Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Muizen-lymfocyt Labeling door

8.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55270

⸱

29 april 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University Tübingen, 2Department of Dermatology, Eberhard Karls University Tübingen

In dit artikel

Samenvatting

Na de bereiding van een 64 Cu-gemodificeerd monoklonaal antilichaam dat aan een transgene muizen T-celreceptor, T-cellen radiogelabeld in vivo geanalyseerd op levensvatbaarheid functionaliteit labeling stabiliteit en apoptose en adoptief overgebracht in muizen met een luchtweg vertraagde hypersensitiviteit reactie voor niet-invasieve beeldvorming met positron emission tomography / computed tomography (PET / CT).

Samenvatting

Dit protocol illustreert de bereiding van 64 Cu en de chelator conjugatie / radioactief labelen van een monoklonaal antilichaam (mAb) gevolgd door muizen lymfocyt celkweek en 64 Cu-antilichaamreceptor targeting van cellen. In vitro evaluatie van het radiolabel en niet-invasief in vivo cell tracking in een diermodel van een luchtweg vertraagd type overgevoeligheidsreactie (DTHR) PET / CT beschreven.

In detail wordt de conjugatie van een mAb met de chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecaan-1,4,7,10-tetraazijnzuur (DOTA) weergegeven. Na de productie van radioactief 64 Cu, radiolabeling van de DOTA-geconjugeerde mAb beschreven. Vervolgens wordt de groei van kippen ovalbumine (COVA) -specifieke CD4 + interferon (IFN) -γ-producerende T helpercellen (cova-TH1) en de daaropvolgende radiolabeling van cova-TH1-cellen zijn afgebeeld. Verschillende in vitro technieken worden aan de ef evaluerenfects 64 Cu-radioactief merken van de cellen, zoals het bepalen van de cellevensvatbaarheid door trypan blauw exclusie, de kleuring voor apoptosis met Annexine V voor flowcytometrie en de beoordeling van de functionaliteit van IFN-γ-enzymgebonden immunosorbent assay (ELISA) . Bovendien is de bepaling van de radioactieve opname in de cellen en de etikettering stabiliteit beschreven. Dit protocol beschrijft verder hoe cell tracking studies uit te voeren in een diermodel voor de luchtwegen DTHR en derhalve wordt de inductie van cova-geïnduceerde acute luchtwegen VHTR bij BALB / c-muizen inbegrepen. Tenslotte wordt een robuuste PET / CT workflow inclusief beeldacquisitie, reconstructie en analyse weergegeven.

De 64 Cu-antilichaamreceptor targeting benadering daaropvolgende receptor internalisatie biedt een hoge specificiteit en stabiliteit, verminderde cellulaire toxiciteit en lage uitstroom tarieven in vergelijking met gewone PET-tracers voor cellulaire labelen, bijvoorbeeld 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-methylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). Tenslotte onze aanpak maakt non-invasief in vivo cell tracking PET / CT met een optimale signaal-achtergrond-verhouding voor 48 uur. Deze experimentele benadering kan worden overgedragen op verschillende diermodellen en celtypen met membraangebonden receptoren die worden geïnternaliseerd.

Inleiding

Niet-invasieve cell tracking is een veelzijdige tool om celfunctie, migratie en homing in vivo te controleren. Recente cell tracking studies zijn gericht op mesenchymale 1, 2 of beenmerg afgeleide stamcellen 3 in het kader van de regeneratieve geneeskunde, autologe perifere witte bloedcellen in ontsteking of T-lymfocyten in adoptieve celtherapie tegen kanker 3, 4. De opheldering van de sites van de actie en de onderliggende biologische principes van cellen gebaseerde therapieën is van enorm belang. CD8 + cytotoxische T-lymfocyten, genetisch gemanipuleerd chimeer antigen receptor (CAR) T-cellen of tumor infiltrerende lymfocyten (TIL's) werden algemeen beschouwd als de gouden standaard. Echter, tumor geassocieerde antigen-specifieke TH1 cellen bewezen een effectief alternatief behandelingsoptie 4, zijn </ sup> 5, 6, 7.

Als belangrijkste spelers in ontsteking, orgaan-specifieke auto-immuunziekten (zoals reumatoïde artritis of astma), en cellen van grote belangstelling voor immunotherapie van kanker, is het belangrijk om de tijdelijke distributie en homing patronen van Th1-cellen te karakteriseren. Invasieve in vivo imaging PET weer kwantitatief, uiterst gevoelige methode 8 celmigratie patronen onderzoeken in vivo homing en het plaatsen van T-cel responsen tijdens actie en ontsteking, allergieën, infecties of tumor-afstotende 9, 10, 11.

Klinisch 111In-oxine wordt gebruikt om leukocyten scintigrafie voor het onderscheiden van ontsteking en infectie 12, terwijl 2-deoxy-2- (18F) fluor-D-glucose (18F-FDG) wordt algemeen gebruikt voor cellulaire tracking studies PET 3, 13. Een belangrijk nadeel van deze PET tracer, echter de korte halfwaardetijd van de radionuclide 18F bij 109,7 min en de lage intracellulaire stabiliteit die belemmert beeldvorming op latere tijdstippen na adoptieve celoverdracht. Voor langere termijn in vivo cell tracking studies van PET, maar instabiel in de cellen, wordt 64 Cu-PTSM vaak gebruikt om niet-specifiek label cellen 14, 15 met minimale nadelige effecten op T cellevensvatbaarheid en functie 16.

Dit protocol beschrijft een werkwijze om nadelige effecten op cellevensvatbaarheid en functie in een T-celreceptor (TCR) -specifieke radiogelabelde mAb verder te verminderen. Ten eerste, de productie van radio-isotopen 64 Cu, de vervoeging van het mAb KJ1-26 met the chelator DOTA en de daaropvolgende 64 Cu-radioactief labelen getoond. In een tweede stap, de isolatie en expansie van cova-TH1 cellen van DO 11.10 donormuizen en het radioactief merken met 64 Cu-loaded DOTA-geconjugeerde mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) worden beschreven. De beoordeling van opnamewaarden en efflux van radioactiviteit met een dosiskalibrator en door y-telling, respectievelijk, en de evaluatie van de effecten van 64 Cu-radioactief merken op cellevensvatbaarheid door trypan blauw exclusie en functionaliteit met IFN-y ELISA worden . Voor niet-invasief in vivo cell tracking, het uitlokken van een muismodel van cova-geïnduceerde acute luchtwegen DTHR en beeldacquisitie PET / CT na adoptieve celoverdracht beschreven.

Bovendien kan deze benadering worden labeling doorgezet naar verschillende ziektemodellen murine T-cellen met verschillende TCR of algemene cellen plaats met membraangebonden receptoren of expressie markers onderliggende continu membraan 17 pendelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Veiligheidsmaatregelen: Bij het hanteren van radioactiviteit, slaan 64 Cu achter 2-inch dikke lead stenen en gebruik respectieve afscherming voor schepen die activiteit. Gebruik de juiste tools waarmee indirect hanteren afgeschermde bronnen om direct contact met de hand te vermijden en de blootstelling aan radioactief materiaal te minimaliseren. Draag altijd stralingsdosimetrie controle badges en persoonlijke bescherming apparatuur en controleer jezelf en het werkgebied voor besmetting onmiddellijk aan te pakken het. Gooi mogelijk verontreinigde persoonlijke beschermingsmiddelen voor het verlaten van het gebied waar radioactief materiaal wordt gebruikt. Opslaan van het hele radioactief afval achter loden mantel tot de radioactieve 64 Cu vervallen (ongeveer 10 halfwaardetijden = 127 uur) voordat adequate verwijdering.

1. 64 Cu Production

Opmerking: Het radioisotoop 64 Cu wordt geproduceerd via de 64 Ni (p, n) 64 Cu kern onder toepassing van een pettras cyclotron volgens een gemodificeerd protocol van McCarthy et al. 18.

  1. 64 Cu productie bestralen 64 Ni, die elektrolytisch op een platina / iridium plaat (90/10), met 30 uA gedurende 6 uur onder een protonenbundel van 12,4 MeV.
  2. Verhit platina / iridium doel tot 100 ° C in een speciale polyetheretherketon (PEEK) kamer en incubeer in 2 ml geconcentreerd HCl gedurende 20 min op te lossen 64 Cu / Ni 64.
  3. Voeg nog 1 ml geconcentreerd HCl en incubeer gedurende 10 minuten.
  4. HCl verdampt onder een stroom argon en koelen van de kamer tot kamertemperatuur.
  5. Spoelen van de kamer met 3 ml 4% 0,2 M HCl en 96% methanol (v / v) en breng deze oplossing aan een ionenuitwisseling kolom werd voorgeconditioneerd met 4% 0,2 M HCl in methanol gedurende ten minste 15 min. De doorloop kan worden gebruikt voor recyclen 64 Ni.
  6. Was de 64 Cu vastgehouden in de kolom met 4% 0,2 M HCl in methanol.
  7. Elueer 64 Cu met 70% 1,3 M HCl / 30% isopropanol (v / v) in een verzameling flesje damp dit in een argonstroom en laat het flesje afkoelen tot kamertemperatuur.
  8. 64 Cu lossen in 140-210 gl 0,1 M HCl.

2. Antilichaam Conjugatie van DOTA en daaropvolgende 64 Cu-radiolabeling

OPMERKING: De chelator DOTA wordt gekoppeld aan functionele aminogroepen van het mAb door N-hydroxysuccinimide (NHS) ester chemie en het conjugaat worden vervolgens radioactief gemerkt met 64 19 Cu.

  1. Dient de concentratie van de mAb-KJ1-26 tot 8 mg / ml en gediafiltreerd 1 ml oplossing mAb tegen 0,1 M Na 2 HPO 4 pH 7,5 behandeld met 1,2 g / l van een chelaatvormend ionenuitwisselingshars via een molecuulgewicht cut off ( MWCO 30 kDa) centrifugale filtereenheid. Toepassen 3 opeenvolgende wasstappen met 14 ml van de buffer. Na de laatste wasstapconcentreer de oplossing nogmaals 1 ml. Kwantificeren antilichaamconcentratie van OD 280nm metingen.
  2. Bereid een DOTA-NHS opgelost in ultrazuiver of PCR-grade water bij een concentratie van 10 mg / ml direct vóór gebruik. Laat de flacon op kamertemperatuur voorafgaand aan watercondensatie te vermijden, en verwijder DOTA-NHS met een kunststof spatel. Voeg 216 ul van deze DOTA-NHS oplossing tot 8 mg van het gediafiltreerde KJ1-26-mAb oplossing, meng en incubeer 24 uur bij 4 ° C op een tuimelmenger.
  3. Diafiltraat de DOTA-KJ1-26-mAb tegen 0,25 M ammoniumacetaat, pH 7,0, behandeld met 1,2 g / l van een chelaatvormend ionenuitwisselingshars, onder gebruikmaking van een molecuulgewicht cut off (MWCO 30 kDa) centrifugale filtereenheid. Breng 7 wasstappen. Concentreer het mAb tot een eindvolume van 1 ml en meet opnieuw de eiwitconcentratie van OD 280nm metingen.
  4. Vóór radiolabeling, wisselen de buffer van de DOTA-KJ1-26-mAb tegen PBS via grootte-exclusielusion chromatografie met gelfiltratiekolommen. Dit verwijdert ook de potentiële kleine-molecule onzuiverheden.
  5. Bereid 100 MBq 64 CuCl2-oplossing in 10 mM HCl en op pH 6-7 met 10x PBS. Voeg 200 ug DOTA-KJ1-26-mAb. Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C.
  6. Voor kwaliteitscontrole Voer dunnelaagchromatografie met 0,1 M natriumcitraat (pH 5) als mobiele fase en geanalyseerd met autoradiografie. Ten minste 90% van de activiteit moet worden gebonden aan het antilichaam en derhalve worden gedetecteerd bij de startplaats. Ongebonden activiteit wordt gecheleerd door het citraat gebaseerde mobiele fase en strepen op het oplosmiddelfront. Een referentie, wordt het gebruik van 64 CuCl2 geadviseerd.

3. kippenovalbumine-specifieke Th1 (COVA-TH1) Cell Isolatie en uitbreiding

OPMERKING: De kweek van TH1-cellen wordt beschreven volgens de eerder gepubliceerde studies 16, 17.

  1. Isoleer milten en extraperitoneale lymfeknopen (LN) vanaf DO 11.10 muizen.
    1. Offer de muis volgens de federale regelgeving. Desinfecteren dier met 70% ethanol en fixeer het met kleefband voor het verwijderen van de milt en LNS. Maak een mediane incisie en scheiden de huid van het buikvlies door deze zijdelings te trekken naar elke site.
    2. Vind cervicale, axiale, arm en lies LNS. Verwijder ze met stompe pincet en plaats ze in 1% foetaal kalfsserum (FCS) / PBS buffer.
    3. Open het buikvlies en zoek de milt. Scheid de milt van de alvleesklier en bindweefsel en plaats deze in 1% FCS / PBS-buffer. Voor verdere richtlijnen, zie referenties 20,21.
  2. Gehakt milt en LN door een 40 urn filter in een 50 ml schroefdop buis met behulp van de plunjer van een injectiespuit. Spoel het filter met 10 ml 1% FCS / PBS-buffer.
  3. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Subsequentgevoerd Voer lysis van erythrocyten door toevoeging van ammonium-chloride-kalium (ACK) lysisbuffer (1,5 ml per donordier) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 8,5 ml 1% FCS / PBS-buffer (per donordier).
  4. Centrifugeer de cellen bij 400 g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Was de cellen in 10 ml 1% FCS / PBS-buffer, centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
  5. Voor magnetische celscheiding, resuspendeer de cellen in 1% FCS / PBS-buffer en voeg CD4 + microkralen. De instructies van de fabrikant voor het buffervolume en het aantal CD4 + microkralen te gebruiken.
  6. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Voeg vervolgens 1% FCS / PBS-buffer tot 50 ml, centrifuge de cellen bij 400 g gedurende 5 minuten en de bovenstaande vloeistof.
  7. Verder met CD4 + T-cellen geïsoleerd met behulp van commerciële magnetische scheidingskolommen en een respectieve magneet standaard volgens het protocol van de fabrikant. Pas de geëlueerde CD4 + T-cellen om een concentration van 10 6 cellen / ml in gemodificeerd Eagle's medium Dulbecco's met 10% door warmte geïnactiveerd FCS, 2,5% penicilline / streptomycine, 1% HEPES-buffer, 1% MEM aminozuren, 1% natriumpyruvaat en 0,2% 2-mercaptoethanol en store ze bij 4 ° C.
  8. Verzamel de gietzuil in een 50 ml schroefdop buis antigeenpresenterende cellen (APC's) te bereiden. Centrifugeer de gietzuil bij 400 xg gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
  9. Voeg 10 ug / ml anti-CD4 (kloon: GK1.5), 10 ug / ml anti-CD8 (kloon: 5367,2) en 10 ug / ml muizen anti-ratten-mAb (MAR18.5) en 1,5 ml konijnencomplement. Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 ° C.
  10. Centrifugeer de cellen bij 400 g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en voeg 3 ml medium. Bestralen van de APCs op γ-straal of röntgenbron met 30 Gy in totaal. Daarna pas de APC's tot een concentratie van 5 x 10 6 cellen / ml.
  11. Voeg 100 ul van CD4 + T-cellen en 100 ui van APC op een 96 putjes plate samen met 10 ug / mL cOVA-323-339-peptide, 10 ug / ml anti-IL-4-mAb, 0,3 pM CPG1668-oligonucleotiden en 5 U / ml IL-2.
  12. Voeg 50 U / ml IL-2 om de dag. Na 3-4 dagen, overdracht van de cellen van platen met 96 putjes met 24 putjes. Combineer 3-5 putjes van de plaat met 96 putjes in één putje op 24-wells plaat. Voeg 100 U / ml IL-2 bevattende medium in een 1: 1 verhouding.
  13. Na nog eens 2-3 dagen, overdracht van de cellen van de plaat met 48 putjes met 175 cm2 celkweekkolven (1 x 48-putjesplaat per kolf). Vul met medium in een 1: 1 ratio. Voeg 50 U / ml IL-2 om de dag.
  14. Splits de cellen volgens celdichtheid en voeg 50 U / ml IL-2 om de dag. Op deze manier, de cultuur van de cellen voor nog eens 10 dagen.

4. COVA-TH1 Cell Radioactief

LET OP: De 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb zullen worden toegepast op gekweekte COVA-Th1-cellen intracellulaire radioactieve labeling mogelijk te maken.

  1. Voor Cova-TH1 cell radiolabeling opneming 37 MBq het radiogelabelde 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb in een injectiespuit zonder dode volume met een dosiskalibrator. Voeg 1 ml zoutoplossing tot een 37 MBq / ml oplossing ontvangt.
  2. Suspendeer cova-TH1 cellen in medium bij 2 x 10 6 cellen / ml en voeg 0,5 ml van de celsuspensie aan elk putje in een 48-wells plaat.
  3. Voeg 20 ul van de vers bereide 37 MBq / ml 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb-oplossing in elk putje van de 48-well plaat. De uiteindelijke verhouding van de etikettering 0,7 MBq per 10 6 cellen in een volume van 520 uL. Incubeer bij 37 ° C en 7,5% CO2 gedurende 30 minuten.
  4. Na incubatie voorzichtig resuspendeer de cellen in elk putje en breng de celsuspensie uit de 48-wells plaat in een 50 ml schroefdop buis. Om cel verlies te minimaliseren, spoel elk putje met voorverwarmd medium.
  5. Centrifugeer de cova-TH1 celsuspensie bij 400 xg gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml voorverwarmde PBS. Verwijder een aliquot van de celsuspensie gedurende celtelling. Herhaal de wasstap.
  6. Count levensvatbare COVA-Th1-cellen in een geschikte verdunning met trypan blauwe vlekken.
  7. Pas de celconcentratie tot 5 x 10 7 cellen / ml voor intraperitoneale (ip) injectie van 10 7-cellen in 200 pi PBS.
  8. Herhaal stappen 4.3-4.5 de cova-TH1 cellen met toenemende hoeveelheden radioactief activiteit, bijvoorbeeld 1,4 MBq ofwel 2,1 MBq per 10 6 cellen.
    1. De cellen radioactief 1,4 MBq per 10 6 cellen, gebruik 40 pi van de 37 MBq / ml 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-oplossing en 60 pi voor het radioactief met 2,1 MBq per 10 6 cellen. De stappen 4,3-4,7 met 0,7 MBq, 1,4 MBq en 2,1 MBq 64 Cu-PTSM maar verhogen de etiketteertijd tot 3 uur voor vergelijkend onderzoek 17.
    2. Ga naar stap 5 om de optimale hoeveelheid activiteit te bepalen.

5. In vitro evaluatie van het effect van het radiolabel op cova-TH1 Cellen

OPMERKING: De karakterisering van de invloeden van het radiolabel op de TH1-cellen wordt uitgevoerd door trypan blauw exclusietest op levensvatbaarheid, IFN-y ELISA functionaliteit beoordeling en PE-Annexine V kleuring voor de inductie van apoptose 16, 17. Bepaling van de intracellulaire opname en de uitstroom van radioactiviteit wordt ook hieronder beschreven. Ter vergelijking, kan 64 Cu-PTSM-gelabelde Cova-Th1-cellen ook worden gebruikt.

  1. Effect op levensvatbaarheid door trypan blauw uitsluiting
    1. Passen ten minste 18 x 10 6 cova-TH1 cellen radioactief gemerkt met 0,7 MBq / 10 6 cellen, 1,4 MBq / 10 6 cellen en 2,1 MBq / 10 6 cellen respectievelijk een concentratie van 2 x 10 6 cellen / ml en de stappen 5.1. 2-5.1.7 per dosis activiteit. Gebruik niet-radioactive KJ1-26-mAb gelabeld Cova-Th1-cellen en niet-gemerkte Cova-Th1-cellen als de controles.
    2. Pipet 1 ml van de celoplossing in 9 wells van een 24-wells plaat.
    3. Verzamel de inhoud van 3 putjes in 3 afzonderlijke 15 ml schroefdop buizen, 3 uur na de eerste radiolabeling.
    4. Spoel de nu lege putjes met voorverwarmd medium aan cellen te minimaliseren en voeg het medium naar de respectieve 15 mL schroefdopbuisjes uit stap 5.1.3.
    5. Centrifugeer de 15 ml buizen bij 400 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer de resulterende celpellet in 1 ml voorverwarmd medium.
    6. Tellen zowel levende en dode cellen in trypan blauw afzonderlijk voor elke 15 ml buis en berekent het percentage levensvatbare cellen.
    7. Herhaal stappen 5.1.3-5.1.6 24 en 48 uur na 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiolabeling.
  2. Effecten op functionaliteit bepaald door IFN-y ELISA
    OPMERKING: Om het effect van de 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radiolabel op IFN-γ productio beoordelenn als een marker functionaliteit, voert een IFN-γ ELISA van een commerciële leverancier en zie referentie 17 voor meer details.
    1. Disperse 10 5 levensvatbare cellen in 100 gl medium op een plaat met 96 putjes, 3 uur na 64 Cu-DOTA-KJ1-26 radiolabeling van cova-TH1 cellen met 0,7 MBq, 1,4 MBq ofwel 2,1 MBq. Gebruik niet-gemerkte, niet-radioactieve KJ1-26-mAb-gelabelde of 64 Cu-PTSM-gelabelde Cova-Th1-cellen als de controles.
    2. Stimuleren IFN-γ productie 10 5 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb gemerkte cova-TH1 cellen in 100 ul medium met 10 ug / ml peptide cova, 5 U / ml IL-2 en 5x10 5 APCs in 100 ul drager gedurende 24 uur bij 37 ° C en 7,5% CO2. Verdere controles kunnen de overige omstandigheden zonder toevoeging van cova peptide.
    3. Analyseer de supernatant door middel van ELISA volgens de instructies van de fabrikant.
    4. Herhaal stap 5.2.2. 5.2.3. 24 en 48 uur na de etiketteringsprocedure.
  3. Inductie van apoptose bepaald door PE-Annexine V kleuring voor flowcytometrie
    Opmerking: Om apoptose-inductie door de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiolabel, een in de handel verkrijgbare kit voor flowcytometrie en celmonsters bereiden volgens de instructies van de fabrikant voor kleuring met Annexine V fosfatidylserine uiteenzetting over de celmembraan .
    1. 3, 24 en 48 uur na 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiolabeling van cova-TH1 cellen vlek triplo met ten minste 6 10 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb gemerkte cova-TH1 cellen met de Annexine V kit volgens de instructies van de fabrikant en geanalyseerd binnen een uur. Gebruik niet-radioactieve KJ1-26-mAb-label, 64 Cu-PTSM-gelabeld en ongelabeld Cova-Th1-cellen als controle. Raadpleeg de referentie 17 voor meer informatie.
  4. Opname en uitstroom
    OPMERKING: De opname van de 64 Cu-DOTAKJ1-26-mAb in de cellen wordt gemeten in een dosiskalibrator en efflux radioactiviteit wordt gemeten in een assay γ-telling 0, 5, 24 en 48 uur na radiolabeling.
    1. Bereid ten γ-telbuizen elk voor 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb gemerkte cova-TH1 cellen de respectievelijke supernatant en de wasstap.
    2. Breng 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb gemerkte cova-TH1-cellen in 1 ml medium in elk van de tien γ-telbuizen direct na radioactief merken. Voor elk van de tijdstippen 5, 24 en 48 uur na radiolabeling houden minstens 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb gemerkte cova-TH1 cellen in een medium op 24-well celcultuur platen in een incubator bij 37 ° C en 7,5% CO2.
    3. Centrifugeer de γ-telbuizen bij 400 xg gedurende 5 minuten en breng het supernatans in tien nieuwe γ-telbuizen.
    4. Was de cellen eenmaal in 1 ml medium met de ongebonden fractie van 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb een verwijderend verzamel de supernatant tien nieuwe γ-telbuizen.
    5. Voeg 1 ml nieuw medium aan de cova-TH1 cellen en bepaal de initiële opname waarde in een dosiskalibrator. De buizen kunnen ook worden opgeslagen in een incubator bij 37 ° C en 7,5% CO2.
    6. Herhaal stappen 5.4.2 tot 5.4.5 na 5, 24 en 48 uur en meet alle buizen op een γ-teller volgens het protocol van de fabrikant. Om te corrigeren voor radioactief verval en voor de kwantitatieve analyse, gebruik dan een standaard met een bepaalde dosis radioactiviteit.

6. OVA-geïnduceerde acute luchtweg DTHR

OPMERKING: De migratiedynamiek en homing patronen van adoptief overgedragen en radiogelabeld cova-TH1 cellen naar de plaats van ontsteking worden gevisualiseerd en gekwantificeerd in een diermodel voor cova-geïnduceerde luchtweg-DTHR 16, 17.

  1. Injecteer 8 weken oude BALB / c muizen ip met een mengsel van 150 pl aluminum gel / 50 pl cova-oplossing (10 ug in 50 ul PBS) aan de muizen te immuniseren.
  2. Twee weken na de immunisatie verdoven de muizen met 100 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazine door ip injectie. Plaats de experimentele muizen op hun rug en langzaam pipet 100 ug cova opgelost in 50 ul PBS in de neusgaten van de dieren. De dieren oplossing druppelsgewijs inhaleren.
  3. Herhaal na 24 uur. Meer hoge luchtwegen DTHR inducties, herhaal opnieuw na 48 uur.
  4. De specifieke migratie van de overgedragen cova-TH1-cellen te analyseren, te induceren luchtweg-DTHR met kalkoen-of fazant-OVA als controle. Daarom herhaalt u de stappen 6.1-6.3 met behulp van de respectieve OVA-eiwit.

7. In vivo beeldvorming met PET / CT

LET OP: In vivo beeldvorming van 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-gelabelde Cova-Th1-cellen in Cova-DTHR zieke muizen en controle nestgenoten toont de specifieke homing en het migratie dynamiek van het COVA-Th1-cellen. Daarom verwerven statische PET-scans en anatomische CT scans sequentieel 3, 24 en 48 uur na adoptieve celoverdracht.

  1. Direct na radiolabeling, pas de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb gemerkte cova-TH1-cellen tot 5 x 10 7 cellen / ml voor ip injectie van 10 7-cellen in 200 pi.
  2. Met een 1 ml spuit en een 30-gauge naald, trek 200 pi van de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb gemerkte cova-TH1 celsuspensie en spuit de cellen ip in de cova-DTHR-zieke dieren tussen de 4 e en 5 e tepel. Het totale geïnjecteerde hoeveelheid radioactiviteit te bepalen, meet de spuit in een dosiskalibrator vóór en na injectie.
  3. Verdoven de muizen 10 minuten voorafgaand aan de gewenste opname tijd, met 1,5% isofluraan in 100% zuurstof (stroomsnelheid: 0,7 l / min) in een thermisch geïsoleerde narcosebox.
  4. In de tussentijd, om co-registratie mogelijkPET en CT-beelden tijdens beeldanalyse, vast glazen capillairen met 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb oplossing of vrije 64 CuCl2 oplossing onder de muis bed.
    1. Daarom, een oplossing van 0,37 MBq / ml en vul glazen capillairen met een volume van 10 pi met deze oplossing. Omdat cellen afkomstige signalen radioactiviteit inherent zwak, niet gebruikte grote hoeveelheden activiteit om ervoor te zorgen dat de merktekens niet verstoren-cellen afgeleide signalen bij muizen.
  5. Na het bereiken van chirurgische tolerantie, zoals aangegeven door het verlies van de reflex pedaal terugtrekking van de achterpoot, overdracht van de muis om een ​​PET-en CT-compatibele klein dier bed voorzien van een geschikte buissysteem anesthesie te handhaven.
  6. Blokkeer de muis op het kleine dier bed met behulp van wattenstaafjes en chirurgische tape. Breng oogzalf om uitdroging van de ogen te vermijden.
  7. Breng de muis bed aan de PET-scanner, centreren gezichtsveld met een focuTussen de longen en het verwerven van een 20 min statische PET scannen met een energie raam van 350-650 keV.
  8. Breng de muis bed om de CT-scanner. Via scout uitzicht, centreren het gezichtsveld op de longen. Het verwerven van een vlakke CT beeld via uitsteeksels 360 in een 360 ° rotatie in de "stap en afdrukken" met een belichtingstijd van 350 ms en binning factor 4.

8. Image Analysis

  1. Reconstrueren lijst PET-modus data door het toepassen van statistische iteratieve bestelde deelverzameling verwachting maximalisatie (Osem) 2D algoritme en CT-scans in 3D-beeld met een pixelgrootte van 75 urn.
  2. Voor het co-registratie op passende beeldanalyse software (bijv Inveon Research werkplek of Pmod) Gebruik de automatische co-registratietool. Als dit mislukt, gebruik glascapillairen onder de muis bed als leidraad ruimtelijk co-registratie van de gereconstrueerde CT en PET beelden in de axiale, coronale en sagittale weergave.
  3. Corrigeer de PET beeldenvoor radioactief verval met behulp van het radioactief verval wet en de half-time van de radionuclide 64 Cu op 12,7 uur. Voor het normaliseren Kies een beeld (A) als referentie en de intensiteit van de beeldweergave in de betreffende beeldanalyse software.
    1. Gebruik maken van het stel gewoon het referentiebeeld (A) waarden van de geïnjecteerde activiteit (A) en de geïnjecteerde activiteit voor de andere beelden (X), normaliseren andere beelden met de volgende vergelijking: (geïnjecteerde activiteit (X) / geïnjecteerde activiteit ( A)) x intensiteitswaarden (A).
  4. Teken 3D-volumes van belang (VOI) op de genormaliseerde PET-signaal van de long- en perithymic LNs.
  5. Bepaal het percentage geïnjecteerde dosis per cm3 (% ID / cm3) door de volgende vergelijking: (gemiddelde activiteit VOI / totale activiteit bij de muis) x 100. Voor nadere aanwijzingen voor beeldanalyse, zie referenties 22, 23.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 vat de kenmerken van cova-TH1 cellen met 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb en experimentele opzet voor de in vitro en in vivo studies die in dit protocol.

figure-results-1
Figuur 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb Labelling Process & Experimental Design. (A) Schematische weergave van radioact...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol geeft een betrouwbare en eenvoudige methode om stabiel radioactief cellen in vivo volgen van PET. Gebruik makend van deze methode, cova-TH1 cellen geïsoleerd en geëxpandeerd in vitro uit donor muizen kon worden radiogelabeld met 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb en de homing werd gevolgd aan de longen perithymic LN als gebieden van COVA presentatie in een Cova-geïnduceerde acute luchtweg DTHR.

De modificatie van het mAb met de chelator vereist een snelle en effi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken dr Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant evenals Natalie Altmeyer voor de steun tijdens de experimenten en data-analyse. Dit werk werd ondersteund door de Werner Siemens-Stichting, de DFG door de SFB685 (project B6) en Fortune (2309-0-0).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HCl, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.0031864Cu productie
Methanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.0600764Cu productie
Isopropanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.010464Cu productie
Pt/Ir (90/10) plateÖgussaOp maat gemaakt64Cu productie
PEEK chamberWKLOp maat gemaakt64Cu productie
64NiChemotrade64Cu productie
Polygram SIL G/UV 254 plateMacherey-Nagel80502164Cu productie
Ion exchange columnBioRadAG1-X864Cu productie
Solid state target system for PETtraceWKLop maat gemaakt64Cu productie
64Cu work-up moduleWKLop maat gemaakt64Cu productie
Dose calibratorCapintecCRC-25R
PETtrace cyclotronGeneral Electric Medical Systems
DOTA-NHSMacrocyclicsB-280DOTA-conjugatie
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26)Geïsoleerd uit hybridoma celcultuurDOTA-conjugatie
Na2HPO4Sigma-Aldrich71633DOTA-conjugatie
H+ Chelex 100Sigma-AldrichC7901DOTA-conjugatie
Amicon Ultra-15 filter unitMerck MilliporeUFC910008DOTA-conjugatie
Rotipuran ultrapure waterCarl RothHN68.3DOTA-conjugatie
Ammonium acetateSigma-Aldrich32301DOTA-conjugatie
PBSUniversity TuebingenDOTA-conjugatie
Micro Bio-spin P-6 columnBio-Rad Laboratories7326221DOTA-conjugatie
Sodium citrateSigma-Aldrich71497DOTA-conjugatie
Cyclone Plus PhosphorImager Perkin-ElmerL2250116DOTA-conjugatie
DMEMMerck Millipore102568ingrediënt voor T-celmedium 
FCSMerck MilliporeS0115/1004Bingrediënt voor T-celmedium 
Sodium pyruvateMerck MilliporeL0473ingrediënt voor T-celmedium 
MEM-amino acidsMerck MilliporeK0293ingrediënt voor T-celmedium 
HEPES Merck MilliporeL 1613ingrediënt voor T-celmedium 
 Penicillin/StreptomycinMerck MilliporeA2212ingrediënt voor T-celmedium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148ingrediënt voor T-celmedium 
DO11.10 muizenin-house fokkenTH1 celcultuur
DPBSGibco14190144TH1 celcultuur
Cell strainer 40 µm Corning352340TH1 celcultuur
ACK Lysing BufferLonza10-548ETH1 celcultuur
CD4 MicroBeads, mouseMiltenyi Biotech130-097-145TH1 celcultuur
QuadroMACS separatorMiltenyi Biotech130-090-976TH1 celcultuur
LS columnMiltenyi Biotech130-042-401TH1 celcultuur
anti-CD4 antibody (Gk1.5)Geïsoleerd uit hybridoma celcultuurTH1 celcultuur
anti-CD8 antibody (5367.2)Geïsoleerd uit hybridoma celcultuurTH1 celcultuur
Anti-rat antibody (MAR18.5)Geïsoleerd uit hybridoma celcultuurTH1 celcultuur
Rabbit complement MAtebu-BioCL3221TH1 celcultuur
Anti-IL-4 antibody (11B11)Geïsoleerd uit hybridoma celcultuurTH1 celcultuur
cOVA 323-339-peptide EMC-micro-collectionsCustom orderTH1 celcultuur
CPG1668-oligonucleotidesEurofins MWG OperonCustom orderTH1 celcultuur
IL-2Novartis65483-116-07TH1 celcultuur
96-well platesGreiner 655180TH1 celcultuur
24-well platesGreiner 662160TH1 celcultuur
cell culture flaskGreiner 660175TH1 celcultuur
48-well platesGreiner 677 180cellabeling
Gammacell 1000Best Theratronicsvia inquiry 
Gulmay RT225Gulmayvia inquiry 
Trypan blueMerck MilliporeL6323in vitro evaluatie
Mouse IFN-γ ELISABD Biosciences558258in vitro evaluatie
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit BD Biosciences559763in vitro evaluatie
Tube 5 mLSarstedt55.476in vitro evaluatie
Round-bottom tubes BD Biosciences352008in vitro evaluatie
Wizard γ-counterPerkin-Elmer2480-0010in vitro evaluatie
ELISA Reader MultiscanEXThermo Fisher Scientific5

Referenties

  1. Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
  2. Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
  3. Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
  4. Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
  5. Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
  6. Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  8. Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
  9. Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
  10. Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
  11. Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
  12. Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
  13. Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
  14. Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
  15. Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
  16. Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
  17. Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
  18. McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
  19. Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
  20. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii,, J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765(2013).
  21. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739(2015).
  22. Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , Springer. 363-370 (2011).
  23. Phelps, M. E. PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , Springer-Verlag. 93-101 (2004).
  24. Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
  25. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
  26. Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
  27. Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
  28. Johnson, T. E., Birky, B. K. Health Physics and Radiological Health. , 4th ed, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
  29. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Koper-64 antilichaamPET/CT van celtransportDOTA-chelaatconjugatieisolatie van CD4-positieve T-cellenradioactieve antilichaamopnamein vivo celtrackingPET/CT-beeldacquisitiemodel voor vertraagde overgevoeligheidhomingpatronen van lymfocyten
Muizen-lymfocyt Labeling door
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.