gerichte<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese van histon genen in gist

Samenvatting

Een strategie voor het genereren van mutaties in histongenen op hun endogene locatie in Saccharomyces cerevisiae wordt gepresenteerd.

Samenvatting

We beschrijven een op PCR en homologe recombinatie gebaseerd systeem voor het genereren van gerichte mutaties in histongenen in knopvormende gistcellen. De resulterende mutante allelen bevinden zich op hun endogene genomische plaatsen en er worden geen exogene DNA-sequenties achtergelaten in het genoom na de procedure. Aangezien in haploïde gistcellen elk van de vier kernhiston-eiwitten wordt gecodeerd door twee niet-allelele genen met sterk homologe open leesframes (ORF's), kan het targeten van mutagenese specifiek naar een van de twee genen die een bepaald histon-eiwit coderen problematisch zijn. De strategie die we hier beschrijven omzeilt dit probleem door gebruik te maken van sequenties buiten, in plaats van binnen, de ORF van de doelgenen voor de homologe recombinatiestap. Een ander kenmerk van dit systeem is dat de DNA-regio's die de homologe recombinatieprocessen aansturen zeer uitgebreid kunnen worden gemaakt, waardoor de kans op succesvolle integratie-gebeurtenissen toeneemt. Deze kenmerken maken deze strategie bijzonder geschikt voor histongenen mutagenese, maar kunnen ook worden aangepast voor mutagenese van andere genen in het gistgenoom.

Inleiding

De vier kern histon-eiwitten H2A, H2B, H3, H4 en spelen een centrale rol in de verdichting, organisatie en functie van eukaryote chromosomen. Twee sets van elk van deze histonen vormen de histon octameer, een moleculaire spoel dat de verpakking van ~ 147 basenparen van DNA rond zichzelf richt, uiteindelijk resulterend in de vorming van een nucleosoom ^1. Nucleosomen actief deel aan een verscheidenheid van chromosoom processen, zoals de regulering van gentranscriptie en de vorming van heterochromatine en euchromatine in chromosomen, en als zodanig zijn de focus van intens onderzoek in de loop van de afgelopen decennia. Een aantal mechanismen bes....

Protocol

OPMERKING: De experimentele strategie voor gerichte in situ mutagenese histon-gen omvat verschillende stappen (samengevat in figuur 1). Deze stappen omvatten: (1) Vervanging van het doel histon-gen het URA3-gen, (2) Productie en zuivering van PCR-producten die overeenkomen met twee gedeeltelijk overlappende fragmenten van het doel histon-gen onder toepassing van primers die het op gewenste mutatie (s), (3 ) Fusion PCR van de twee gedeeltelijk overlappende fragmenten volledige grootte PCR producten te verkrijgen voor integratie, (4) Co-transformatie van volledige grootte PCR producten en ruggengraat plasmide en selectie voor markerin....

Resultaten

We beschrijven het genereren van een hht2 allel tot expressie histon H3 mutant eiwit herbergen een substitutie op positie 53 van een arginine naar een glutaminezuur (H3-R53E mutant) als een representatief voorbeeld van de beoogde in situ mutagenese strategie.

We genereerden een stam waarin het gehele ORF van HHT2 wordt vervangen door de URA3-gen (zie stap 1 van het protocol). Deze stam, yAAD.......

Discussie

De hoge sequentie homologie tussen de twee niet-allelische genen die coderen voor elk van de vier kern histon eiwitten in S. cerevisiae haploïde cellen een uitdaging voor onderzoekers die willen specifiek op een van de twee genen voor mutagenese kan vertegenwoordigen. Eerder beschreven gist mutagenese methoden, waaronder Delitto Perfetto, plaatsspecifieke genomische (SSG) mutagenese en kloneren vrij-PCR-allel vervangingsmethoden ^{5, 6,}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 kb DNA Ladder (DNA standards)	New England BioLabs	N3232L
Agarose	Sigma	A5093-100G
Boriumzuur	Sigma	B0394-500G
dNTP mix (10 mM elk)	ThermoFisher Scientific	R0192
EDTA-oplossing (0,5 M, pH 8,0)	AmericanBio	AB00502-01000
Ethanol (200 Proof)	Fisher Scientific	16-100-824
Ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat (EDTA)	Sigma	E4884-500G
Lithiumacetaat dihydraat	Sigma	L6883-250G
MyCycler Thermal Cycler	BioRad	170-9703
Poly(ethyleenglycol) (PEG)	Sigma	P3640-1KG
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase)  en 5x buffer	Fisher Scientific	50-443-960
Salmon sperm DNA-oplossing	ThermoFisher Scientific	15632-011
Sigma 7-9 (Tris-base, poedervorm)	Sigma	T1378-1KG
Natriumacetaat trihydraat	Sigma	236500-500G
Supra Sieve GPG Agarose (low metting temperature agarose)	AmericanBio	AB00985-00100
Taq-polymerase en 10x-buffer	New England BioLabs	M0273X
Toothpicks	Fisher Scientific	S67859
Tris-HCl (1 M, pH 8,0)	AmericanBio	AB14043-01000
a-D(+)-Glucose	Fisher Scientific	AC170080025	voor gistmedia
Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	voor gistmedia
Peptone	Fisher Scientific	DF0118-07-2	voor YPD-medium
Gistextract	Fisher Scientific	DF0127-17-9	voor YPD-medium
4-aminobenzoëzuur	Sigma	A9878-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
Adenine	Sigma	A8626-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
Glycine hydrochloride	Sigma	G2879-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Alanine	Sigma	A7627-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Arginine monohydrochloride	Sigma	A5131-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Asparagine monohydraat	Sigma	A8381-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Asparaginezuur natriumzout monohydraat	Sigma	A6683-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Cysteïne hydrochloride monohydraat	Sigma	C7880-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Glutaminzuur hydrochloride	Sigma	G2128-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Glutamine	Sigma	G3126-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Histidine monohydrochloride monohydraat	Sigma	H8125-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Isoleucine	Sigma	I2752-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Leucine	Sigma	L8000-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Lysine monohydrochloride	Sigma	L5626-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Methionine	Sigma	M9625-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Phenylalanine	Sigma	P2126-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Proline	Sigma	P0380-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Serine	Sigma	S4500-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Threonine	Sigma	T8625-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Tryptophane	Sigma	T0254-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Tyrosine	Sigma	T3754-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
L-Valine	Sigma	V0500-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
myo-Inositol	Sigma	I5125-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
Uracil	Sigma	U0750-100G	voor compleet minimaal dropout-medium
Ammoniumsulfaat	Fisher Scientific	A702-500	voor compleet minimaal dropout-medium
Yeast Nitrogen Base	Fisher Scientific	DF0919-07-3	voor compleet minimaal dropout-medium
5-Fluoroorotinezuur (5-FOA)	AmericanBio	AB04067-00005	voor  5-FOA-medium