Methodenartikel

Zoogdiercelcapsulatie in Alginaatkralen Met Een Eenvoudig Verrijkt Vaartuig

DOI:

10.3791/55280

⸱

29 juni 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, McGill University, 2Michael Smith Laboratories & Department of Chemical and Biological Engineering, University of British Columbia, 3Michael Smith Laboratories & Department of Pharmaceutical Sciences, University of British Columbia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze video en manuscript beschrijven een emulsie gebaseerde methode om zoogdiercellen in 0,5% tot 10% alginaatkralen te inkapselen die in grote batches kunnen worden geproduceerd onder gebruikmaking van een eenvoudig geroerd vat. De ingekapselde cellen kunnen in vitro worden gekweekt of getransplanteerd voor toepassingen op het gebied van cellotherapie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellincapsulatie in alginaatkralen is gebruikt voor geïmmobiliseerde celcultuur in vitro , alsmede voor immunoisolatie in vivo . Inbeslagneming van de alvleesklier is uitgebreid bestudeerd als middel om het overleving van het eiland te verhogen bij allogene of xenogene transplantaties. Alginale inkapseling wordt vaak bereikt door spuit extrusie en externe gelering. Met behulp van deze werkwijze vallen celhoudende alginaatdruppels die gevormd worden aan de punt van mondstukken in een oplossing die tweewaardige kationen bevat die ionotrope alginaatgelering veroorzaken als ze in de druppels diffunderen. De vereiste druppelvorming bij de mondstukpunt beperkt de volumetrische doorvoer en alginaatconcentratie die bereikt kan worden. Deze video beschrijft een schaalbare emulgeringswerkwijze om zoogdiercellen in 0,5% tot 10% alginaat te inkapselen met 70% tot 90% celoverleving. Door deze alternatieve werkwijze worden alginaatdruppeltjes die cellen en calciumcarbonaat bevatten geëmulgeerd in minerale olie, folVerminderd door een afname in de pH die leidt tot interne calciumvrijstelling en ionotrope alginaatgelering. De huidige methode laat de productie van alginaatkralen binnen 20 minuten emulgeren toe. De benodigde apparatuur voor de inkapselingstap bestaat uit eenvoudige geroerde vaten die beschikbaar zijn voor de meeste laboratoria.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mammale celincapsulatie is breedweg bestudeerd als een middel om getransplanteerde cellen te beschermen tegen immuunafwijzing 1 of om een ​​driedimensionale ondersteuning voor geïmmobiliseerde celcultuur 2 , 3 , 4 te verschaffen . Pancreatische holle capsule in alginaatkralen is gebruikt om diabetes in allogene 5 , 6 of xenogene 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 knaagdieren om te keren. Preklinische en klinische studies van ingekapselde transplantatie van het alvleesklier om typ 1 diabetes te behandelen zijn aan de gang 13 , 14 , 15 . Voor transplantatie toepassingen of grotere schaalIn vitro geïmmobiliseerde celproductie worden in de buisgeneratoren op mondstuk gebaseerde spuitgeneratoren algemeen gebruikt. Typisch wordt een mengsel van alginaat en cellen gepompt door een mondstuk om druppels te vormen die in een geroerde oplossing bevattende divalente kationen, resulterend in de externe gelering van de druppels, vallen. Coaxiale gasstroom 16 , 17 , spuitvibratie 18 , elektrostatische afstoting 19 of roterende draden 20 vergemakkelijken druppelvorming bij de mondstukpunt.

De belangrijkste nadelen van conventionele kraalgeneratoren zijn hun beperkte doorvoer en het beperkte bereik van oplossingsviscositeiten die resulteren in voldoende kraalvorming 21 . Bij hoge stromingssnelheden breekt de vloeistof uit het mondstuk op in druppels kleiner dan de diameter van de mondstuk, afnemende maatregeling. Multi-nozzle kraalgeneratoren kunnen worden gebruikt om de doorvoer te verhogen, maarDe uniforme verdeling van de stroming tussen de mondstukken en het gebruik van oplossingen> 0.2 Pas is problematisch 22 . Ten slotte wordt verwacht dat alle mondstukken gebaseerd zijn op schade aan eilandjes, aangezien de diameter van de gebruikte spuitpunten tussen 100 μm en 500 μm bedraagt, terwijl ~ 15% van de menselijke holtes groter dan 200 μm 23 kan zijn .

In deze video beschrijven we een alternatieve methode om zoogdiercellen te inkapselen door druppels te vormen in een enkele emulgeringsstap in plaats van drop-by-drop. Aangezien de kraalproductie in een eenvoudig geroerd vat wordt uitgevoerd, is de methode geschikt voor kleine (~ 1 ml) tot grootschalige (10 3 L-range) kraalproductie met lage apparatuurskosten 24 . Met deze methode kan de productie van kralen met hoge sfericiteit worden toegepast met behulp van een breed scala van alginaatviscositeiten met korte ( bijv. 20 min) kraal generatie tijden. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld door Poncelet et al. 25 , 26 en gebruikt om DNA 27 , eiwitten 28 te isoleren die insuline 29 en bacteriën 30 omvatten. Wij hebben deze methodes onlangs aangepast aan de inkapseling van zoogdiercellen met behulp van pancreas-bèta-cellijnen 31 , 32 en primaire pancreasweefsel 32 .

Het principe van de werkwijze is het opwekken van een water-in-olie emulsie die bestaat uit alginaatdruppels in minerale olie, gevolgd door inwendige gelering van de alginaatdruppels ( Figuur 1 ). Eerst wordt de inkapselende stof ( bijvoorbeeld cellen) gedispergeerd in een alginaatoplossing die een fijne korrelkalsiumzout bevat met een lage oplosbaarheid bij de initiële proces pH. Het alginaatmengsel wordt vervolgens toegevoegd aan een geroerde organische fase om een ​​emulsie te creëren, gewoonlijk in aanwezigheid van asurfactant. In het geval van zoogdiercelcapsulatie kunnen componenten aanwezig in serum fungeren als oppervlakteactieve stoffen. Vervolgens wordt de pH verminderd om het calciumzout te solubiliseren door een olieoplosbaar zuur dat in de waterfase verdeelt, toe te voegen. Azijnzuur, met een deeltjescoëfficiënt <0,005 33 van minerale olie / water, moet vooraf opgelost worden in olie, daarna aan de emulsie toegevoegd worden, waar het in de oliefase gemengd wordt en snel in de waterfase 34 verdeelt. Figuur 2 illustreert de chemische reacties en diffusie die plaatsvinden tijdens de verzuring en de inwendige gelatingsstap. Tenslotte worden de ingekapselde cellen hersteld door fase-inversie, fasescheiding versneld door centrifugeren, herhaalde wasstappen en filtratie. Deze stappen kunnen vervolgens worden gevolgd door kraal- en celmonstering voor kwaliteitscontroleanalyses, in vitro celkweek en / of transplantatie van de ingekapselde cellen.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematisch van het emulgeringsgebaseerde proces om zoogdiercellen te inkapselen. Kralen worden eerst geproduceerd door emulgeren van een alginaat-, cel- en CaCO3-mengsel in minerale olie (stappen 1 en 2 in het schema), waardoor inwendige gelering wordt geactiveerd door azijnzuur toe te voegen (stap 3). De geleerde kralen worden vervolgens gescheiden van de olie door een waterige buffer aan te brengen om fase-inversie aan te trekken (stap 4), gevolgd door centrifugeren en olie-aspiratie (stap 5) en vervolgens filtratie (stap 6). Tenslotte worden de kralen verzameld op het filter overgebracht in celkweekmedium voor in vitro kweek of voor transplantatie. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-introduction-2
Figuur 2: Reacties en diffusiestappen die zich voordoen tijdens interne gelatie. (1) azijnzuur wordt toegevoegd aan de organische fase en wordt door convectie naar de alginaatdruppels vervoerd. (2) Het azijnzuur verdeelt in de waterfase. (3) In aanwezigheid van water dissocieert en verspreidt het zuur de CaCO 3- korrels die in donkerblauw worden afgebeeld. (4) De H + -ionen worden uitgewisseld met de Ca2 + -ionen in CaC03, waardoor Ca2 + -ionen vrijkomen. (5) De calciumionen diffunderen tot ze ongereagd alginaat tegenkomen, wat leidt tot de ionotrope verknoping van de alginaatkettingen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

In tegenstelling tot conventionele nozzle-based cell encapsulators, is een brede kralengrootte verdeling expeCted uit dit proces door het mechanisme van druppelvorming in geroerde emulgatie. Voor een subset van applicaties kan deze kralengrootteverdeling problematisch zijn. Bijvoorbeeld, een grotere fractie van cellen kan worden blootgesteld aan het kralenoppervlak in kleinere kralen. Als beperkingen van voedingsstoffen ( bijv. Zuurstof) een zorg zijn, kunnen deze beperkingen in grotere kralen worden verergerd. Een voordeel van de geroerde emulgeringswerkwijze is dat de gemiddelde korrelgrootte gemakkelijk kan worden aangepast door de roering gedurende de emulgeringsstap te veranderen. De breedteverdeling kan ook worden uitgebuit om het effect van kraalgrootte op ingekapselde celprestaties te bestuderen.

Zoogdiercelcapsulatie door emulsificatie en inwendige gelering is een interessant alternatief voor laboratoria die niet zijn uitgerust met een kraalgenerator. Bovendien biedt deze methode gebruikers de mogelijkheid om de verwerkingstijd te verminderen of kralen te genereren bij zeer lage of zeer hoge alginaatconcentratenaties.

Het hieronder beschreven protocol beschrijft hoe cellen in 10,5 ml 5% alginaatoplossing bereid in 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) buffer worden ingekapseld. Het alginaat bestaat uit een 50:50 mengsel van transplantatiegraad LVM (laag viscositeit hoog mannnuronzuurgehalte) en MVG (medium viscositeit hoog guluronzuurgehalte) alginaat. Calciumcarbonaat bij een uiteindelijke concentratie van 24 mM wordt gebruikt als het fysieke verknopingsmiddel. Lichte minerale olie vormt de organische fase, terwijl azijnzuur wordt gebruikt om de emulsie te verzuren en interne gelering te activeren. Echter, het alginaat type en samenstelling, evenals de geselecteerde procesbuffer, hangt af van de gewenste toepassing 32 . Een verscheidenheid van alginaat types (zie tabel van materialen) zijn gebruikt om kralen te produceren met dit protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereid de alginaatoplossing, de CaCO 3- suspensie en de versuurde olie op

  1. Bereid de procesbuffer en het medium voor.
    1. Bereid de typische procesbuffer aan die wordt gebruikt voor het genereren van hoge concentratie alginaatkralen door gebruik te maken van 10 mM HEPES, 170 mM NaCl. Stel de pH op op 7.4.
    2. Bereid het typische kweekmedium aan met behulp van Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) die 10% foetaal runder serum (FBS), 6 mM glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine bevat.
  2. Bereid de alginaat voorraadoplossing op 1,17 voud de uiteindelijke gewenste concentratie in de kralen.
    1. Weeg eerst de juiste hoeveelheid alginaatpoeder. Bijvoorbeeld, om een ​​uiteindelijke concentratie van 5% alginaat te verkrijgen met 50:50 LVM en MVG alginaat, weeg in totaal 1,17 g natriumalginaat door 0,583 g LVM-alginaatpoeder en 0,583 g MVG-alginaatpoeder te combineren.
    2. Plaats 20 ml procesbuffer in een autocHoudbare glazen pot op een magnetische roerplaat en roeren bij ~ 200 rpm. Voeg het natriumalginaatpoeder geleidelijk toe aan de oplossing.
    3. Laat de oplossing overnacht roeren met een lage snelheid. Zet indien nodig de kolf op de roerplaat.
    4. Als de oplossing onvolledig is opgelost, zet de fles vast op een roterende mixer en blijf bij 37 ° C gedurende nog eens 24 uur.
    5. Steriliseer de alginaatoplossing door de oplossing 30 minuten te autoclaven in een vat dat minder dan half vol is. Laat de temperatuur onder 60 ° C dalen voordat u de oplossing ophaalt.
    6. Verwijder eventueel deeltjes door de alginaatoplossing kort na autoclaven te filteren voordat het kamertemperatuur bereikt, terwijl de viscositeit voldoende laag blijft.
  3. Bereid de calciumcarbonaat suspensie op 21-voudig de uiteindelijke gewenste concentratie voor inwendige gelering.
    1. Weeg het CaCO 3 poeder af. Bijvoorbeeld advertentieD 1 g CaCO3 tot 20 ml procesbuffer om 24 mM CaC03 te verkrijgen als de uiteindelijke concentratie van de geleringsmiddel.
    2. Autoclaaf de CaCO 3 suspensie gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: De CaCO 3 concentratie zal over de tijd veranderen door het bicarbonaat-CO 2 -evenwicht. Vermijd het gebruik van dezelfde voorraad CaCO 3 suspensie voor meer dan 10 inkapselingsprocedures.
  4. Autoklaaf het geroerde vat dat gebruikt wordt voor het emulgeringsproces. Voor gebruik, verwijder eventueel sporen van gecondenseerd water in de spinnerfles.
  5. Onmiddellijk voor het emulsificatieproces, bereide de verzuurde olie. Oplossen 44 μL azijnzuur per 11 ml minerale olie in een 50 ml conische buis.
    OPMERKING: een algemene fout is onvolledige ontbinding van het azijnzuur. Vermijd pipettering van kleine hoeveelheden azijnzuur en zorg ervoor dat het azijnzuur volledig wordt opgelost in olie door herhaalde vortexing.
    VOORZICHTIG: azijnzuur is een giftige an D vluchtig zuur. Hanteer dit reagens onder een afzuigkap en houd de azijnzuur / olieoplossing in een gesloten houder tot de emulgeringsstap. Raadpleeg de MSDS-informatie over dit reagens voor nadere informatie.
  6. Laat alle oplossingen de kamertemperatuur bereiken voordat u verder gaat met de celincapsulatie.

2. Alginaat Kralen Generatie Door Emulsificatie En Interne Gelering

  1. Plaats 10 ml lichte minerale olie in de spinnerkolf en start met een lage rotatiesnelheid ( bijvoorbeeld 250 rpm voor de spinnerfles die in deze video wordt gebruikt).
  2. Als de cellen die voor het proces worden gebruikt, afkomstig zijn van hechtende culturen, past u trypsine op om de cellen op te schorten. Beëindig de reactie door FBS-bevattende medium of trypsine-inhibitor toe te voegen en een monster te verzamelen voor cellenetumeratie.
    1. Bepaal de celconcentratie en levensvatbaarheid na Trypan-blauwvlek met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller, zoals eerder beschrevenAss = "xref"> 32.
  3. Centrifugeer de cellen gedurende 7 minuten bij 300 xg en was ze eenmaal in het gewenste medium voor celimmobilisatie. Zorg ervoor dat dit medium emulgatoren bevat, zoals FBS of boviene serumalbumine (BSA). Gebruik bijvoorbeeld DMEM die 10% FBS bevat.
  4. Zet de celpelletje opnieuw op in hetzelfde medium om 10,5 keer de gewenste eindconcentratie in de kralen te verkrijgen.
  5. Voeg 1,1 ml van de 10,5-voudige geconcentreerde cel voorraad toe aan 9,9 ml van de alginaatoplossing. Voeg vervolgens 550 μL CaCO 3 suspensie toe en meng door roeren met een steriele spatel om een ​​gelijkmatige verdeling van de CaCO 3 te waarborgen.
  6. Breng onmiddellijk 10,5 ml van het alginaat-, cel- en CaCO3-mengsel over in de roerolie door een injectiespuit te gebruiken.
    OPMERKING: Voor zeer viskeuze oplossingen, aspireren en uitwerpen het mengsel langzaam om luchtbellen te vermijden. In sommige gevallen is het de voorkeur om de agitatie te stoppen terwijl het mengsel aan de kolf wordt toegevoegd om te vermijdenAlginaat inbrengen op de waaieras.
  7. Onmiddellijk na het toevoegen van het alginaat-, cel- en CaC03-mengsel aan de olie, verhoogt de agitatietempo.
    OPMERKING: Voor het 5% LVM: MVG-alginaat dat hier wordt gebruikt, werd een rotatiesnelheid van 1025 rpm toegepast om kralen met een diameter van ongeveer 900 μm te produceren die geschikt zijn voor in vitro cultuur 35 . Hogere rotatiesnelheden en lagere alginaatconcentraties zullen leiden tot lagere gemiddelde kraaldiameters, zoals beschreven in eerdere publicaties 25 , 32 . Geringe veranderingen in de waaier en de geometrie van de vaten, evenals alginaat eigenschappen, kunnen de gemiddelde diameter van de kraal sterk beïnvloeden. Voor elke verandering in vaartuigconfiguratie of alginaatpartij moet een standaardkromme met betrekking tot de gemiddelde diameter van de oppervlakte van de oppervlakte van het oppervlak op de rotatiesnelheid worden gegenereerd 32 .
  8. Start de timer en emulgeer het alginaat gedurende 12 minuten.
  9. Voeg 10 ml tHij olie- en azijnzuuroplossing om de emulsie te verzuren, de CaCO3 op te lossen en derhalve het alginaat fysiek te crosslinken in gelerende kralen. Laat 8 minuten toe voor deze verzuringstap.

3. Bead Recovery

  1. Verminder de roering tot 400 rpm. Voeg 40 ml procesbuffer gemengd met 10% medium toe om de pH te verhogen en fase-inversie te veroorzaken.
  2. Stop de roering 1 minuut later en laat het mengsel overbrengen naar 50 ml centrifuge buizen. Spoel de spinnerkolf met een extra 20 ml medium en voeg deze toe aan de buis. Zoveel mogelijk waterfase van de spinnerkolf afzetten alvorens de oliefase te aspireren om kraalcontact met de oliefase te minimaliseren.
    OPMERKING: Gebruik bij deze stap een grote boringpipet ( bijv. 25 ml pipet) en vanaf dit punt om de kralen te beschadigen. Voor kleinere volumes kan de kraalvering ook worden gemanipuleerd met snijpipetjes. Om dergelijke tips te krijgen, snijd het uiteinde van de pipetpunt met een schaar whIle dragen oogbescherming.
  3. Centrifugeer de buizen gedurende 3 minuten bij 630 xg om de kraalafzetting en fasescheiding te versnellen.
  4. Verwijder de olie en de overmaat waterige oplossing door te aspireren met een Pasteur pipette.
  5. Was de kralen minstens een keer met medium. Filter de parelsuspensie op 40 μm nyloncelspanners en aspirate overmaat vloeistof die geassocieerd is met de kralen onder de zeef. Breng de kralen in een bekend volume medium door middel van een steriele spatel.
    OPMERKING: Kleiner of grotere poriegrootte filters kunnen in deze stap worden gebruikt, afhankelijk van de gewenste minimale kraaldiameter. Echter, zwaartekrachtfiltrering wordt aanbevolen in plaats van drukgedreven filtratie via sub-micron poriëngrootte filters om schade aan de kralen te vermijden.
  6. Meet de kraalvolume volumeplaatje (volume na het toevoegen van de kralen, minus het volume voorafgaand aan het toevoegen van de kralen) en vul het medium op om de gewenste kraal te verkrijgen: totale volumeverhouding, die typisch 1: 5 of 1 ml kralen in4 ml medium. Gebruik vanaf dit punt altijd grote boringpijpen om de kralen te beschadigen.
  7. De ingekapselde cellen overbrengen in T-kolven voor in vitro- kweek- of transplantatie-experimenten.

4. Kwaliteitscontrole en toepassingen

OPMERKING: Om de ingekapselde cel- en kraalkwaliteit te waarborgen, moet de grootte van de kralengrootte en de celoverleving na het proces worden gekwantificeerd. Omgekeerde de gel om de cellen van binnen de kralen te herstellen voor verdere analyse wordt gewoonlijk uitgevoerd.

  1. Om de kralengrootteverdeling te beoordelen, vlek de kralen met toluidine blue-O.
    1. Plaats 0,5 ml kralen in 4 ml procesbuffer die 10% compleet medium bevat.
    2. Voeg 500 μl van een 1 g / l toluidineblauwe oplossing bereid in procesbuffer toe.
    3. Incubeer gedurende 60 minuten in een conische buis op een roterende shaker bij 50 rpm.
    4. Voeg 5 ml procesbuffer in die 10% compleet medium bevat en immedBreng de kralen en de oplossing over in een Petri-schotel en kopieer beelden op een kleine vergrootingsmicroscoop of gebruik een handheld digitale camera. Plaats indien gewenst de Petri-schotel op een lichtbox voordat u beelden met een handcamera ontvangt om het contrast te verbeteren en schaduwen te vermijden.
    5. Voer beeldanalyse uit om de grootte van de kralenmaat te kwantificeren zoals eerder beschreven 32 , bijvoorbeeld met behulp van beeldanalyse freeware 36 .
  2. Om de celoverleving kwalitatief te beoordelen, vlek de cellen met behulp van ethidium homodimer om dode cellen en calcein AM te identificeren om levende cellen te identificeren.
    1. Voeg 1 volume kralen toe aan 4 volumes procesbuffer die 10% compleet medium bevat.
    2. Voeg de juiste hoeveelheid calcein AM en ethidium homodimeren voorraadoplossingen toe om respectievelijk 4 μM en 2 μM concentraties te verkrijgen. Generate single stain controls door slechts één van de reagentia toe te voegen aan sommige kraalmonsters.
    3. Incubeer de kralen voor 20 minuten op ijs.
    4. Plaats de oplossing tussen een glijbaan en deklaag met behulp van een spacer zoals een o-ring om de kralen niet te comprimeren.
    5. Ga verder naar fluorescentiemicroscopie. Gebruik de enkele vlekken regelaars om fluorescentie bloeden door te gaan. Selecteer geschikte fluorescentiefilters op basis van de excitatie- / emissiegolflengten die geassocieerd zijn met calcein AM (494/517 nm) en ethidium homodimeer gebonden aan DNA (528/617 nm).
  3. Om de cellen van de kralen te herstellen voor verdere analyse, degel de alginaat met behulp van citraat of een andere chelaterende oplossing.
    1. Bereid een verkleurende oplossing die 55 mM citraat, 10 mM HEPES en 95 mM NaCl bij pH 7,4 bevat.
    2. Meng deze oplossing met 10% medium en voeg vervolgens 1 ml alginaatkralen toe aan 9 ml van het mengsel.
    3. Degel de kralen op ijs met 75 rpm roering gedurende 20 minuten.
      OPMERKING: De cellen kunnen nu worden gebruikt om te analyseren of verwijderd te worden van de afgewerkte alginaatoplossingIon door centrifugeren. Bijvoorbeeld, kan de levensvatbaarheid van de cellen na afbellen gekwantificeerd worden door Trypan Blue-kleuring. Als alternatief kunnen de cellen gecentrifugeerd en gewassen worden, gevolgd door mRNA, DNA- en / of proteïne-monsterneming en analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aan het einde van het emulgerings- en inwendige geleringsproces moet een kraalvolume gelijk aan het initiële alginaat- en celmengselvolume worden hersteld. De kralen moeten zeer sferisch zijn met weinig gebreken ( figuur 3 ). De kralen moeten voldoende sterk zijn om pipettering door middel van grote boorpipetten te weerstaan. Bij hoge alginaatconcentraties kunnen ingekapselde olie- of luchtdruppels in de kralen worden waargenomen. Dit komt waarschijnli...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende stappen (afgebeeld in figuur 2 ) tijdens de interne gelatingsreactie kunnen de algemene kinetiek beperken. Voor calciumcarbonaatkorrels groter dan ~ 2,5 μm, is de snelheid van carbonaatoplossing aangetoond dat de snelheidsbeperkende 26 , 44 is . De verzuringstap die leidt tot interne calciumvrijstelling is ook aangetoond dat deze de kritische procesvariabele is die de overleving van cellen 32 beïnvloedt. De ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Jill Osborne voor haar grondlegging op het emulgeringsproces en Lauren Wilkinson voor technische ondersteuning. Wij bedanken Dr. Igor Laçik, dr. Timothy J. Kieffer en dr. James D. Johnson voor hun inzet en samenwerking. Wij danken Diabète Québec, JDRF, ThéCell, het Centre québécois sur les matériaux fonctionnels (CQMF), de Natuurwetenschappen en Technische Onderzoeksraad (NSERC), het Centrum voor Human Islet Transplantatie en Beta-Cell Regeneration, het Canadese stamcelnetwerk, de Michael Smith Foundation for Health Research, de Fonds québécois de la recherche sur la nature et les technologies en COST 865 voor financiële steun.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagentia en verbruiksartikelen
LVM alginate (transplantatiekwaliteit)NovamatrixNiet van toepassingAangeduid als "alginate #1" in de resultaten.
MVG alginate (transplantatiekwaliteit)NovamatrixNiet van toepassingAangeduid als "alginate #2" in de resultaten.
Alginate (celcultuurkwaliteit)SigmaA0682 (lage viscositeit) of A2033 (gemiddelde viscositeit)A2033 wordt aangeduid als "alginate #3" in de resultaten.
DMEMLife Technologies11995-065
Foetaal bovien serum, gekenmerkt, Canadese oorsprongThermo Fisher ScientificSH3039603
GlutamineLife Technologies25030
Penicilline en streptomycineSigmaP4333-100ML
HEPES, celcultuur getestSigmaH4034-100G
NaClThermo Fisher ScientificS271-1
Fijnkorrelig CaCO3Avantor Materials1301-01Na het bereiden van de CaCO3 suspensie, sonificeren en binnen een maand gebruiken.
Lichte minerale olieThermo Fisher ScientificO121-4Steriele filter door een membraan met een poriegrootte van 0,22 μm voor gebruik.
Glazuur azijnzuurThermo Fisher ScientificA38-500Voorzichtig hanteren: raadpleeg MSDS.
Steriele spatelsSigmaCLS3004-100EA
Steriele nylon cel sifons, 40 µmThermo Fisher Scientific08-771-1
Serologische pipetten (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)Sarstedt86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 en 86.1685.001
Pasteur pipettenVWR14673-043
Toluidine Blauw-OSigmaT3260
Apparatuur
100 mL microcarrier spinner flasksBellco1965-00100De rotorconfiguratie met recente modellen is mogelijk niet geschikt voor adequate emulgering. Een blad dat de olie tot 0,5 cm van de bodem van de fles kan vegen, kan op maat worden gemaakt van een Teflon plaat.
Magnetische roerplaat met instelbare snelheidBellco7760-06005De rotatiesnelheid moet worden gekalibreerd (bijv. met behulp van een toerenteller) voor gebruik.
CeltellerInnovatisCedex AS20Dit systeem wordt nu verkocht door Roche. Deze geautomatiseerde celteller kan ook worden vervangen door handmatige celtelling na Trypan blauw kleuring met behulp van een hemocytometer.
LED lichtboxArtographLightPad® PRODit item kan worden vervangen door andere soorten verlichters.
HandcameraCanonPowerShot A590 ISEen verscheidenheid aan handcamera's kan worden gebruikt om beelden van toluidine blauw-o gekleurde kralen vast te leggen. Een liniaal moet naast de petrischaal met de kralen worden geplaatst voordat beelden worden gemaakt.
Fluorescentiemicroscoop met fase contrast en adequate fluorescentiefiltersOlympusIX81Er werden verschillende microscopiesystemen gebruikt om de kralen te beeldvormen. De hier getoonde resultaten zijn verkregen met een IX81 microscoop uitgerust met GFP en TRITC fluorescentiefilters. Om hele kralen te vangen, werden 4X tot 20X objectieven gebruikt, afhankelijk van de bewegingssnelheid. Live/dead kleuring beelden werden typisch vastgelegd met 20X tot 40X objectieven.
BeeldverwerkingssoftwareMolecular DevicesMetamorphEen verscheidenheid aan beeldverwerkingssoftware kan worden gebruikt om fase contrast en fluorescentie beelden te verwerven.
Beeldanalyse freewareCellProfilerNiet van toepassingEen verscheidenheid aan beeldanalysesoftware kan worden gebruikt om kralen als objecten te identificeren en de grootte van kralen te analyseren (bijv. ImageJ).

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scharp, D. W., Marchetti, P. Encapsulated islets for diabetes therapy: history, current progress, and critical issues requiring solution. Adv Drug Deliv Rev. 67-68, 35-73 (2014).
  2. Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31 (3), 505-514 (2010).
  3. Sidhu, K., Kim, J., Chayosumrit, M., Dean, S., Sachdev, P. Alginate microcapsule as a 3D platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hESC) to different lineages. J Vis Exp. (61), (2012).
  4. Tostoes, R. M., et al. Perfusion of 3D encapsulated hepatocytes--a synergistic effect enhancing long-term functionality in bioreactors. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 41-49 (2011).
  5. Duvivier-Kali, V. F., Omer, A., Parent, R. J., O'Neil, J. J., Weir, G. C. Complete protection of islets against allorejection and autoimmunity by a simple barium-alginate membrane. Diabetes. 50 (8), 1698-1705 (2001).
  6. Omer, A., et al. Long-term normoglycemia in rats receiving transplants with encapsulated islets. Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).
  7. Rayat, G. R., Rajotte, R. V., Ao, Z., Korbutt, G. S. Microencapsulation of neonatal porcine islets: protection from human antibody/complement-mediated cytolysis in vitro and long-term reversal of diabetes in nude mice. Transplantation. 69 (6), 1084-1090 (2000).
  8. Korbutt, G. S., Mallett, A. G., Ao, Z., Flashner, M., Rajotte, R. V. Improved survival of microencapsulated islets during in vitro culture and enhanced metabolic function following transplantation. Diabetologia. 47 (10), 1810-1818 (2004).
  9. Luca, G., et al. Improved function of rat islets upon co-microencapsulation with Sertoli's cells in alginate/poly-L-ornithine. AAPS PharmSciTech. 2 (3), E15(2001).
  10. Omer, A., et al. Survival and maturation of microencapsulated porcine neonatal pancreatic cell clusters transplanted into immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 52 (1), 69-75 (2003).
  11. Schneider, S., et al. Long-term graft function of adult rat and human islets encapsulated in novel alginate-based microcapsules after transplantation in immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 54 (3), 687-693 (2005).
  12. Cui, H., et al. Long-term metabolic control of autoimmune diabetes in spontaneously diabetic nonobese diabetic mice by nonvascularized microencapsulated adult porcine islets. Transplantation. 88 (2), 160-169 (2009).
  13. Krishnan, R., Alexander, M., Robles, L., Foster, C. E. 3rd, Lakey, J. R. Islet and stem cell encapsulation for clinical transplantation. Rev Diabet Stud. 11 (1), 84-101 (2014).
  14. Robles, L., Storrs, R., Lamb, M., Alexander, M., Lakey, J. R. Current status of islet encapsulation. Cell Transplant. 23 (11), 1321-1348 (2014).
  15. Desai, T., Shea, L. D. Advances in islet encapsulation technologies. Nat Rev Drug Discov. , (2016).
  16. Anilkumar, A. V., Lacik, I., Wang, T. G. A novel reactor for making uniform capsules. Biotechnol Bioeng. 75 (5), 581-589 (2001).
  17. Wolters, G. H., Fritschy, W. M., Gerrits, D., van Schilfgaarde, R. A versatile alginate droplet generator applicable for microencapsulation of pancreatic islets. J Appl Biomater. 3 (4), 281-286 (1991).
  18. Heinzen, C., Marison, I., Berger, A., von Stockar, U. Use of vibration technology for jet break-up for encapsulation of cells, microbes and liquids in monodisperse microcapsules. Practical Aspects of Encapsulation Technologies. , 19-25 (2002).
  19. Poncelet, D., et al. A Parallel plate electrostatic droplet generator: Parameters affecting microbead size. Applied Microbiology and Biotechnology. 42 (2-3), 251-255 (1994).
  20. Prüße, U., Dalluhn, J., Breford, J., Vorlop, K. D. Production of Spherical Beads by JetCutting. Chemical Engineering & Technology. 23 (12), 1105-1110 (2000).
  21. Hoesli, C. A. Bioprocess development for the cell-based treatment of diabetes (PhD thesis). , University of British Columbia. (2010).
  22. Brandenberger, H., Widmer, F. A new multinozzle encapsulation/immobilisation system to produce uniform beads of alginate. J Biotechnol. 63 (1), 73-80 (1998).
  23. Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95 (12), 1449-1461 (2008).
  24. Reis, C. P., Neufeld, R. J., Vilela, S., Ribeiro, A. J., Veiga, F. Review and current status of emulsion/dispersion technology using an internal gelation process for the design of alginate particles. J Microencapsul. 23 (3), 245-257 (2006).
  25. Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. I. Methodology. Appl Microbiol Biotechnol. 38 (1), 39-45 (1992).
  26. Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. II. Physicochemistry. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (4), 644-650 (1995).
  27. Alexakis, T., et al. Microencapsulation of DNA within alginate microspheres and crosslinked chitosan membranes for in vivo application. Appl Biochem Biotechnol. 50 (1), 93-106 (1995).
  28. Vandenberg, G. W., De La Noue, J. Evaluation of protein release from chitosan-alginate microcapsules produced using external or internal gelation. J Microencapsul. 18 (4), 433-441 (2001).
  29. Silva, C. M., Ribeiro, A. J., Figueiredo, I. V., Goncalves, A. R., Veiga, F. Alginate microspheres prepared by internal gelation: development and effect on insulin stability. Int J Pharm. 311 (1-2), 1-10 (2006).
  30. Larisch, B. C., Poncelet, D., Champagne, C. P., Neufeld, R. J. Microencapsulation of Lactococcus lactis subsp. cremoris. J Microencapsul. 11 (2), 189-195 (1994).
  31. Hoesli, C. A., et al. Reversal of diabetes by betaTC3 cells encapsulated in alginate beads generated by emulsion and internal gelation. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100 (4), 1017-1028 (2012).
  32. Hoesli, C. A., et al. Pancreatic cell immobilization in alginate beads produced by emulsion and internal gelation. Biotechnol Bioeng. 108 (2), 424-434 (2011).
  33. Reinsel, M. A., Borkowski, J. J., Sears, J. T. Partition Coefficients for Acetic, Propionic, and Butyric Acids in a Crude Oil/Water System. Journal of Chemical & Engineering Data. 39 (3), 513-516 (1994).
  34. Xiu-Dong, L., Wei-Ting, Y., Jun-Zhang, L., Xiao-Jun, M., Quan, Y. Diffusion of acetic acid across oil/water interface in emulsification-internal gelation process for preparation of alginate gel beads. Chemical Research in Chinese Universities. 23 (5), 579-584 (2007).
  35. Fernandez, S. A., et al. Emulsion-based islet encapsulation: predicting and overcoming islet hypoxia. Bioencapsulation Innovations. (220), 14-15 (2014).
  36. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  37. Hinze, J. O. Fundamentals of the hydrodynamic mechanism of splitting in dispersion processes. AIChE Journal. 1 (3), 289-295 (1955).
  38. Kolmogorov, A. N. On the breakage of drops in a turbulent flow (translated from Russian). Doklady Akademii Nauk. 66, 825-828 (1949).
  39. Davies, J. T. Drop Sizes of Emulsions Related to Turbulent Energy-Dissipation Rates. Chemical Engineering Science. 40 (5), 839-842 (1985).
  40. Pacek, A. W., Chamsart, S., Nienow, A. W., Bakker, A. The influence of impeller type on mean drop size and drop size distribution in an agitated vessel. Chemical Engineering Science. 54 (19), 4211-4222 (1999).
  41. Steiner, H., et al. Numerical simulation and experimental study of emulsification in a narrow-gap homogenizer. Chemical Engineering Science. 61 (17), 5841-5855 (2006).
  42. Tcholakova, S., Denkov, N. D., Lips, A. Comparison of solid particles, globular proteins and surfactants as emulsifiers. Phys Chem Chem Phys. 10 (12), 1608-1627 (2008).
  43. Lagisetty, J. S., Das, P. K., Kumar, R., Gandhi, K. S. Breakage of viscous and non-Newtonian drops in stirred dispersions. Chemical Engineering Science. 41 (1), 65-72 (1986).
  44. Draget, K. I., Ostgaard, K., Smidsrod, O. Homogeneous Alginate Gels - a Technical Approach. Carbohydrate Polymers. 14 (2), 159-178 (1990).
  45. Poncelet, D., Dulieu, C., Jacquot, M. Immobilized Cells. Wijffels, R. H. , Springer. Berlin Heidelberg. 15-30 (2001).
  46. Islam, A. W., Zavvadi, A., Kabadi, V. N. Analysis of Partition Coefficients of Ternary Liquid-Liquid Equilibrium Systems and Finding Consistency Using Uniquac Model. Chemical and Process Engineering-Inzynieria Chemiczna I Procesowa. 33 (2), 243-253 (2012).
  47. Quong, D., Neufeld, R. J., Skjak-Braek, G., Poncelet, D. External versus internal source of calcium during the gelation of alginate beads for DNA encapsulation. Biotechnol Bioeng. 57 (4), 438-446 (1998).
  48. De Vos, P., De Haan, B. J., Van Schilfgaarde, R. Upscaling the production of microencapsulated pancreatic islets. Biomaterials. 18 (16), 1085-1090 (1997).
  49. Gross, J. D., Constantinidis, I., Sambanis, A. Modeling of encapsulated cell systems. J Theor Biol. 244 (3), 500-510 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Emulsie methodeinterne geleringcalciumcarbonaatkorrelgrootteverdelingbeoordeling van celoverlevingminerale olie emulsieverzuringsproces

Gerelateerde artikelen