Een Rapid Filter Insert-gebaseerde 3D Cultuur System for Primary Prostaat Cel Differentiatie

Samenvatting

Hier presenteren we een methode voor het opzetten van een snel in vitro systeem dat het driedimensionale kweken en de daaropvolgende luminale differentiatie van primaire prostaatepitheelcellen ondersteunt.

Samenvatting

Voorwaardelijk geherprogrammeerd cellen (CRC) een duurzame werkwijze voor primaire celkweek en het vermogen om grote "levende biobanken 'van patiënt afgeleide cellijnen te ontwikkelen. Voor veel soorten epitheliale cellen hebben verschillende driedimensionale (3D) cultuur benaderingen beschreven die een verbeterde gedifferentieerde toestand ondersteunen. Terwijl CRCs hun lineage inzet voor het weefsel waaruit ze worden geïsoleerd behouden, falen ze uit te drukken veel van de differentiatie markers in verband met het weefsel van herkomst wanneer gekweekt onder normale tweedimensionale (2D) kweekomstandigheden. De toepassing van patiënt afgeleide CRC voor prostaatkanker onderzoek te versterken, is een 3D cultuur format gedefinieerd die snel (2 weken totaal) luminale celdifferentiatie in normale en tumor-afgeleide prostaat epitheliale cellen mogelijk maakt. Hierin wordt een filterelement-gebaseerd formaat beschreven voor het kweken en differentiatie van normale en kwaadaardige prostaat CRC. A detailed beschrijving van de voor cellen en -verwerking zijn voor immunohistochemische en immunofluorescentie kleuringen worden voorzien. Gezamenlijk de 3D cultuur format beschreven, in combinatie met de primaire CRC lijnen, een belangrijk middellange doorvoer modelsysteem voor hoog- biospecimen gebaseerde prostate onderzoek.

Inleiding

De identificatie en toepassing van kankertherapieën die op maat gemaakt kunnen individuen een hoofddoel in kankeronderzoek. Onlangs zijn er nieuwe benaderingen ontwikkeld die zorgen voor een grotere gemak bij het opzetten van primaire celculturen potentieel verschaffen leibanen van identificeren en testen gepersonaliseerde therapieën. Bijvoorbeeld, de R-spondin gebaseerde prostate organoïde benadering ¹ zorgt voor driedimensionale (3D) het kweken van normale en metastatische prostaatkankercellen in commerciële extracellulaire matrix (bijvoorbeeld Matrigel), terwijl de voorwaardelijk herprogrammeren van cellen (CRC) methode ontwikkeld aan Georgetown ^{2, 3} maakt gebruik van meer standaard 2D kweekomstandigheden. Met name de combinatie van een Rho kinase inhibitor (Y-27632) en bestraalde J2 murine fibroblast voedingscellen tot de onbepaalde kweken van keratinocyten CRC ^2. De CRC methodologieextreem robuust, met primaire cellijnen met succes en voor onbepaalde tijd gehandhaafd van de prostaat en vele andere normale en kwaadaardige epitheliale weefsels ^3. Belangrijker onze CRC technologie toegestaan ​​voor de snelle identificatie van de etiologische basis voor terugkerend respiratoir papillomatose bij een patiënt die een aantal eerdere medicamenteuze behandelingen hadden gefaald. Voorts worden volgens normale en tumor afgeleide CRC, de succesvolle identificatie van een FDA goedgekeurde geneesmiddel, Vorinostat werd binnen twee weken na de initiële biopsie weefsel. De patiënt werd op vorinostat, waardoor de succesvolle behandeling van hun ziekte ^4.

De normale prostaat bestaat uit luminale, basale en de zeldzame neuroendocriene cellen ^5. Luminale cellen vormen de kolomvormige epitheellaag van de klier en drukken de androgeenreceptor (AR), en andere luminale merkers zoals cytokeratine 8 en 18 en prostate-specifiek antigeen (PSA) ^6. Omgekeerd worden basale cellen gelokaliseerd onder de luminale laag en te uiten cytokeratine 5 en p63, maar lage niveaus van de AR ^5. We ^{7, 8, 9} en ¹⁰ anderen hebben met succes gebruik prostate CRC's in preklinische mechanistische geneesmiddelgevoeligheid onderzoeken. Echter, wanneer gekweekt onder standaard 2D weefselkweekomstandigheden deze cellen niet volledig aangrijpen AR ¹⁰ signalering. Belangrijker nog, toen onder de renale capsule van immunodeficiënte muizen geplaatst, de CRC's weer normale prostaat klier architectuur en functie aan te geven dat de prostaat CRCs behouden hun lineage betrokkenheid bij plaatsing in een tolerante omgeving. De ontwikkeling van het filterelement gebaseerde celcultuur beschreven maakt de snelle (2 weken) in vitro differentiatie van prostate CRC zoals blijkt by de verhoogde expressie van de AR en AR doelwitgenen en verlaagde p63.

De filterpatronen gebruikt bevatten polycarbonaat membranen (poriegrootte 0,4 pm) die het kweken van zoogdiercellen kan ondersteunen. Het systeem, zoals ontwikkeld, maakt gebruik van normale en kwaadaardige prostaat CRC, 6 putjes en het filter inserts. Celkweekmedia J2 geconditioneerd door cellen ¹¹ wordt in de onderste kamer en prostaatkanker differentiatie media in de bovenste kamer. De technieken die hierin beschreven ondersteunen prostaat lumen celdifferentiatie binnen een 2 week termijn, in overeenstemming met de doelstellingen van gepersonaliseerde geneeskunde. Het was ook noodzakelijk om de methoden waarmee de uitgebreide moleculaire, genetische en cellulaire profilering van de kweken te ontwikkelen. Werkwijzen voor het isoleren van DNA, RNA en eiwit uit cellen vrijgemaakt uit het filteroppervlak ontwikkeld en gestroomlijnd accurate tweede monster verwerking. Finally, de methodologie die nodig is voor het verwijderen van het filter om inbedding mogelijk te maken, snijden en voor H & E, immunohistochemische en immunofluorescentie kleuring, wordt volledig beschreven.

Protocol

1. De vaststelling van de 3D-Cell Culture Insert System

1. Plaats 2 polycarbonaat celkweek inserts in een omgekeerde oriëntatie (filter zijde naar boven) in een plaat met 6 putjes (Figuur 1A).
2. Een dunne laag van 0,1% gelatine in water aan de onderzijde van het inzetstuk en laten drogen (10-20 min) in een biologische veiligheidskast om steriliteit te handhaven.
3. Herhaal stap 1.2 twee keer voor een totaal van 3 toepassingen van 0,1% gelatine op de inzetstukken.
   NB: De gelatine coating limiet diffusie tussen de kamers te helpen.
4. Om de primaire CRC's van standaard kweekomstandigheden verzamelen, voeg 5 ml PBS aan de cultuur kolf te wassen.
   1. Trypsinize de cellen gebruikt (1 ml voor een T-25 en 2 ml van een T-75) 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Tik zachtjes tegen de zijkant van de kolf om te helpen bij het loskomen van de cellen. ga dan naar de trypsine reactie te stoppen en het verzamelen van de cellen door toevoeging van 5 ml compleet DMEM.
   2. Verzamelen de cellen in een 15 ml buis. Centrifugeer de buizen bij 4 ° C en 188 xg en tel behulp van een geautomatiseerde celtelinrichting of een hemocytometer.
   3. Re-schorten 600.000 CRC's in 250 ul geconditioneerde media (CM) en toe te voegen aan de juiste richting (filter naar beneden) cultuur insert (Figuur 1B). Dit wordt aangeduid als de binnenkamer.
      Opmerking: CM F-media geconditioneerd door bestraalde J2 cellen en bevat 10 urn Y-27632 zoals hierboven beschreven ^{7, 8, 9, 11.}
5. Toepassen 2 ml CM aan de buitenkamer van de plaat met 6 putjes en incubeer bij 37 ° C overnacht (gedurende ten minste 18 uur).
6. Verwijder voorzichtig de CM op de binnenkamer met 1 mL of 200 pi pipet en voeg langzaam differentiatie medium (DM) naar de binnenkamer met een 1 ml pipet tot vol. Wees voorzichtig om niet verstoren de cellaag.

le "> 2. Onderhoud van de 3D-Cultures

1. Controleer de culturen elke dag. Gezonde cellen verschijnen zoals in figuur 2.
2. Verander het GH in de buitenkamer elke dag of om de andere dag, afhankelijk van het metabolisme van de cellen.
3. Wanneer de media van de binnenkamer verandert van kleur (geel), verwijder voorzichtig de media op de binnenste filter kamer met een 1 ml of 200 pi pipet.
4. Aspireren de media in de buitenste 6 wells plaat kamer met een aspiratie tip.
5. Met behulp van een 1 ml pipet, langzaam toe te passen verse DM naar de binnenkamer tot de volledige. Wees niet te schrapen of anderszins verjagen de cellaag.
6. Vervang de media in de buitenkamer met 2 ml vers CM.
7. Handhaving van de culturen voor 2 weken, en vervolgens overgaan tot verwerking voor de gewenste bimoleculaire isolement.
   Opmerking: Elke rij in 6 wells plaat, een totaal van zes inzetstukken (Figuur 1B), worden per experiment verwerkt om voldoende cellen te verkrijgen DNA, RNA of eiwit voor analyse.
8. Aspiraat media in de buitenkamer en spoelen met 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
9. Haal het papier uit de binnenste kamer met een 1 ml of 200 pi pipet en voeg 500 pi PBS. Er geen krassen of anderszins de cellen op het membraan storen.
10. Aspireren PBS uit de buitenkamer en verwijder PBS uit de binnenkamer met 1 mL of 200 pi pipet. Nadat de PBS is verwijderd, gaat u rechtstreeks naar de juiste toepassing hieronder beschreven. Sta niet toe dat het membraan te drogen. De cultuur kan kort worden bewaard in de PBS totdat de applicatie is klaar om te beginnen.

3. Verwerking van de Filters voor Pellet Banking

1. Voeg 100 ul 0,25% trypsine-EDTA bij elke binnenkamer en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
2. Kort zorgvuldig schudden / schrapen de cellen op het membraanoppervlak met 200 pi pipet terwijl op en neer pipetteren (vermijd puncTuring het membraan). Incubeer gedurende 1 min bij 37 ° C.
3. Voeg 250 ul CM van de eerste binnenkamer en pipet zachtjes op en neer naar het filter te spoelen.
4. Overdracht geresuspendeerde cellen aan de aangrenzende filterkamer die hetzelfde medium bevat en omstandigheden te herhalen en neer te pipetteren.
5. Herhaal deze procedure voor elk van de inzetstukken van een aandoening. Verzamelen en overdragen cellen een 1,5 ml centrifugebuis.
6. Spoel elk binnenste kamer met een extra 100-200 ui CM om eventuele resterende cellen te verzamelen. Voeg toe aan de 1,5 ml centrifugebuis in stap 3.5.
7. Spin de cellen bij 423 xg in een microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
8. Zuig het supernatant en was de cel pellet eenmaal met 1000 pi PBS.
9. Spin opnieuw bij 423 xg in een microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
10. Aspireren PBS en bevriezen bij -80 ° C voor later gebruik.

4. Het verwerken van de Filters voor RNA of DNA Isolation

1. Voeg 200 ul van guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie en dergelijke reagens om de binnenkamer en kort schudden de cellen op het membraan oppervlak door en neer te pipetteren.
2. Incubeer bij de extractie reagens voor 5 min bij kamertemperatuur met de buitenkamer droog.
   1. Aangezien het filter kunnen dissociëren van het inzetstuk, was het ontkoppeld filtermembraan pipetteren de extractieoplossing en neer. Verzamel zoveel van de extractie reagens mogelijk door het kantelen van de plaat met 6 putjes en aspireren van eventueel resterende vloeistof.
3. Volg protocol van de fabrikant voor de zuivering en terugwinning van DNA, RNA of eiwit.

5. Het verwerken van de Filters voor eiwit Isolation

1. Plaats het filterelement in de 6 wells plaat op het ijs. Om de binnenkamer, voeg 10 ul van proteïne lysisbuffer aangevuld met 1 mM natriumfluoride (NaF), 1 mM natrium vanadaat (NIW), 100 mM dithiothreitol (DTT) en 100 pl anti-protease cocktail.
2. Schud / schrapen de cellen op het membraanoppervlak met 20 ul pipet tijdens en neer te pipetteren. Vermijd het genereren van bellen in de lysisbuffer.
3. Incubeer de 6 wells plaat met filter inzetstukken op ijs gedurende 10 min.
4. Herhaal schrapen en spoel het membraanoppervlak met de lysisbuffer.
5. Verzamel de lysaten van de inzetstukken 6 en overbrengen in een 1,5 ml centrifugebuis op ijs.
6. Spoel het eerste membraan met een extra 10 ul lysisbuffer en transfer naar het volgende filter.
7. Herhaal stap 5,6 voor inzetstukken, verzamelen alle resterende lysis bufferoplossing toevoegen 1,5 ml buis (stap 5,5).
8. Incubeer het monster op ijs gedurende nog 5 min.
9. Centrifugeren op maximale snelheid (16.873 xg in een tafelblad centrifuge) gedurende 15 min bij 4 ° C.
10. Pipette lysaat supernatant in een nieuwe 1,5 ml buis.
11. Overgaan tot de analyse van eiwitconcentratie of store lysaten bij -80 ° C.

6. Processing voor H & E en Immuno-kleuring

1. Voeg 500 ul en 1 ml 10% NBF (neutraal gebufferde formaline) aan de binnenste en buitenste kamer en laat incubeer overnacht bij 4 ° C.
2. Zuig het NBF van de buitenkamer en voeg 1 ml hydroxyethyl agarose (HEA) verwerken gel om een ​​1,5 ml centrifuge. Langzaam smelt de agarose in een magnetron met behulp van laag vermogen en herhaalde 10-20 s pulsen totdat de agarose wordt gesmolten.
3. Houd de HEA in een 37 ° C warm bad om stolling te voorkomen tot gebruik.
4. Verwijder de NBF uit de binnenkamer en 25 ui gesmolten HEA toepassing op de binnenkamer en laat de agarose te stollen gedurende 2-5 min.
5. Natte 2 foam histologie pads in 10% NBF en plaats een pad in een inbedding cassette (zie Figuur 3D).
6. Gebruik een # 11 scalpel blade (die een zeer scherpe, puntige fijn blad heeft) aan de filter scoren vanaf de onderzijde van het inzetstukkamer, gedeeltelijk los uit de plastic insert kamer.
7. Plaats een kleine hoeveelheid (100-200 ul) van NBF in een petrischaal en dompel de gedeeltelijk losgeraakt filter in de NBF (figuur 3A).
8. Met een # 10 scalpel blade voorzichtig drukken tegen het midden van het filter aan de binnenkant van het inzetstuk kamer, volledig los van het filter het inzetstuk vat (Figuur 3B). Als er een deel van het filter dat nog is bevestigd aan het vat, verbreken met de scalpel.
9. Snijd de HEA-gecoate filter in de helft met de # 10 mes scalpel (figuur 3C).
10. Plaats elke helft van het filter op het schuimkussen in de histologie cassette bereid in stap 6.4 (Figuur 3D).
11. Voeg de tweede 10% NBF doordrenkte spons om de cassette, daartussen het filter.
12. Snap verzegeling van de cassette, plaats in de NBF en incubeer overnacht.
13. Procesfilters in paraffineblokken voor snijden en kleuring alseerder ¹² beschreven.

Resultaten

De celkweek insert systeem is een relatief eenvoudige en snelle procedure voor het produceren van 3D-kweken prostate CRC's die luminale celdifferentiatie ondersteunt. Een schema van het systeem wordt getoond (Figuur 1A) aandacht voor de toepassing van de gelatine coating op het onderoppervlak van het filterelement. De inzetstukken zijn alleen vernietigd voor de toepassing van de gelatine. In figuur 1B de filters in de juiste richting voor het kweken....

Discussie

Primaire cellijnen zijn een belangrijke en zich snel ontwikkelende platform voor kankeronderzoek. De cultuur insert-gebaseerde 3D-cultuur systeem ondersteunt de differentiatie van primaire prostaat CRCs binnen twee weken termijn. De CRC filter methode vertegenwoordigt een nieuwe, medium throughput methode voor prostaatkanker onderzoek. Bestaande muis PDX merken tijdrovend en zeer duur, en veel van de PDX monsters niet in kweek, beperken onderzoeker geïnitieerde experimenten en hun nut. Bovendien, terwijl slagingspercent...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Corning Costar Snapwell Culture Inserts	Corning	3801
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Well	Falcon	353046
Gelatin 0.1% in water	Stemcell Technologies	7903
Sterile Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Sterile Standard Scalpel 11 Blade	Integra Miltex	4411
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermofisher Scientific	89900
Sodium Fluoride	Fishcer Scientific	S299-100
Sodium Vanadate	Fishcer Scientific	13721-39-6
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3483123
Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)	Sigma-Aldrich	P8340
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Thermofisher Scientific	25030081
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Nutrient Mix Media	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor	Enzo	ALX-270-333-M025
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insulin	Thermofisher Scientific	12585-014
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamicin	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026
Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Non-Adherent Dressing	Telfa	KDL2132Z
Cell Culture Dish	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes	Crystalgen	CG-M492