Resnick, M. A. Delitto perfetto targeted mutagenesis in yeast with oligonucleotides. Genet Eng (N Y). 25, 189-207 (2003).
  6. Gray, M., Kupiec, M., Honigberg, S. M. Site-specific genomic (SSG) and random domain-localized (RDL) mutagenesis in yeast. BMC Biotechnol. 4, 7(2004).
  7. Erdeniz, N., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Cloning-free PCR-based allele replacement methods. Genome Res. 7 (12), 1174-1183 (1997).
  8. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
  9. Lundblad, V., Hartzog, G., Moqtaderi, Z. Manipulation of cloned yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  10. Hoffman, C. S. Preparation of yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  11. Treco, D. A., Lundblad, V. Preparation of yeast media. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  12. Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J Bacteriol. 63 (3), 399-406 (1952).
  13. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  14. Johnson, P., et al. A systematic mutational analysis of a histone H3 residue in budding yeast provides insights into chromatin dynamics. G3 (Bethesda). 5 (5), 741-749 (2015).
  15. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  16. Cross, S. L., Smith, M. M. Comparison of the structure and cell cycle expression of mRNAs encoded by two histone H3-H4 loci in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 8 (2), 945-954 (1988).
  17. Libuda, D. E., Winston, F. Amplification of histone genes by circular chromosome formation in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 443 (7114), 1003-1007 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Gerichte mutagenesePCR-homologe recombinatieendogene genomische lociURA3-knock-outfusie-PCR5-FOA-screeningEcoR1-digestiegistgenetica-technieken
gerichte
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.