Genoom bewerken en Directed Differentiatie van hPSCs voor ondervragen Lineage Determinanten in Human eilandjes Development

Samenvatting

Protocollen bij HPSC mutant lijnen met behulp van de iCRISPR platform te genereren en om hPSCs in glucose-responsief β-achtige cellen te onderscheiden zijn beschreven. De combinatie van genoom editing-technologie met HPSC gerichte differentiatie biedt een krachtig platform voor de systematische analyse van de rol van de lijn determinanten in de menselijke ontwikkeling en de progressie van de ziekte.

Samenvatting

Ondervragen gen-functie in zelf-vernieuwing en differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) biedt een waardevol platform naar het begrijpen van de menselijke ontwikkeling en het ontleden van ziektemechanismen in een schotel. Om te profiteren van dit potentieel toepassing vereist efficiënte genoom bewerkingsgereedschappen te HPSC mutanten in geassocieerde genen, alsook in vitro differentiatie HPSC protocollen genereren ziekte-relevante celtypen op hun in vivo tegenhangers nauw recapituleren produceren. Een efficiënte genoom-editing platform voor hPSCs genoemd iCRISPR is ontwikkeld door de TALEN-gemedieerde targeting van een Cas9 expressiecassette in de AAVS1 locus. Hier, de protocollen voor het genereren van induceerbare Cas9 HPSC lijnen gebruik van cellen gekweekt in een chemisch gedefinieerd medium en een feeder-toestand als beschreven. Gedetailleerde procedures voor het gebruik van de iCRISPR voor gen knock-out of precieze genetische veranderingen in hPSCs, hetzij door middel van non-homologe end-joining (NHEJ) of via nauwkeurige nucleotideveranderingen met een homologie-gerichte reparatie (HDR) template respectievelijk opgenomen. Deze technische procedures bevatten beschrijvingen van het ontwerp, de productie en transfectie van CRISPR gids RNA (gRNAs); de meting van de CRISPR mutatie snelheid door T7E1 of RFLP assays; en de oprichting en validatie van klonale mutant lijnen. Tenslotte kroniek procedures voor HPSC differentiatie in glucose reagerende pancreas β-achtige cellen door in vivo nabootsen alvleesklier embryonale ontwikkeling. De combinatie van iCRISPR technologie met gerichte HPSC differentiatie maakt het systematisch onderzoek van gen-functie aan ons begrip van de ontwikkeling van de alvleesklier en diabetes ziektemechanismen bevorderen.

Inleiding

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) de mogelijkheid om zowel zichzelf te vernieuwen en aanleiding geven tot alle derivaten van de drie embryonale kiem lijnen. Zij bieden een waardevolle bron voor cel vervangende therapie en de ziekte modelleren door te dienen als een uniek platform om cellulaire processen te herhalen in een menselijke ontwikkelings-context. Ze zijn ook een bron van experimentele cellen voor schaalbare, high-throughput analyse. Toch is de vooruitgang beperkt gebleven als gevolg van twee belangrijke uitdagingen: het gebrek aan efficiënte genetische modificatie gereedschappen en de moeilijkheid in indient het complex embryonale ontwikkelingsstoornis stappen in een cultuur schotel.

Genetische modificatie is een onmisbaar instrument voor bestudering van genfunctie in normale ontwikkeling en ziekte. Hoewel klassieke gene targeting benaderingen via homologe recombinatie hebben bewezen een krachtig instrument om genfunctie te ontleden in muis embryonale stamcellen (mESCs) ^1, deze aanpakis zeer inefficiënt bij toepassing op hPSCs ^{2, 3.} De recente stevige toetreding van programmeerbare, site-specific nucleasen uit de natuur tot gebruik in het laboratorium, met inbegrip van zinkvinger nucleasen (ZFNs), transcriptie-activator-achtige effector nucleasen (Talens), en de geclusterde regelmatig afstand van elkaar korte palindroom herhalingen (CRISPR) / CRISPR-geassocieerde (Cas) systemen ⁴ betekent dat genoom techniek een veel eenvoudiger taak uiteenlopende organismen en cellijnen is geworden, ook in hPSCs. Deze genproducten bewerkingsgereedschappen profiteren van het feit dat chimère nucleasen zoals Cas9 endonuclease een hele reeks genetische modificaties kunnen toestaan ​​door het induceren van dubbelstrengs breuken (DSB's) op precieze locaties, triggering het endogene DNA repair machines ofwel niet-homologe activeren end verbinding (NHEJ) of homologie gerichte reparatie (HDR). Beide mechanismen kunnen worden benut voor genetische manipulatie door het induceren either willekeurige insertie en deletie mutaties (indels; via NHEJ), om frameshift mutaties die gen allelen, of precieze nucleotidesubstituties (via HDR) ongedaan te maken, om de patiënt mutaties voor ziekten bij de mens modelleren herhalen of om een ziekte veroorzaken mutatie voor gentherapie te corrigeren .

CRISPR / Cas-gemedieerde genoom techniek vereist twee componenten: de constante-RNA geleide Cas9 endonuclease die nodig zijn voor DNA-splitsing en een variabel CRISPR RNA (crRNA) en trans-activerende (tracrRNA) duplex dat DNA doelwit herkenning aangeeft. De crRNA / tracrRNA duplex kan worden vervangen door een enkele guide chimeer RNA (gRNA), die zijn gevonden om efficiënter ^{5, 6, 7} werken. Terwijl de CRISPR / Cas9 systeem is aangepast aan de meest experimentele organismen en cellijnen, de levering en expressie van Cas9 en gRNA varieert aanzienlijk en moet verder worden geoptimaliseerd om Achivooravond efficiënte genoom bewerken in tal van systemen zoals hPSCs ^8. Een efficiënte-genoom bewerken platform, iCRISPR, is opgericht in hPSCs ^5. In dit systeem heeft een TALEN gemedieerde benadering gebruikt om beide allelen van het "transgen veilige haven locus" AAVS1 in trans, één allel met een omgekeerde tetracycline gecontroleerde transactivator (M2rtTA) en de andere met een tetracycline responselement targeten (TRE ) het aansturen van de expressie van Cas9 (iCas9) in de hPSCs. In gevestigde klonale lijnen (iCas9 hPSCs), wordt Cas9 sterk tot expressie gebracht met doxycycline behandeling. Ondertussen, vanwege de kleine afmetingen (100 nt), enkelvoudige of meervoudige gRNAs gemakkelijk worden afgeleverd in iCas9 hPSCs met hoge efficiency en kan direct Cas9 voor plaatsspecifieke splitsing, waardoor een efficiënte NHEJ gemedieerde gendisruptie, en HDR-gemedieerde exacte nucleotide modificaties in de aanwezigheid van korte enkelstrengs DNA (ssDNA) donor templates. Het systeem kan iCRISPRgebruikt om een panel van ziekte nabootsen HPSC lijnen met biallele (homozygoot of heterozygoot verbinding) of heterozygote verlies-van-functie mutaties succesvol genereren belangrijke ontwikkelingsgenen ^{5, 9.} Terwijl een aantal groepen efficiënte gen bewerken met behulp van CRISPR / Cas in hPSCs hebben gemeld, het succes blijft beperkt tot een klein aantal technologisch adept laboratoria. De iCRISPR platform biedt een efficiënte en toch eenvoudige oplossing voor routine-gen uitgeven door onderzoekers van verschillende niveaus, en het is al gebruikt in een aantal gepubliceerde studies door onze groep en anderen ^{9, 10, 11, 12.} Deze benadering werd ook verder uitgebreid induceerbare silencing basis van de expressie van ^{dCas9-KRAB-13.}

Samen met de vooruitgang in genoom-editing technologie, zijn belangrijke verbeteringen gerealiseerd in HPSC onderhoud en geregisseerd differentiatie. Cultuur voorwaarden voor hPSCs zijn geëvolueerd van bestraalde muis embryonale fibroblast (iMEF) feeder-afhankelijke aan feeder-vrije omstandigheden op toegezegd extracellulaire matrix componenten, en uit complexe media formuleringen op chemisch gedefinieerde medium omstandigheden ^14. Dergelijke verbeteringen zijn de variabiliteit in hPSCs als gevolg van batch-to-batch verschillen in iMEF voorbereiding en knock-out serum vervanging van onderdelen verminderd, en dus zorgen voor een meer reproduceerbare omgeving voor HPSC differentiatie. Anderzijds verbeterde kennis van signaaltransductiewegen betreffende menselijke embryonale ontwikkeling, alsook ontdekkingen van high-throughput drug screenings, hebben geleid tot verbeterde differentiatie protocollen ^{15, 16, 17, 18.} Deze protocollen nauwer na te bootsen in vivo ontwikkelingsstoornissen stappen en het genereren van celtypen dat hun in vivo tegenhangers nauw recapituleren. Voor HPSC differentiatie in de pancreas geslacht, aanvankelijk protocollen nagebootst vroege ontwikkeling van de alvleesklier relatief goed, maar uiteindelijk gegenereerd polyhormonal β cellen die waren onvolwassen foetale fenotypes en reageerde slecht op glucose stimulatie. Recente ontwikkelingen ^{16, 17, 19, 20} hebben geleid tot de vorming van glucose reagerende pancreas β-achtige cellen, die ons in staat stelt latere gebeurtenissen, zoals de vorming en de verdere rijping van monohormonal β-cellen te onderzoeken.

Hier hebben we detail de toepassing van genoom-gemodificeerde lijnen voor de studie van ontwikkeling van de alvleesklier door het combineren van het iCRISPR systeem met de HPSC-gebaseerde in vitro differentiatie platform richting glucose reagerende pancreatic β-achtige cellen. Deze koppeling van krachtige genoom editing tools met een verbeterde HPSC differentiatie protocol biedt niet alleen de snelheid en de omvang die nodig zijn om de groeiende vraag naar het valideren van de ziekte van causaliteit te ontmoeten, maar ook in staat stelt geavanceerde genetische manipulaties voor verdere mechanistische onderzoek naar transcriptie controle ten grondslag liggen aan de normale ontwikkeling en de ziekte van ⁹ .

Protocol

Dit protocol is gebaseerd op ons werk met HPSC lijnen H1, HUES8 en MEL-1 in het chemisch gedefinieerde en feeder-free voorwaarde (Zie het materiaal en apparatuur Table). Voor andere HPSC lijnen of hPSCs gehandhaafd in verschillende kweekomstandigheden, wordt verdere optimalisatie aanbevolen.

1. HPSC Cultuur in het chemisch gedefinieerde en Feeder-vrij Voorwaarde

1. Pas de HPSC cultuur op de iMEF feeders aan de feeder-vrije toestand. Wanneer ingevroren cellen niet goed overleven als direct teruggewonnen in de feeder-toestand als cellen herstellen in iMEF staat en vervolgens aangepast aan de feeder-vrije toestand.
   Opmerking: In het algemeen duurt 2 doorgangen voor hPSCs gekweekt op iMEF feeders worden aangepast aan de feeder-vrije toestand.
2. Verander het medium elke dag en de passage hPSCs wanneer de cellen ~ 80% confluentie hebben bereikt. In het algemeen passage hPSCs bij ~ 1: 6 - 01:15 verhouding om de 4 - 6 dagen. Voeg 10 pM ROCK-remmer Y-27632 when ontdooien of passage van de cellen.
3. Vóór de hPSCs, voorbekleding kweekschalen enten met 5 ug / ml (1 ml / 10 ^cm2) afgeknotte recombinante menselijke vorm van vitronectine (VTN) gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur (RT). Ook bereiden compleet chemisch gedefinieerde medium door toevoeging van supplement in het basale medium.
4. Verwijder het kweekmedium, was de cellen eenmaal met PBS zonder Ca2 ⁺ en Mg2 ^+, en behandeling van de cellen met 0,5 mM EDTA gedurende ~ 2-5 minuten bij kamertemperatuur.
5. Zuig het EDTA voordat de koloniën hebben losgemaakt. Met zachte pipetteren, dispergeren de HPSC kolonies in kleine stukjes en resuspendeer de cellen in compleet medium.
6. Verzamel de gedissocieerde hPSCs en spin down de cellen bij 200 g gedurende 5 min. Resuspendeer de gepelleteerde hPSCs in het compleet medium en het zaad van de cellen op VTN-gecoate platen.

2. Genereren van iCas9 HPSC Lines

1. Orde en versterken de volgende plasmiden: AAVS1-TALEN-L, AAVS1-TALEN-R, AAVS1-Neo-M2rtTA en AAVS1-Puro-iCas9.
   Opmerking: Om te voorkomen dat onverwachte recombinatiegebeurtenissen Gebruik recombinatie-deficiënte Stbl3 competente cellen voor transformatie en amplificatie van plasmiden bij 30 ° C.
2. Typisch, de voorbereiding van de hPSCs in een 10-cm schaal (~ 1 x 10 ⁷ cellen als ~ 80% confluent) gedurende één targeting experiment.
   OPMERKING: Aangezien elektroporatie veroorzaakt meestal significante celdood en TALEN gemedieerde gen-targeting in de AAVS1 locus vereist antibioticumselectie, een relatief groot aantal cellen moet worden geënt te kunnen doelcellen identificeren. Optimalisatie voor de concentraties van het geneesmiddel wordt aanbevolen voor elke cellijn en elke cultuur staat.
3. Op dag -1, (de dag voor elektroporatie), voeg 10 uM ROCK-remmer tijdens de media veranderen.
4. Op dag 0 (de dag van elektroporatie), bereid VTN beklede platen vooraf.
5. Distantiëren de hPSCs in enkele cellen using 1x dissociatie reagens (zie het materiaal en apparatuur Table). Kort samengevat, verwijder het kweekmedium, was de cellen eenmaal met PBS zonder Ca2 ⁺ en Mg2 ^+, en behandeling van de cellen met 1x dissociatie reagens bij 37 ° C gedurende 3 min ~. Zuig de dissociatie reagens voor de cellen losgemaakt. Met zachte pipetteren, de verspreiding van de hPSCs in een single-cell suspensie in 10,5 ml compleet medium.
6. Neem 0,5 ml celsuspensie aan het aantal cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller te tellen. Pellet de hPSCs bij 200 xg gedurende 5 minuten en suspendeer de cellen in koude (4 ° C) PBS bij 12,5 x 10 ⁶ cellen / ml.
7. Voeg de plasmiden (zie Tabel 1) in 800-ul HPSC suspensie (12,5 x 10 ⁶ cellen / ml) en meng. Breng het mengsel op een 0,4-cm elektroporatie cuvet en houdt op ijs gedurende ~ 5 min.
8. Electroporate de cellen met een elektroporatie systeem 250 V en 500 uF; de tijd constant observed na elektroporatie is typisch 9-13 ms.
9. Na elektroporatie, overdracht van de cellen om een ​​15 ml conische buis met 5 ml voorverwarmd compleet medium. Van cruciaal belang voor een succesvolle targeting: Gebruik gezond prolifererende hPSCs en omgaan met de cellen zeer voorzichtig bij het overbrengen, resuspenderen en plating de cellen na elektroporatie.
10. Pellet de cellen bij 200 g gedurende 5 min. Resuspendeer de cellen in 10 ml compleet medium met 10 pM ROCK inhibitor en plaat 1, 2,5 en 5 x 10 ⁶ cellen op elk van de drie VTN-coated, 10-cm schalen; Dit verzekert dat ten minste één van de platen voldoende kolonies eencellige klonale dichtheid voor colony picking hebben.
11. Op dag 1 (de dag na elektroporatie), wijzigt het medium.
12. Op dagen 2-5, start neomycine selectie wanneer de cellen zijn ~ 60% confluent. Verander het medium elke dag met 500 ug / ml G418 sulfaat; significante celdood als gevolg van Selection wordt meestal waargenomen 2 dagen na G418 selectie.
13. Op dag 6, verander het medium zonder antibioticum selectie.
14. Op dagen 7-9, start puromycineselectie. Verander het medium daags met 1 ug / ml puromycine dihydrochloride; significante celdood moet de volgende dag worden aangehouden.
15. Op dag 10, dag starten waarbij het medium zonder antibioticumselectie tot HPSC eencellige kolonies bereik 1-2 mm in diameter.
    LET OP: Typisch, 50 kolonies in een 10-cm schaal worden waargenomen met 2,5 x 10 ⁶ hPSCs uitgezet op dag 0.
16. Pick 12-24 kolonies onder een stereomicroscoop. Mechanisch splitsen de HPSC kolonies in kleine stukjes (~ 10 stuks per kolonie) met een 23-G naald (een 200-ul pipet tip is prima) en de cellen direct overbrengen naar VTN-gecoate 24-well platen.
17. Verander het medium dagelijks tot de cellen confluent. Passage de cellen in elke well van de 24-well platen induplicaat putjes van platen met 6 putjes.
18. Wanneer de cellen confluent in 6-well platen, gebruikt men ook een bevroren voorraad en andere goed voor genomische DNA-extractie voor verdere karakterisering.
19. Karakteriseren en valideren van de gevestigde iCas9 lijnen met behulp van PCR genotypering, Southern blotting, RT-qPCR analyse, karyotyping en pluripotentie test. Zie Zhu et al. ²¹ voor gedetailleerde experimentele procedures.

3. Productie van HPSC Mutant Lines Met behulp van de iCRISPR System

1. Genereren van HPSC knockout lijnen
   1. gRNA ontwerp en productie
      1. Kies doelgebieden in het gen van belang de mogelijkheid te verstoren wildtype eiwitfunctie maximaliseren. Voor goed geannoteerde genen, kies een doelgebied stroomopwaarts van een wezenlijke functionele domein. Als alternatief ontwerp gRNAs een stroomafwaarts van het startcodon targeten. Minstens 2 verschillenderegio voor een gen van interesse.
      2. Ontwerp gRNAs via het online CRISPR design tool (http://crispr.mit.edu). Voor elke doelgebied, design 3 gRNAs met lage potentiële off-targets en gebruik maken van de degene met de hoogste targeting efficiëntie voor het genereren van klonale mutant lijn ^22.
         Opmerking: Om een ​​hoge efficiëntie genoom bewerken, is het raadzaam om gRNA leveren zoals RNA oligo plaats van plasmide-DNA als gevolg van de hogere transfectie-efficiëntie van kleine RNA vergeleken met plasmiden opgedane ervaring.
      3. Bestellen 120 nucleotiden (nt) DNA oligo's die de T7-promotersequentie, de variabele 20-nt crRNA herkenningssequentie (N) ₂₀ (exclusief de PAM sequentie) en de constante chimere gidssequentie. Verdun de oligo's tot 100 uM voorraad oplossing in DDH ₂ O en voor te bereiden voor 250 nM als werkende oplossing.
         LET OP: TAATACGACTCACTATAGGG (N) ₂₀ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
      4. PCR-amplificeren van de oligo's met de T7F en TracrR primers (zie tabel 2) aan de dubbelstrengs DNA (dsDNA) gRNA template voor in vitro transcriptie (IVT) te produceren. Gebruik 50 ul PCR reactiemengsel (zie tabel 3) en PCR-cyclus (zie tabel 4).
      5. Gebruik een hoge opbrengst T7 transcriptie kit voor in vitro transcriptie gRNA de PCR-geamplificeerde matrijs in 20 pl in vitro transcriptie gRNA mix (zie tabel 5) volgens de instructies van de fabrikant. Zuiver het gRNA producten met de transcriptie clean-up kit volgens instructies van de fabrikant.
      6. Elueer gRNAs na high-throughput zuiveringsprotocol volgens instructies van de fabrikant (meestal ~ 50 - 100 ug) in 100 pl elutiebuffer. Stel de concentratie tot 320 ng / ul (10 uM) indien mogelijk en bewaar bij -80 &# 176; C tot gebruik.
   2. PCR en Sanger sequencing primer ontwerp
      1. Ontwerpen en valideren PCR-primers amplificeren van het doelgebied, met het product maten meestal variërend van ~ 500 - 1000 bp.
      2. Ontwerp Sanger sequencing primers binden intern de PCR producten direct sequencing van de PCR-producten mogelijk zonder zuivering.
   3. gRNA transfectie in iCas9 hPSCs
      1. Op dag -1, behandel iCas9 cellen met 2 ug / ml doxycycline 24 uur voordat gRNA transfectie.
      2. Op dag 0 van gRNA transfectie bereiden VTN-beklede platen van tevoren.
      3. Dissociëren iCas9 cellen in enkele cellen met behulp 1x dissociatie reagens, zoals beschreven in stap 2.5.
      4. Pellet de hPSCs bij 200 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer de cellen op ~ 0,5 x 10 ⁶ cellen / ml in compleet medium aangevuld met 2 ug / ml doxycycline en 10 pM ROCK inhibitor.
      5. Plaat 0,5 ml van de geresuspendeerde cellen in afzonderlijke putjes van 24-wells platen. Bereid extra putten als niet-getransfecteerde controles dienen.
      6. Voor elke gRNA, de volgende transfectie mengsels: Mix A, 50 ul van een verminderde serum medium + 1 pl gRNA (10 uM); Mengsel B, 50 ul gereduceerd serum medium + 3 pi van transfectiereagens.
      7. Combineer Mix A en B tot 100 pi mengsel te maken. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 50 ul van het mengsel aan cellen in duplo van de 24-well platen en meng goed.
      8. Op dag 1, voert een tweede transfectie indien nodig om het richtende efficiëntie verder te verhogen. Anders verandert het medium zonder doxycycline.
      9. Op dagen 2-3, verander het medium dagblad.
      10. Op dag 4, extract genomisch DNA van één putje van elke getransfecteerde en ongetransfecteerde controle cel met behulp van een DNA extractie kit. Stel de concentratie van 50 ng / μL.
      11. PCR-amplificeren van de doelgebieden flankeren het gRNA targeting sequenties en schat de bewerking efficiëntie middels T7 endonuclease I (T7EI) digestie of restrictiefragment (RFLP) analyse, zoals eerder ⁵ beschreven.
   4. T7EI assay
      1. PCR-amplificeren het doelgebied met behulp van de primers ontworpen en gevalideerd in stap 3,1.
      2. Bereid de mengsels (zie Tabel 6) en het uitvoeren van DNA denaturatie en hybridisatie van de PCR producten met behulp van omstandigheden beschreven in Tabel 7.
         LET OP: Op basis van onze ervaring, het is over het algemeen niet nodig om PCR-producten te zuiveren voor de T7EI test bij het gebruik van onze PCR toestand. Echter, zuivering kan gunstig zijn in andere omstandigheden.
      3. Voer een T7EI digestie bij 37 ° C gedurende 30 min met behulp van 10 pi gedenatureerd en gehybridiseerd PCR-product en 0,2 pl (2 U) van T7E1 (10 U / ul).
      4. Resolve de T7E1-geknipte PCR monsters door gelelektroforese. Gebruik ImageJ om de relatieve band intensiteiten van gesneden en ongesneden DNA te bepalen. Bereken de Indel frequentie met de formule: (1 - (√ (1- (b + c)) / (a + b + c))) x 100, waarin a de intensiteit van het gedigesteerde PCR product en b en c de intensiteiten van de T7E1-gesplitste producten.
   5. RFLP test
      LET OP: In gevallen waarin een beperking site is in de directe nabijheid (<5 bp) om een ​​Cas9 splitsingsplaats (3 bp 5 'van de PAM sequentie), kan een RFLP test worden uitgevoerd om de indel frequentie te kwantificeren.
      1. Gebruik dezelfde PCR-producten zoals beschreven in stap 3.1.4.1.
      2. Digereer het PCR-product met een restrictie-enzym dat een restrictie- plaats in de nabijheid van de Cas9 splitsingsplaats bevat.
      3. Scheid de verkregen PCR monsters door gelelektroforese. Gebruik ImageJ om de relatieve band intensiteiten van gesneden en ongesneden DNA te bepalen. Bereken de Indelfrequentie met de formule: a / (a + b + c) x 100, waarin a de intensiteit van het gedigesteerde PCR product en b en c zijn de intensiteiten van de gedigereerde producten.
   6. Oprichting van klonale mutant lijnen
      OPMERKING: Genoom bewerken in hPSCs met het iCRISPR systeem gRNA transfectie is zeer efficiënt en zonder antibioticum selectie nodig. Klonale lijnen stellen, is het noodzakelijk om cellen zaad bij een relatief lage dichtheid op de vorming van eencellige-afgeleide kolonies garanderen.
      1. GRNAs identificeren met de hoogste efficiëntie voor het bewerken (de T7EI of RFLP-bepaling) en met goede celoverleving. Gebruik de bijbehorende duplicate goed voor klonale mutant lijn vestiging.
      2. Distantiëren de hPSCs in een enkele-celsuspensie gebruikt 1x dissociatie reagens, zoals beschreven in stap 2.5. Replate 500, 1000 en 2000 cellen op elk van de drie VTN-coated, 10-cm schalen.
      3. Verander het medium dagelijkse until de single-cell kolonies te bereiken ~ 2 mm in diameter.
      4. Pick 24-48 kolonies per gRNA, afhankelijk van de inschatting van targeting efficiëntie door T7EI en / of RFLP-bepaling. Mechanisch splitsen elke kolonie in kleine stukjes (~ 10 stuks per kolonie) met een 23-G naald (een 200-ul pipet tip is prima) en replate de cellen in duplo VTN beklede, 96 putjes. Gebruik een plaat voor de genomische DNA-extractie en Sanger sequencing en de andere plaat voor verdere expansie.
      5. Wanneer de cellen in 96-well platen confluent zijn geworden, haal de genomisch DNA (zonder fenol / chloroform extractie) met een eenvoudig protocol, zoals hieronder beschreven.
      6. Verwijder het medium en was de cellen eenmaal met PBS zonder Ca2 ⁺ en Mg2 ^+. Voeg 50 ul lysis buffer (5 ul Proteinase K (10 mg / ml), 5 pl 10x PCR-buffer en 40 pl DDH ₂ O) aan elk putje van een 96-wells plaat. Seal de plaat met behulp van een zelfklevende film en incubate nacht bij 55 ° C.
      7. De volgende dag, de overdracht cellysaten in een 96-well PCR plaat en incubeer gedurende 10 minuten bij 99 ° C in een thermocycler met de proteïnase K. inactiveren
      8. PCR-amplificeren het doelgebied met behulp van dezelfde primers als voor de T7EI of RFLP analyse, middels 1 ul cellysaat als een matrijs.
      9. Met 1 pi van het PCR-product Sanger sequentiebepaling met een primer binding intern aan het PCR product.
      10. Versterken de klonen met frameshift indel mutaties voor bevroren voorraden. Ook amplificeren enkele wildtype klonen van dezelfde targeting experiment als isogene besturingslijnen voor verdere experimenten dienen.
2. Generatie van mutante lijnen met nauwkeurige nucleotide veranderingen
   Opmerking: In vergelijking met knockout-mutanten gegenereerd door niet-homologe end-joining (NHEJ), nucleotide verandering kan nauwkeurig worden bereikt door homologie gerichte reparatie (HDR) bij aanwezigheid van DNA repair templates. Dergelijke precieze nucleotideveranderingen oog op het genereren van patiënt-specifieke mutaties in wildtype hPSCs en voor het corrigeren van mutaties intramurale afgeleide iPSCs.
   1. Ontwerp van ssDNA als een HDR-template
      1. Ontwerpen en produceren 2-3 gRNAs in de nabijheid van een patiënt-specifieke mutatie, zoals beschreven in stap 3.1.1.
      2. Ontwerp een enkelstrengs DNA (ssDNA) met de patiënt-specifieke mutatie geflankeerd door ~ 40-80 nt van homologie aan weerszijden als HDR matrijs.
      3. Aanvullende snijden verlagen na de juiste reparatie, introduceren een stille mutatie op de ssDNA template in het gebied in de gRNA herkenningssequentie en in de nabijheid van de PAM sequentie of de PAM sequentie zelf, indien mogelijk.
      4. Indien mogelijk, het ontwerp van de stille mutatie een nieuwe restrictiedigestie ter introduceren en zodat het kan worden gebruikt om de reparatie Efficiëntiemeting via RFLP-bepaling schatten.
   2. GRNA / ssDNA cotransfectie en de oprichting van klonale lijnen
      1. Voer de co-transfectie van gRNA / ssDNA in iCas9 cellen, zoals beschreven in stap 3.1.3, met transfectie mengsels A en B. Voor elke gRNA en ongetransfecteerde controle transfecteren de cellen in duplo putjes van 24-wells platen. Mix A: 50 gl verminderde serum medium + 1 ui gRNA (10 pM) + 2 pi van ssDNA (10 uM). Mix B: 50 gl verminderd serum medium + 3 pi van transfectiereagens.
      2. Na transfectie extract genomisch DNA van één putje van elke getransfecteerde en ongetransfecteerde controlecel en schat de reparatie efficiëntie met de T7EI en / of RFLP-bepaling.
      3. Identificeer de gRNA / ssDNA mengsel met de hoogste herstel efficiëntie en goede overleving cel. Gebruik de bijbehorende duplicate goed voor klonale mutant lijn vestiging.
      4. Pick 48-96 kolonies, afhankelijk van de inschatting van het richtende efficiëntie door T7EI en / of RFLP assay. In het algemeen is het rendement van HDR-gemedieerde mutatie lager dan knockout mutatie en dus meer kolonies moeten worden opgehaald.
      5. Sequence, uit te breiden en te valideren klonale lijnen, zoals beschreven in stap 3.1.6.

4. In Vitro HPSC Differentiatie in glucose-responsief pancreas β-cellen

LET OP: In vitro differentiatie van HPSC mutanten naar de ziekte-relevante celtypen biedt een platform voor de ziekte modelleren in een schotel. Het volgende protocol is gericht op de in vitro differentiatie van hPSCs in glucose reagerende pancreatische β cellen pancreatische ontwikkelings- en diabetici ^{9, 16, 17.}

1. HPSC differentiatie in definitieve endoderm
   1. Handhaaf HPSC mutanten en wild-type controle lijnen in het chemisch gedefinieerde en feeder-vrij staat, zoals beschrevend in stap 1.
   2. Om de hPSCs voor te bereiden op differentiatie, distantiëren de hPSCs behulp 1x dissociatie reagens en verspreiden ze in single-cell suspensie in volledig medium.
   3. Pellet de cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer de cellen in compleet medium met 10 pM ROCK inhibitor. Tel het aantal cellen en zaden de cellen op ~ 1,4 x 10 ⁵ cellen / ^cm2 op VTN beklede platen.
   4. Verander het medium 24 uur na het zaaien.
   5. Op dag 0, begint de differentiatie na 48 uur, wanneer de cellen bereikt ~ 80% confluentie.
      LET OP: Om een ​​hoge alvleesklier differentiatie efficiëntie te bereiken, het optimaliseren van de seeding dichtheid en het niveau van confluentie na 48 uur wordt aanbevolen voor elke afzonderlijke lijn.
   6. Zuig het medium HPSC en eenmaal met PBS Spoel de cellen zonder Ca2 ⁺ en Mg2 ^+.
   7. Verander het medium om differentiatie dag 0 (d0) medium.
   8. Op dag 1-2, verander de dimedium dagelijkse fferentiation volgens de recepten in Tabel 8.
   9. Op dag 3, onderzoekt de definitieve endoderm markers Sox17, FOXA2 en CXCR4 door immunofluorescentie kleuring en flowcytometrie analyse.
2. Definitieve endoderm differentiatie in de pancreas voorlopercellen
   1. Op dagen 3-9, verder definitieve endoderm differentiatie naar de pancreatische afstammingslijn het dagelijkse waarbij het medium volgens de recepten in Tabel 9.
   2. Op dag 7, onderzoekt de vroege pancreas voorlopercellen (PP1) marker Pdx1 door immunofluorescentie kleuring en flowcytometrie analyse.
   3. Op dag 10, onderzoekt de latere pancreas voorlopercellen (PP2) markers Pdx1 en Nkx6.1. Ondertussen bereiden BP2 cellen overbrengen naar air-vloeistof interface voor verdere differentiatie in pancreatische endocriene cellen.
3. Alvleesklier endocriene verschillenentiation in de lucht-vloeistof-interface
   1. Behandel de PP2 cellen met 10 pM ROCK inhibitor 4 uur voordat dissociatie.
   2. Verwijder het medium en eenmaal met PBS Spoel de cellen zonder Ca2 ⁺ en Mg2 ^+.
   3. Voeg 2 ml 1x dissociatie reagens PP2 cellen in een 10-cm schaal en incubeer bij 37 ° C gedurende 2-3 min.
   4. Zuig de dissociatie reagens voor de cellen losgemaakt. Voeg 10 ml Blar medium en de verspreiding van de PP2 cellen in enkele cellen door zachtjes en neer te pipetteren.
   5. Verzamel de single-cell suspensie. Tel het aantal cellen en pellet bij 200 xg gedurende 5 minuten.
   6. Resuspendeer de cel pellet op ~ 0,5 x 10 ⁵ cellen / ul in S5 differentiatie medium en spot 5-10 pi van cellen per vlek op een Transwell insert filter. Plaats 10 - 15 plekken in een 6-well insert en ~ 100 plaatsen in een 10-cm insert.
   7. Voeg S5 medium onderaan elke Transwell insert, ~ 1,5 mL van 6-well inserts en ~ 8 ml fof 10-cm inserts.
   8. Verander het medium per dag bij de recepten in Tabel 10.
   9. Onderzoek pancreatische endocriene markers Pdx1, Nkx6.1 NEUROD1, NKX2.2, insuline, glucagon en op dag 34 door immunofluorescentie kleuring en flow-cytometrie analyse ^17.
   10. Onderzoek HPSC-afgeleide β-achtige celfunctie met een glucose-gestimuleerde insuline secretie (GSIS) test ^{16, 17.}

Resultaten

HPSC chemisch welbepaald en Feeder-vrij Cultuur Adaptation and Maintenance

hPSCs gekweekt op iMEF feeders kan snel worden aangepast VTN beklede platen in de feeder-vrije cultuur aandoening. Dezelfde splitsing verhouding als normaal iMEF feeder cultuur kan worden gebruikt tijdens de adaptatie. Figuur 1A toont typische morfologie van hPSCs op iMEF feeders in KSR gebaseerde medium en een VTN beklede oppervlak feeder-vrij medium. Figuur 1B toont een typische morfologische veranderingen en de groei van HPSC kolonies tijdens de eerste passage van aanpassing (4 dagen). De cellen kunnen verder passage behandelde of bevroren voor toekomstige experimenten. Verricht 2-3 passages van de aanpassing cultuur voordat differentiatie experimenten. Karyotypering wordt ook aanbevolen na aanpassing, hoewel we niet karyotype afwijkingen zijn waargenomen tijdens de aanpassing fase.

"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Het genereren van iCas9 HPSC Lines door middel van TALEN-gemedieerde AAVS1 Targeting

Zoals eerder aangetoond, werd hPSCs geëlektroporeerd met een paar AAVS1 TALEN plasmiden en Cas9 en M2rtTA plasmiden ^5. Figuur 2A en B toont gedetailleerde donor vector richten op het ontwerp en de hele procedure om iCas9 HPSC klonale lijnen te genereren. Na antibiotische selectie, single-cell-afgeleide klonen tonen van voldoende grootte en typische HPSC morfologie waren klaar om te worden opgehaald (10-12 dagen na elektroporatie, figuur 2C). Gewoonlijk ~ 50% van de klonen goed gericht zonder willekeurige integraties, bevestigd door Southern blotting (Figuur 2D) ^5. Willekeurige integratie kan lekke uitdrukking van Cas9 in afwezigheid van doxycycline behandeling.

Efficiënte Genetische Mijziging in hPSCs Met behulp van de iCRISPR Platform

In gevestigde iCas9 hPSCs wordt Cas9 uitgedrukt met doxycycline behandeling en begeleid naar zijn doel locus door de getransfecteerde gRNAs, waar het genereert DSB. Aangezien een reparatie matrijs DNA herstel door middel van NHEJ genereert indels, die vaak leiden tot genverstoring of knockout. In aanwezigheid van een reparatie sjabloon (bijvoorbeeld een ssDNA donor) kan HDR worden voor nauwkeurige genetische veranderingen, zoals het genereren van een patiënt-specifieke mutatie in een wildtype achtergrond HPSC of corrigeren van een ziekte-geassocieerde genetische variant in patiëntspecifieke iPSCs afgeleid (Figuur 3A). Klaar ~ 1 maand tot klonale mutant lijnen met het iCRISPR systeem genereren. Na iCas9 inductie en gRNA transfectie werden T7EI en / of RFLP assays gebruikt om Cas9 scherpe efficiency te beoordelen, en de getransfecteerde cellen werden later gezaaid als enkele cellen in 10-cm schalen bij lage dichtheid (~ 500-2, 000cellen / 10 cm schaal). 10 - 12 dagen later werden afzonderlijke cel afgeleide klonen geplaatst in de putjes van een 96-putjesplaat voor verdere uitbreiding en karakterisering (dwz genotypering en Western blotting) (Figuur 3B). Aangezien de iCRISPR gemedieerde gen knockout is zeer efficiënt, is geen selectieproces betrokken, en meestal 20-50% biallele mutanten kunnen gemakkelijk worden bereikt (figuur 3C) ^5. Efficiënte en nauwkeurige genetische veranderingen, gRNAs worden gecotransfecteerd met ssDNA donor die de specifieke sequentieverandering (voor een kleine, maar specifieke change of genoomsequentie). Vaak voorkomen opnieuw snijden in gemodificeerde allelen, is het raadzaam om een stille mutatie in de nabijheid van of in de PAM sequentie (Figuur 3D) omvatten. Met dit systeem, ~ 10% van klonen die het gewenste HDR-gemedieerde genoom modificatie zonder bijkomende veranderingen in beide allelen worden bereikt (figuur 3E). De snelle en precise modificatie van het HPSC genoom met behulp van de iCRISPR platform stelt ons in staat om snel en efficiënt te maken HPSC lijnen die dienen als modellen voor de studie van de menselijke ontwikkeling en ziekte.

Efficiënte Differentiatie van hPSCs richting Glucose-responsieve β-achtige cellen

Recente vooruitgang in HPSC pancreas differentiatie heeft het mogelijk gemaakt de ontwikkeling van protocollen die nauw recapituleren alvleesklier embryonale ontwikkeling. Ongedifferentieerde hPSCs eerst onderverdeeld in de definitieve endoderm, vervolgens in Pdx1 + vroege pancreatische voorlopercellen (PP1) en Pdx1 + + Nkx6.1 later pancreatische progenitorcellen (PP2) en tenslotte in glucose reagerende β-achtige cellen ^{16, 17, 19, 20 , 23, 24.} deze protocolen werden verder geoptimaliseerd betrouwbaar genereren Pdx1 + + Nkx6.1 alvleesklier progenitoren en glucose reagerende β-achtige cellen ^9. Figuur 4A toont de gedetailleerde chemische supplementen gebruikt in elke fase van differentiatie. Meestal, ~ 80% confluentie 2 dagen na de aanvankelijke cel beplating is ideaal voor het starten van de differentiatie van HUES8 hPSCs (figuur 4B). Het testen van verschillende seeding dichtheden wordt sterk aangeraden om de geoptimaliseerde voorwaarde voor elke specifieke cellijn te ontdekken. Gewoonlijk ten minste 75% FOXA2 + Sox17 + cellen op het voorste fase en 40% Pdx1 + Nkx6.1 + cellen op het PP2 stadium kan worden bereikt (figuur 4C). Voor deze S5 stadium, de aanwezigheid van een aura-achtige vorm rond de cel aggregaat is een indicator voor de goede overleving van de cellen, wat belangrijk is voor verdere differentiatie Nkx6.1 CPEP + + glucose reagerende β-achtige cellen (Figuur 4D ). Dit protocol is nuttig voor het bestuderen van humane pancreatische d evelopment en ziekte in een schotel.

Figuur 1. HPSC chemisch gedefinieerde en Feeder-vrij Onderhoud en Cultuur Aanpassing van iMEF Voeders. (A) Representatieve beelden van hPSCs gekweekt op iMEF feeder of op VTN op dag 4, klaar om te worden gesplitst. (B) Typisch morfologie van hPSCs tijdens de eerste passage van de aanpassing in de feeder-vrije cultuur van een iMEF feeder. Dag 4 hPSCs gekweekt op iMEF feeders werden gesplitst en uitgeplaat op VTN-gecoate platen in chemisch gedefinieerd medium met ROCK-remmer. De splitsingsverhouding was hetzelfde als de gebruikelijke splitsverhouding voor het kweken in iMEF feeder omstandigheden. Het medium werd elke dag veranderd zonder ROCK inhibitor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 2. Genereren van iCas9 HPSC Lines. (A) Targeting strategie voor het genereren van iCas9 HPSC lijnen. Puro-Cas9 donor en Neo-M2rtTA donor waren gericht op de humane locus AAVS1 door een paar AAVS1 talens. (B) Schema's van het hele proces van targeting, waaronder elektroporatie, antibiotische selectie, kolonie plukken en expansie, en cellijn karakteriseren. (C) Representatieve eencellige kloon klaar om te worden opgehaald bij ongeveer 10 - 12 dagen na elektroporatie. (D) Southern blot voorbeelden voor het identificeren van correct gerichte klonen zonder extra integratie van twee donorplasmiden. Correcte klonen zijn rood gemarkeerd. (A) en (D) zijn overgenomen van referentie 5, met toestemming.ig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Efficiënte Genetische Modificatie in hPSCs Met behulp van de iCRISPR System. (A) Schema voor het genereren van gen knockout mutanten of nauwkeurigere genmodifcatie met het iCRISPR systeem. (B) Targeting procedure en de klonale lijn vestiging. (C) Gene knockout efficiëntie door NHEJ in hPSCs ^9. (D) Het ontwerpen van een ssDNA met een specifieke nucleotide modificatie. P, in het rood: de patiënt-specifieke mutatie; X, in het groen: stille mutatie. (E) Efficiëntie van de HDR-gemedieerde precieze nucleotide modificatie. Een nauwkeurige R456C mutatie (veroorzaakt door een specifieke nucleotide C> T-mutatie) in GATA6 locus werd opgenomen waarbij het iCRISPR systeem.(Zie Referentie 5 voor meer informatie). (C) en (E) zijn overgenomen van respectievelijk Referentie 9 en referentie 5, met machtigingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Directed HPSC Differentiatie in glucose-responsief pancreas β-achtige cellen. (A) Schema van de gedetailleerde differentiatie protocol, aangevuld met chemicaliën in elk stadium van differentiatie. Signaalwegen die worden geactiveerd of geremd tijdens differentiatie zijn gemarkeerd in groen of rood, respectievelijk. CHIR: GSK3 remmer; GDF8: groei differentiatie factor 8 of myostatine, een TGF-beta eiwit familielid; HH: Egel; DE: Definitieve endoderm; PP1:Pdx1 + vroege pancreas voorlopercellen; PP2: Pdx1 + Nkx6.1 + later pancreas voorlopercellen. (B) Typisch confluentie (70-80%) van hPSCs 48 uur na het zaaien als je klaar bent voor differentiatie initiatie. (C) Representatieve immunofluorescentiekleuring beelden die de succesvolle differentiatie in de definitieve endoderm (DE) fase (FOXA2 en Sox17 co-kleuring), pancreatische voorlopercellen fase (PP2: Pdx1 en Nkx6.1 co-kleuring) en glucose reagerende β- zoals mobiele fase (Nkx6.1 en C-peptide co-kleuring). In het algemeen meer dan 10% Nkx6.1 + CPEP + cellen bereiken de β-achtige cellig stadium, ten minste 75% FOXA2 + Sox17 DE + cellen en 40% Pdx1 + + Nkx6.1 PP2 cellen moeten op de overeenkomstige fasen. (D) Typisch morfologie van een cel aggregaat in de S5 stadium op een insert filter membraan in de lucht-vloeistof-interface cultuur. De overlevende cellen zijn gemigreerd naar het midden van het aggregaat (donker) en liet een aura structuur aan de rand. (A ) en (D) werden overgenomen van Reference 9 met toestemmingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

plasmide	Bedrag
AAVS1-TALEN-L	5 ug
AAVS1-TALEN-R	5 ug
AAVS1-Puro-iCas9	40 ug
AAVS1-Neo-M2rtTA	40 ug

tafel 1

grondverf	Volgorde
T7F	TAATACGACTCACTATAGGG
TracrR	AAAAGCACCGACTCGGTGCC

tafel 2

bestanddeel	Bedrag
DDH 2 O	35,5 pl
5x PCR reactiebuffer	10 pi
dNTP mix (25 mM)	0,5 pl
T7F (10 uM)	1,25 pi
TracrR (10 uM)	1,25 pi
T7-gRNA IVT template (250 nm)	1 pi
DNA polymerase	0,5 pl
Totaal PCR-mix	50 ul

tabel 3

PCR fietsen voorwaarden
cyclus nummer	denatureren	temperen	Uitbreiden
1	94 ºC, 2 min
31/02	94 ºC, 20 s	60 ºC, 20 s	72 ºC, 1 min
32			72 ºC, 2 min

tabel 4

bestanddeel	Bedrag
T7 ATP	2 pi
T7 CTP	2 pi
T7 GTP	2 pi
T7 UTP	2 pi
T7 10x buffer	2 pi
T7 enzymmengsel	2 pi
PCR geamplificeerd template	8 pi
Total in vitro gRNA transcriptie mix	20 gl
Incubeer bij 37 ° C gedurende 6 uur 's nachts

tabel 5

bestanddeel	Bedrag (pl)
Ongezuiverde PCR Product	8
Buffer 2 10x	2
Gedestilleerd water (dH 2 O)	10

tabel 6

DNA denaturatie en hybridisatie fietsen omstandigheden
Temperatuur	Looptijd	thermocycler omstandigheden
95 ° C	10 minuten
85 ° C	1 minuut	Geleidelijk naar 85 ° C bij 2 ° C / s
75 ° C	1 minuut	Geleidelijk naar 75 ° C bij 0,3 ° C / s
65 ° C	1 minuut	Geleidelijk naar 65 ° C bij 0,3 ° C / s
55 ° C	1 minuut	Geleidelijk naar 55 ° C bij 0,3 ° C / s
45 ° C	1 minuut	Geleidelijk naar 45 ° C bij 0,3 ° C / s
35 ° C	1 minuut	Geleidelijk naar 35 ° C bij 0,3 ° C / s
25 ° C	1 minuut	Geleidelijk naar 25 ° C bij 0,3 ° C / s
4 ° C	Houden

tabel 7

Stadium	Dag	Media	Supplement
S1	d0	S1	GDF8 100 ng / mL	CHIR-99021 3 uM
	d1	S1	GDF8 100 ng / mL	CHIR-99021 0,3 uM
	d2	S1	GDF8 100 ng / mL
S1 media: MCDB 131 + 1x L-glutamine supplement + 0,5% BSA + 1,5 g / l NaHCO3 + 10 mM Glucose

tabel 8

Stadium	Dag	Media	Supplement
S2	d3-d4	S1	LAA 0,25 mM	FGF7 50 ng / mL	IWP-2 2,5 uM
S3	d5-d6	S3	LAA 0,25 mM	FGF7 50 ng / mL	SANT-1 0,25 uM	RA 1 uM	LDN 100 nM	TPB 200 nM	ITS-X 1: 200
S4	d7-d9	S3	LAA 0,25 mM	FGF7 2 ng / mL	SANT-1 0,25 uM	RA 0,1 uM	LDN 200 nM	TPB 100 nM	ITS-X 1: 200	IWP-2 2,5 uM
S3 media: MCDB 131 + 1x L-glutamine supplement + 2% BSA + 2,5 g / l NaHCO3 + 10 mM Glucose

tabel 9

Stadium	Dag	Media	Supplement
S5	d10-d12	S5	T3 1 uM	ALK5i II 10 uM	SANT-1 0,25 uM	RA 0,05 uM	LDN 100 nM	ITS-X 1: 200	ZnSO4 10 uM	Heparine 10 ug / mL
S6	D13 d19	S5	T3 1 uM	ALK5i II 10 uM	GSiXX 100 nM		LDN 100 nM	ITS-X 1: 200	ZnSO4 10 uM	Heparine 10 ug / mL
S7	d20- d33	S5	T3 1 uM	ALK5i II 10 uM	N-Cys 1mM	Trolox 10 uM	R428 2 uM	ITS-X 1: 200	ZnSO4 10 uM	Heparine 10 ug / mL
S5 media: Blar + 1x L-glutamine supplement + 2% BSA + 1,5 g / l NaHCO3 + 20 mM Glucose

tabel 10

Discussie

Tijd Overwegingen voor het genereren Mutant Lines

Hoewel de recente benaderingen gebaseerd op CRISPR / Cas systemen voor het genoom bewerking hebben geleid tot succesvolle targeting, zou een meer effectieve en universeel platform voorkeur voor grootschaliger analyses van gen-functie zijn. De iCRISPR platform biedt een snelle en efficiënte methode om mutaties te introduceren aan een gen van belang ^{5, 9.} Ten eerste, de PCR-gebaseerde gRNA synthesewerkwijze maakt de productie van honderden gRNAs in array vorm in een dag zonder tijdrovende kloneringstappen. Ten tweede, met doxycycline-induceerbare expressie in Cas9 iCas9 hPSCs de stap waarbij gRNA transfectie vereist slechts een minimale hoeveelheid werk en dus kan veelvoudige gRNA targeting experimenten gelijktijdig worden uitgevoerd. Ten derde, door de hoge efficiënties targeting haalbaar is met ons systeem de analyse van ~ 24-48 kolonies per gRNA getransfecteerd moeten worden Sufficient meerdere monoallelische en biallele mutantlijnen leggen voor een enkel gen, hoewel efficiëntie variëren afhankelijk van de doelwitlocus. Omdat het mogelijk is voor een geschoold persoon voor het mechanisch ophalen 384 kolonies (4 x 96-well platen) in een vergadering, waarin rekening ~ 4 uur onder een dissectie microscoop kan een getrainde persoon verwachting mutantlijnen invloed 12 genen in genereren 12 maanden. De gestroomlijnde HPSC generatie mutanten in korte tijd maakt de systematische analyse van een array van transcriptiefactoren en / of signaling pathway componenten die met elkaar, het reguleren ontwikkelingsproces ^9. Bovendien, efficiënte multiplex gen targeting opent ook de deur naar het onderzoek naar genetische interacties onderliggende ingewikkelde menselijke kenmerken.

Generatie van Precise genetische modificaties

De afleiding van patiënt-specifieke iPSCs van gemakkelijk toegankelijke somatische celtype s en de differentiatie naar de ziekte-relevante celtypen bieden een geweldige kans voor de validatie van ziekte-geassocieerde mutaties. Vanwege de grote variatie in genetische achtergrond tussen individuen, directe vergelijkingen tussen iPSCs van patiënten en van gezonde donoren niet mogelijk maken om ziekte fenotypes te onderscheiden van achtergrondeffecten. Daarom is het noodzakelijk om isogene controle iPSCs genereren op door de ziektemutatie terug naar de wild-type sequentie of de patiënt-specifieke mutaties te introduceren in een wildtype achtergrond HPSC, zoals voorgesteld door anderen ^{25, 26.} Naast het verlies van functie (null) mutaties, kan men nu nauwkeuriger ziektemechanismen ontleden door de invoering van een patiënt-specifieke sequentie veranderingen in de endogene locus in hPSCs, waaronder hypermorphic, hypomorfe, neomorphic of dominant-negatieve patiënten mutaties.

ntent "> Exacte genetische modificatie telt HDR voor DSB-reparatie in aanwezigheid van een reparatie sjabloon. Omdat het veel minder efficiënt dan NHEJ-gemedieerde DNA herstel, een donor plasmide dat het patiënt-specifieke mutatie, een geneesmiddel selectiecassette en homologie-armen is eerder gebruikt als reparatie sjabloon ^2. Na geneesmiddel selectie en controle van de patiënt-specifieke mutatie, wordt een tweede stap het algemeen nodig geneesmiddelselectie cassette te verwijderen. Terwijl de meest gebruikte Cre-loxP en FLP-FRT systemen achterlaten overblijvende sequentie van de endogene locus, het gebruik van piggyBac transposon is toegestaan voor de naadloze verwijdering van het geneesmiddel selectiecassette ^27. recentelijk korte ssDNA sjablonen ook aangetoond dat efficiënte HDR drager met gemanipuleerde DNA endonucleasen ^28. Vergeleken met een donorplasmide , ssDNA kunnen direct worden gesynthetiseerd en dus omzeilt de tijdrovende kloneringsstap. Hier heeft zijnen aangetoond dat door co-transfectie gRNA en een ssDNA-template om homologie gerichte reparatie induceren, kan iCRISPR worden gebruikt om specifieke nucleotide modificaties met hoge efficiëntie introduceren. Dit is essentieel voor niet alleen onderzoek naar de rol van essentiële nucleotiden binnen eiwit functionele domeinen, maar ook voor het modelleren van menselijke ziekte mutaties en mogelijk corrigeren van deze ziekte geassocieerde mutaties voor therapeutische interventie. Vanwege het grote aantal gevoeligheid loci die elk zijn gekoppeld aan meerdere sequentievarianten, het modelleren van complexe en multigenic ziekten zoals diabetes een uitdaging voor genetici geweest. Als het platform iCRISPR tolerant voor de snelle vorming van een allelische reeks of multiplexable gentargeting, kan het onderzoek van meerdere ziektegeassocieerde loci vergemakkelijken, afzonderlijk of in combinatie met isogene achtergronden.

Gericht op efficiëntie en Off-target effecten

We hebben vond een goede correlatie tussen de T7E1 en RFLP analyseresultaten en het aantal mutante lijnen geïdentificeerd door sequentiebepaling. Dit benadrukt het belang van het uitvoeren van deze testen in parallel met de oprichting van klonale lijnen. Terwijl de richtende efficiëntie verkregen kan variëren naargelang de genomische loci in de meeste enkele-gerichte mutagenese experimenten, 20-60% van de klonen werden gevonden met beide allelen gemuteerd (inclusief in-frame en frameshift mutaties) ^9. Wanneer multiplexed gentargeting werd uitgevoerd, drie biallelische mutante klonen met 5-10% rendement verkregen ^5. ssDNA-gemedieerde HDR van verschillende genen werden ook uitgevoerd om precieze genetische veranderingen te verkrijgen, de efficiëntie van het verkrijgen van homozygote knock-in klonen variërend van 1 - 10% ^5. Werken met CRISPR / Cas in hPSCs eventuele mutaties in potentiële off-target sites die niet dezelfde gRNA doelsequentie niet delen moeten nog worden ontdektlass = "xref"> ^{5, 9, 12.} Hele genoom sequencing uitgevoerd in een recente studie heeft ook geen substantiële off-target mutaties te identificeren in klonale HPSC lijnen gegenereerd met behulp van CRISPR / Cas ^29. Niettemin, om eventuele effect van het verwarren fenotypes geïntroduceerd door mutaties op off-target effect locaties te minimaliseren, wordt voorgesteld om onafhankelijke mutant lijnen met behulp van ten minste twee onafhankelijke gRNAs gericht is op verschillende sequenties in hetzelfde gen te genereren. Vergelijkbare fenotypes waargenomen in meerdere regels gegenereerd met behulp van verschillende gRNAs kon voornamelijk uit te sluiten dat het fenotype afkomstig is van een off-target effect.

Feeder-afhankelijke versus Independent Culture en Targeting

Traditionele methoden voor het HPSC cultuur te betrekken hun onderhoud en uitbreiding op de feeder cellen in media die serum of serum vervanger die dierlijke prod omvatducten, zoals runderserumalbumine. Feeder cellen, serum, serum vervanging, en albumine bevatten allemaal complexe, ongedefinieerde componenten en vertonen grote batch variabiliteit. Aanpassing aan de feeder-vrij en chemisch gedefinieerde toestand vermindert de inspanningen voor HPSC onderhoud en, nog belangrijker, vergroot de samenhang van differentiatie experimenten. Op dit moment zijn er zeer weinig studies die het genoom bewerken procedures op hPSCs gekweekt in volledig gedefinieerde kweekomstandigheden ³⁰ te beschrijven. We hebben hogere CRISPR richten op efficiëntie bij gRNA transfectie en klonen afzetting werden uitgevoerd in feeder-vrije omstandigheden in vergelijking met feeder-afhankelijke kweekomstandigheden gevonden. Wij geloven dat dit als gevolg van verhoogde celoverleving na transfectie en eencellige zaaien voor kolonievorming. Bovendien hebben voedingscellen Eerder is aangetoond dat transfectie reagentia sekwestreren, waardoor de transfectie-efficiëntie verlagen.

De combinatie vanGenoom bewerken met Directed Differentiatie

Previous differentiatie protocollen leverde slechts een kleine fractie van insuline-positieve cellen, waarvan de meeste waren polyhormonal en leken foetale endocrine cellen ^23. Recente ontwikkelingen hebben de differentiatie van hPSCs toegelaten tot meer gerijpte glucose reagerende beta-achtige cellen ^{16, 17, 19, 20.} We kunnen gewoonlijk minstens 75% definitieve endoderm cellen, 40% Pdx1 + + Nkx6.1 alvleesklier progenitoren en ongeveer 20% Nkx6.1 CPEP + + glucose reagerende beta-achtige cellen te verkrijgen middels HUES8 hPSCs ^9. In combinatie met de iCRISPR genoom bewerkingssysteem is deze robuuster differentiatie protocol van de analyse van transcriptiefactoren die cruciaal zijn voor de pancreatische voorlopercellen en endocriene pancreas stadia van differentiatie vergemakkelijkt. Dit maaktZo kunnen met toekomstige studies, een groot aantal kandidaat ziektegenen voor validatie en onderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan diabetes ⁹ onderzoeken.

Toekomstige toepassingen of richtingen

Onze iCRISPR systeem het genereren van meer complexe genomische modificaties, zoals het creëren van reporter allelen door middel vergemakkelijken HDR-gemedieerde gerichte mutagenese met behulp van lange donor DNA-matrijzen coderend eiwit labels of fluorescente reporters ^12. We hebben aangetoond dat, vanwege de hoge efficiëntie bereikt CRISPR gericht in het systeem, kan deze werkwijze worden uitgevoerd in hPSCs, zonder de noodzaak van verdere geneesmiddelselectie ^12. Verder kan gemultiplexte gene targeting worden gebruikt om genetische interacties te onderzoeken onderliggende complexe menselijke ziekte, zoals in onze recente studie, waarvan wij geloven dat het eerste voorbeeld van deze werkzaamheden ^31. iCRISPR kan ook worden gebruikt om genregulerend controle begrijpen door het creëren van deleties hetzij niet-coderende RNA of gen-regulerende gebieden, zoals promoters en enhancers. Efficiënt genereren regulerende mutanten gebruikt iCRISPR kan gRNAs zijn ontworpen dat de bindingsplaats van een DNA-bindend eiwit te verstoren, inclusief maar niet beperkt tot de basale transcriptieapparaat of weefsel-specifieke transcriptiefactor. ssDNA-template gemedieerde HDR kan ook worden gebruikt om specifieke eiwitbindende plaatsen muteren. Tenslotte, voorzien wij dat verdere optimalisering van het gebruik van de iCRISPR platform hPSCs staat stelt hogere throughput genetische analyse van pluripotentie fenotypen of ziekte fenotypes in combinatie met een in vitro differentiatie protocol. Deze-iCRISPR gemedieerde studies kunnen zorgen voor een snellere identificatie van kandidaat-ziekte geassocieerde genen en studies van hun functionele relevantie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chemisch gedefinieerd medium (E8)	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Essential 8 basaal medium en Essential 8 supplement inbegrepen
Afgeknotte recombinante humane vorm van vitronectin	Thermo Fisher Scientific	A14700
ROCK-remmer Y-27632	Selleck Chemicals	S1049
Dissociatiereagens (TrypLE Select enzym)	Thermo Fisher Scientific	12563029	1x, vrij van dierlijke oorsprong, recombinant enzym
G418 Sulfaat	Thermo Fisher Scientific	10131035	Geneticin Selectieve Antibioticum
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P8833	Puromycin Selectief Antibioticum
DNA Polymerase (Herculase II Fusion)	Agilent Technologies	600679	PCR-kit
MEGAshortscript T7 Transcriptiekit	Thermo Fisher Scientific	AM1354
MEGAclear Transcriptie Clean-Up Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1908
Doxycyclinehyclaat	Sigma-Aldrich	D9891
Opti-MEM medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	Reduced Serum Medium
Lipofectamine RNAiMAX Transfectiereagens	Thermo Fisher Scientific	13778150
DNeasy Blood & Tissue Kit	QIAGEN	69504	Genoom DNA extractiekit
Proteinase K	Roche	3115879001
MCDB 131 medium	Thermo Fisher Scientific	10372-019
BLAR medium	Thermo Fisher Scientific		Op maat gemaakt met een gepubliceerde formule (Rezania et al., 2014)
L-glutamine supplement (GlutaMAX)	Thermo Fisher Scientific	35050061
NaHCO3	Thermo Fisher Scientific	144-55-8
Glucose	Sigma-Aldrich	G8769
BSA	LAMPIRE Biological Laboratories	7500855	Vetzuur vrij
GDF8	PeproTech	120-00
CHIR-99021	Stemgent	04-0004	GSK-3 remmer
L-Ascorbinezuur	Sigma-Aldrich	A4544	Vitamine C
FGF7	R&D Systems	251-KG
SANT1	Tocris Bioscience	1974	Hedgehog remmer
RA	Sigma-Aldrich	R2625	Retinoïnezuur
LDN	Stemgent	04-0019	BMP remmer
IWP-2	Tocris Bioscience	3533	Wnt antagonist
ITS-X	Thermo Fisher Scientific	51500-056
TPB	EMD Millipore	565740-1MG	PKC activator
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
ALK5i II	Enzo Life Sciences	ALX-270-445	ALK5 remmer II
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z0251
Heparine	Sigma-Aldrich	H3149
GSiXX	EMD Millipore	565789	Gamma secretase remmer XX, NOTCH signaalremmer
N-Cys (N-acetyl cysteïne)	Sigma-Aldrich	A9165
Trolox	EMD Millipore	648471	Vitamine E analoog
R428	Selleck Chemicals	S2841	AXL receptor tyrosine kinase remmer
24 mm Transwell met inzet	Corning Life Sciences	3414
Gene Pulser Xcell Electroporatiesysteem	Bio-Rad	1652660
0.4 cm Electroporatie Cuvettes	Bio-Rad	1652081
AAVS1-TALEN-L	Addgene	59025
AAVS1-TALEN-R	Addgene	59026
AAVS1-Neo-M2rtTA	Addgene	60843
AAVS1-Puro-iCas9	Addgene	58409
T7 Endonuclease I	NEB	M0302L
Buffer 2	NEB	B7002S	NEBuffer 2
Lang oligonucleotide	Eton Bioscience of IDT
SOX17 antilichaam	R&D Systems	AF1924	1:500
FOXA2 antilichaam	Millipore	07-633	1:100
CXCR4-APC antilichaam	R&D Systems	FAB170A	1:25
PDX1 antilichaam	R&D Systems	AF2419	1:500
NKX6.1 antilichaam	DSHB	F55A12	1:500
NKX2.2 antilichaam	DSHB	74.5A5	1:100
NEUROD1 antilichaam	Santa Cruz Biotechnology	sc-1084	1:100
Insulin antilichaam	Dako	A0564	1:2,000
C-peptide antilichaam	DSHB	GN-ID4-c	1:2,000
Glucagon antilichaam	Sigma-Aldrich	G2654	1:1,000