Hier presenteren we een methode voor het opzetten van een snel in vitro systeem dat het driedimensionale kweken en de daaropvolgende luminale differentiatie van primaire prostaatepitheelcellen ondersteunt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Rapid Filter Insert-gebaseerde 3D Cultuur System for Primary Prostaat Cel Differentiatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Voorwaardelijk geherprogrammeerd cellen (CRC) een duurzame werkwijze voor primaire celkweek en het vermogen om grote "levende biobanken 'van patiënt afgeleide cellijnen te ontwikkelen. Voor veel soorten epitheliale cellen hebben verschillende driedimensionale (3D) cultuur benaderingen beschreven die een verbeterde gedifferentieerde toestand ondersteunen. Terwijl CRCs hun lineage inzet voor het weefsel waaruit ze worden geïsoleerd behouden, falen ze uit te drukken veel van de differentiatie markers in verband met het weefsel van herkomst wanneer gekweekt onder normale tweedimensionale (2D) kweekomstandigheden. De toepassing van patiënt afgeleide CRC voor prostaatkanker onderzoek te versterken, is een 3D cultuur format gedefinieerd die snel (2 weken totaal) luminale celdifferentiatie in normale en tumor-afgeleide prostaat epitheliale cellen mogelijk maakt. Hierin wordt een filterelement-gebaseerd formaat beschreven voor het kweken en differentiatie van normale en kwaadaardige prostaat CRC. A detailed beschrijving van de voor cellen en -verwerking zijn voor immunohistochemische en immunofluorescentie kleuringen worden voorzien. Gezamenlijk de 3D cultuur format beschreven, in combinatie met de primaire CRC lijnen, een belangrijk middellange doorvoer modelsysteem voor hoog- biospecimen gebaseerde prostate onderzoek.
Inleiding
De identificatie en toepassing van kankertherapieën die op maat gemaakt kunnen individuen een hoofddoel in kankeronderzoek. Onlangs zijn er nieuwe benaderingen ontwikkeld die zorgen voor een grotere gemak bij het opzetten van primaire celculturen potentieel verschaffen leibanen van identificeren en testen gepersonaliseerde therapieën. Bijvoorbeeld, de R-spondin gebaseerde prostate organoïde benadering 1 zorgt voor driedimensionale (3D) het kweken van normale en metastatische prostaatkankercellen in commerciële extracellulaire matrix (bijvoorbeeld Matrigel), terwijl de voorwaardelijk herprogrammeren van cellen (CRC) methode ontwikkeld ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. De vaststelling van de 3D-Cell Culture Insert System
- Plaats 2 polycarbonaat celkweek inserts in een omgekeerde oriëntatie (filter zijde naar boven) in een plaat met 6 putjes (Figuur 1A).
- Een dunne laag van 0,1% gelatine in water aan de onderzijde van het inzetstuk en laten drogen (10-20 min) in een biologische veiligheidskast om steriliteit te handhaven.
- Herhaal stap 1.2 twee keer voor een totaal van 3 toepassingen van 0,1% gelatine op de inzetstukken.
NB: De gelatine coating limiet diffusie tussen de kamers te helpen. - Om de primaire CRC's van standaard kweekomstandigheden verzamelen, voeg 5 ml P....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De celkweek insert systeem is een relatief eenvoudige en snelle procedure voor het produceren van 3D-kweken prostate CRC's die luminale celdifferentiatie ondersteunt. Een schema van het systeem wordt getoond (Figuur 1A) aandacht voor de toepassing van de gelatine coating op het onderoppervlak van het filterelement. De inzetstukken zijn alleen vernietigd voor de toepassing van de gelatine. In figuur 1B de filters in de juiste richting voor het kweken........
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Primaire cellijnen zijn een belangrijke en zich snel ontwikkelende platform voor kankeronderzoek. De cultuur insert-gebaseerde 3D-cultuur systeem ondersteunt de differentiatie van primaire prostaat CRCs binnen twee weken termijn. De CRC filter methode vertegenwoordigt een nieuwe, medium throughput methode voor prostaatkanker onderzoek. Bestaande muis PDX merken tijdrovend en zeer duur, en veel van de PDX monsters niet in kweek, beperken onderzoeker geïnitieerde experimenten en hun nut. Bovendien, terwijl slagingspercent.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gesteund door T32 (CA 9686-18) en TL1 (TL1TR001431) postdoctorale opleiding subsidie awards (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), alsmede U01 PAR-12-095 (Kumar) en P30 CA051008-21 (Weiner). Monster fixatie, snijden en kleuring werd uitgevoerd in de Lombardi Comprehensive Cancer Center histologie en Tissue Shared Resource. Wij danken Richard Schlegel voor nuttige discussies. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Cancer Institute en de National Institutes of Health.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 | |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z | |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
Referenties
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
