Hier beschrijven we een 4-traps protocol om menselijke embryonale stamcellen te differentiëren naar NKX6-1 + alvleesklier voorlopercellen in vitro. Dit protocol kan worden toegepast op een verscheidenheid van humane pluripotente stamcellijnen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Efficiënte Differentiatie van pluripotente stamcellen tot NKX6-1
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Pluripotente stamcellen hebben het vermogen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren naar meerdere lijnen, waardoor ze een aantrekkelijk bron voor het genereren van pancreatische voorlopercellen die kunnen worden gebruikt voor de studie en de verwachte behandeling van diabetes. Dit artikel schetst een viertraps differentiatie protocol ontwikkeld om pancreas stamcellen uit menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) te genereren. Dit protocol kan worden toegepast op verschillende humane pluripotente stamcellen (HPSC) lijnen. De aanpak van de pancreas voorlopercellen te genereren is om hESCs om nauwkeurig te modelleren belangrijke stadia van ontwikkeling van de alvleesklier te onderscheiden. Dit begint met de inductie van de definitieve endoderm, hetgeen wordt bereikt door de cellen te kweken in aanwezigheid van activine A, basische fibroblastgroeifactor (bFGF) en CHIR990210. Verdere differentiatie en patroonvorming met fibroblast groeifactor 10 (FGF10) en Dorsomorphin genereert cellen die lijkt op de achterste voordarm. De toevoeging van Retinzuur, NOGGIN, SANT-1 en FGF10 onderscheidt achterste voordarm cellen in cellen kenmerk van de alvleesklier endoderm. Tenslotte is de combinatie van epidermale groeifactor (EGF), nicotinamide en NOGGIN leidt tot efficiënte productie van Pdx1 + / + cellen NKX6-1. Flowcytometrie wordt uitgevoerd om de expressie van specifieke markers te bevestigen op cruciale fasen van ontwikkeling van de alvleesklier. De Pdx1 + / + NKX6-1 pancreatische voorlopercellen aan het einde van trap 4 kunnen genereren rijpe β cellen na transplantatie in immunodeficiënte muizen en kunnen verder worden gedifferentieerd tot insuline producerende cellen in vitro te genereren. Zo is de efficiënte productie van Pdx1 + / + NKX6-1 pancreatische voorlopercellen, zoals aangetoond in dit protocol, is van groot belang omdat het een platform voor humane pancreatische ontwikkeling worden bestudeerd in vitro en een bron van cellen met de potentie om te differentiëren β cellen die kunnen eventually worden gebruikt voor de behandeling van diabetes.
Inleiding
De prevalentie van diabetes neemt toe en volgens de Canadese Diabetes Association, wordt geschat dat meer dan 11 miljoen mensen in Canada zijn diabetes of prediabetes, met 5-10% van deze individuen met type 1 diabetes (type 1 diabetes) 1. T1D een auto-immuunziekte die wordt veroorzaakt door de vernietiging van de insulineproducerende β cellen die zich binnen de eilandjes van Langerhans. Op dit moment, mensen die leven met T1D vereisen exogene bronnen van insuline 2. Ondanks de vooruitgang in insulinetherapie, T1D patiënten nog steeds een moeilijke tijd reguleren van hun bloedsuikerspiegel en blijven zowel hypo- en hyperglycemie lijden. Een veelbelovende vorm van behandeling te herstellen normoglycemia in T1D is het gebruik van menselijke embryonale stamcellen (hESCs), die kan worden gebruikt voor een onbeperkte hoeveelheid insulineproducerende β-cellen zowel in vivo als in vitro genereren 3, 4, 5, 6, 7. Differentiatie hESCs aan P-achtige cellen kan het mogelijk maken om diabetes te bestuderen in vitro, waardoor de identificatie van nieuwe therapeutische doelen voor type 2 diabetes en zorgen cellen voor transplantatie in patiënten T1D.
De meest succesvolle poging tot het genereren insulineproducerende cellen van hESCs in vitro is de embryonale events tijdens ontwikkeling van de alvleesklier 4, 5 recapituleren. Dit omvat de manipulatie van verschillende signaalwegen nauwkeurig modelleren belangrijke fasen van de ontwikkeling van de alvleesklier. Pancreatische ontwikkeling begint bij de inductie van de definitieve endoderm, die wordt gekenmerkt door de expressie van CXCR4 en CD117 (c-KIT) 8, 9. Nauwkeurige regeling van Definitive endoderm organisatie is nodig voor de vorming van de darm buis, die vervolgens ondergaat anterior naar posterior en ventrale patroonvorming dorsale. De dorsale en ventrale alvleesklier knoppen komen uit het gebied van de achterste voordarm dat de pancreas en duodenale homeobox gen (Pdx1), die noodzakelijk zijn voor ontwikkeling van de alvleesklier 10 is uitdrukt. De dorsale en ventrale knoppen zekering aan de alvleesklier, die vervolgens ondergaat uitgebreide epitheliale verbouwing en uitbreiding 11 te vormen. Betrokkenheid bij de endocriene en exocriene lineage vergezeld door het genereren van multipotente progenitorcellen (MPL) dat expressie onder meer de transcriptiefactoren Pdx1, Nkx6.1 en Ptf1a 12, 13. Mediterrane partnerlanden die endocriene en ductale cellen zullen worden blijven Nkx6-1 te drukken terwijl het verminderen van Ptf1a expressie. In tegenstelling tot deze, zal exocriene lineage cellen verliezen expression van Nkx6-1 en Ptf1a expressie 12 te handhaven.
De transcriptiefactor Nkx6-1 een sleutelrol in pancreatische ontwikkeling, met name tijdens de differentiatie van endocriene voorlopercellen cellen P. Zoals eerder beschreven, deletie van Nkx6-1 leidt tot verminderde vorming van β cellen gedurende ontwikkeling van de alvleesklier 14. Derhalve genereren insulineproducerende β-cellen zowel in vitro en in vivo is een efficiënte inductie van Nkx6-1.
We hebben onlangs een protocol om efficiënt te genereren Pdx1 + / NKX6-1 + alvleesklier voorlopercellen uit hPSCs ontwikkeld. Deze HPSC-afgeleide pancreas voorlopercellen te genereren rijpe β cellen na transplantatie in immunodeficiënte muizen 3. De differentiatie protocol kan worden verdeeld in 4 fasen karakteristiek: 1) definitieve endoderm inductie, 2) achterste voordarm patroonvorming 3) pancreas specificatie en 4) NKX6-1 inductie. Hier hebben wij een gedetailleerde beschrijving van elke stap van de gerichte differentiatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van de Solutions en Media
OPMERKING: Bereid alle media voor celkweek in een steriele omgeving. Media worden gemaakt en direct gebruikt. Reagens details vindt u in de Materials tabel.
- differentiatie Media
- Bereid Day 0 Differentiatie Media: RPMI Medium met 1% glutamine, 2 uM CHIR 99.021, 100 ng / ml activine A, 10 4 M MTG.
- Bereid Dag 1-2 Differentiatie Media: RPMI medium met 1% glutamine, 100 ng / ml activine A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 ug / ml ascorbinezuur.
- Bereid Dag 3-5 Differentiatie Media: RPMI Medium met 1% glutamine, 1% B27, 10 4 M MTG, 0,75 uM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.
- Bereid Dag 6-7 Differentiatie Media: DMEM met 1% glutamine, 1% B27, 50 ug / ml ascorbinezuur, 50 ng / ml FGF10, 0,25 pM SANT-1, 2 uM retinoïnezuur, 50 ng / ml NOGGIN.
LET OP: RetinoicAcid moet als laatste aan de media worden toegevoegd en de media moeten worden beschermd tegen het licht tot oxidatieve afbraak 15 te voorkomen. - Bereid Dag 8-12 Differentiatie Media: DMEM met 1% glutamine, 1% B27, 50 ug / ml ascorbinezuur, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml hEGF, 10 mM nicotinamide.
- Bereid FACS-buffer: 10% FBS in PBS, minus calcium en magnesium.
2. MES Differentiatie
OPMERKING: MES ontdooid, doorgekweekt en breidde bestraalde muis embryonale fibroblasten in de aanwezigheid van een KOSR-gebaseerde media aangevuld met bFGF 16. HESCs zijn klaar voor differentiatie wanneer de cellen te bereiken 80-95% samenvloeiing. Op dit moment moet de kolonies groot met gedefinieerde randen en een 'koepelvormige' structuur (Figuur 1A) zijn. Alle celkweek wordt uitgevoerd in vlakke bodem, met weefselkweek behandelde platen bekleed met 0,1% gelatine. Gewoonlijk worden de cellen gekweekt in 6 of12-well platen, in media volumina van 2 ml of 1 ml.
- Op dag 0, beginnen differentiatie door vervanging van de KOSR-gebaseerde media met dag 0 Differentiatie media.
- Op dagen 1 en 2, schud de plaat dode cellen van de monolaag verwijderen voordat aspireren. Vervang de Dag 1-2 Differentiatie Media.
- Op dag 3, oogst cellen voor flowcytometrie. Als de cellen brengen meer dan 90% CXCR4 + / CD117 +, ga dan naar stap 2.4.
- Op dagen 3 en 5, schud de plaat dode cellen van de monolaag voorafgaand aan opzuigen verwijderen. Vervang de Dag 3-5 Differentiatie Media.
- Op dagen 6 en 7 vervangen met dag 6-7 Differentiatie media.
- Op dagen 8, 10 en 12, vervangen Dag 8-12 Differentiatie media.
- Op dag 13, oogst cellen voor flowcytometrie te Pdx1 en NKX6-1 expressie te bepalen.
3. Oogsten Cellen voor Flowcytometrieanalyse
- Distantiëren cellen met1x commerciële trypsine oplossing volgens protocol van de fabrikant en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 min.
- Verwijder commerciële trypsine-oplossing en resuspendeer enkele cellen in 1000 pi FACS buffer met 30 ul DNase I.
- Filter cellen met behulp van een 35 um nylon mesh cel zeef en overbrengen in een microcentrifugebuis.
- Centrifugeer cellen bij 455 xg gedurende 5 minuten. Bereid je cellen voor live of vaste vlekken.
4. kleuring voor flowcytometrie
- Flow voorbereiding voor levende kleuring op dag 3
- Resuspendeer cellen in 1000 pi FACS buffer. Transfer 200 pi (ongeveer 1-3 x 10 5 cellen) in twee putjes van een 96-well plaat (zowel ongekleurd en gekleurd monsters).
- Centrifugeer de plaat bij 931 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat.
- Vlek met primaire-geconjugeerde antilichamen, CXCR4: APC en CD117: PE (zie M aterialen Table) voor 30 min bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
- Centrifugeer de plaat bij 931 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat.
- Resuspendeer monsters in 100 gl FACS buffer.
- Centrifugeer de plaat bij 931 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat.
- Resuspendeer elk monster en in een totaal volume van 300-500 gl FACS buffer aan 1 ml micro reageerbuizen of 5 ml rondbodem buizen.
- Run monsters op de flowcytometer 17. Indien monsters niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd, op te slaan bij 4 ° C beschermd tegen licht.
- Flow voorbereiding vaste kleuring op dag 13
- Resuspendeer de celpellet in commerciële fixatie / permeabilisatie oplossing gedurende 24 uur bij 4 ° C.
- Centrifugeer het monster bij 455 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer in 400 ul Perm / wasoplossing.
- Transfer 200 ul van het monster (ongeveer 0,5-1 x 10 6 cellen) aan two putjes van een 96-well plaat (IgG controle en Pdx1 / NKX6-1 kleuring). Centrifugeer bij 931 xg gedurende 2 minuten.
- Resuspendeer de celpellets in 100 gl Perm / Wash oplossing die anti-Pdx1 en anti-NKX6-1 primaire of isotype controle antilichamen (zie Materialen tabel). Incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Centrifugeer de plaat bij 931 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat. Resuspendeer monsters in 100 ul Perm / wasoplossing.
- Centrifugeer de plaat bij 931 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat.
- Resuspendeer de monsters in 100 ul Perm / Wash met secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur beschermd tegen licht.
- Centrifugeer de plaat bij 931 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat.
- Resuspendeer monsters in 100 ul Perm / Wash Solution.
- Centrifugeer de plaat bij 931 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat.
- Repeet stap 4.2.9 en 4.2.10.
- Resuspendeer elk monster en in een totaal volume van 300-500 gl FACS buffer aan 1 ml micro reageerbuizen of 5 ml rondbodem buizen.
- Run monsters op de flowcytometer 17. Indien monsters niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd, op te slaan bij 4 ° C beschermd tegen licht.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Efficiënte productie van pancreatische voorlopercellen berust op de juiste groei en behoud van gedifferentieerde cellen, gevolgd door de juiste toevoeging van bepaalde signaalmoleculen tijdens de differentiatie protocol, zoals in het schema in figuur 1A. Op dag 0, moet ongedifferentieerde cellen 80-95% confluent en kolonies moeten gedefinieerde randen (figuur 1A) hebben. Tijdens fase 1, zullen de media waarschijnlijk verschijnen bewolkt sinds celdood is ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Met succes het genereren van NKX6-1 + alvleesklier voorlopers van hPSCs in vitro is gebaseerd op het gebruik van hoge kwaliteit culturen van hPSCs en regisseerde differentiatie met betrekking tot de nauwkeurige regeling van specifieke signaalwegen die sleutel ontwikkelingsstadia regeren tijdens de ontwikkeling van de alvleesklier. Hoewel dit protocol kan worden gebruikt om robuuste expressie van NKX6-1 induceren in een verscheidenheid van HPSC lijnen eerder aangetoond 3 voor e...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit manuscript werd ondersteund door financiering uit de Toronto General en West Foundation en de Banting en Best Diabetes Centre-University Health Network Graduate Award.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Media en cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activine A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbinezuur | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphine | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal bovien serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatine uit varkenshuid | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicilline/Streptomycine | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoïnezuur | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), fenolrood | Life Technologies | 12605-010 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Antilichamen voor stromcytometrie (werkconcentraties) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647-conjugaat (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype controle muis IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype controle geiten IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2.000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
Referenties
- Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
- Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
- Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
- Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
- Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004(2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
