Methoden om te studeren epitheliale Transport Protein functie en de expressie in Inheemse darm en Caco-2-cellen gekweekt in 3D

Summary

We beschrijven eenvoudige methoden de regulering van intestinale serotonine transporter (SERT) functie en expressie onder toepassing van een in vitro celkweek model van Caco-2-cellen gekweekt in 3D en een ex vivo model van muis darmen bestuderen. Deze methoden zijn geschikt voor de studie van andere epitheliale transporters.

Abstract

Het darmepitheel heeft belangrijke transport en barrière functies die een belangrijke rol spelen in de normale fysiologische functies van het lichaam, terwijl het verstrekken van een barrière voor vreemde deeltjes. Verminderde epitheliale transport (ionen, nutriënten of drugs) is geassocieerd met vele ziekten en kan gevolgen die verder gaan dan de normale fysiologische functies van de transporteurs, zoals door beïnvloeding van epitheliale integriteit en de darmen microbiome hebben. Inzicht in de functie en regulatie van transporteiwitten is cruciaal voor de ontwikkeling van verbeterde therapeutische interventies. De grootste uitdaging in de studie van epitheliale transport ontwikkelt een geschikt modelsysteem dat belangrijke kenmerken van de natieve darmepitheelcellen recapituleert. Verscheidene in vitro celkweekmodellen, zoals Caco-2, T-84, en HT-29-cellen Cl.19A worden doorgaans gebruikt in epitheliale vervoersonderzoek. Deze cellijnen zijn een reductionistische benadering van het modelleren van de epithelium en zijn gebruikt in tal van mechanistische studies, met inbegrip van hun onderzoek van epitheliale-microbiële interacties. Echter, celmonolagen geen nauwkeurige weergave van cel-cel interacties en in vivo micro-omgeving. Cellen gekweekt in 3D blijkt veelbelovend modellen permeabiliteit studies. We laten zien dat Caco-2-cellen in 3D kan worden gebruikt voor epitheliale transporters bestuderen. Het is ook belangrijk dat studies in Caco-2-cellen worden aangevuld met andere modellen uitsluiten celspecifieke effecten en rekening houdend met de complexiteit van de natieve darm. Verscheidene werkwijzen zijn eerder gebruikt om de functionaliteit van transporteurs, zoals eversie sac en opname in geïsoleerde epitheelcellen of geïsoleerde plasmamembraan vesikels beoordelen. Rekening houdend met de uitdagingen op ten opzichte van modellen en het meten van transportfunctie, tonen we hier een protocol voor Caco-2 cellen groeien in 3D en beschrijven het gebruik van een Ussing kamer alseffectieve aanpak serotonine transport, zoals in intacte gepolariseerde intestinale epitheel te meten.

Introduction

Het darmepitheel is voorzien van diverse transporteiwitten (kanalen, ATPasen, co-transporters en wisselaars) dat talrijke functies variërend van de opname van voedingsstoffen, elektrolyten voeren, en middelen om de uitscheiding van vocht en ionen in het lumen. Transporteiwitten genereren elektrochemische gradiënt die de beweging van ionen of moleculen toestaan ​​in een vectoriële wijze. Dit wordt bereikt door de asymmetrische verdelingen van de transportsystemen van de apicale en basolaterale membranen van gepolariseerde epitheliale cellen. Bovendien tight junctions die tegen epitheelcellen tether, spelen een belangrijke rol in dit proces door als een barrière voor het intramembraan diffusie van componenten tussen de apicale en basolaterale membraan domeinen. Geschikte modelsystemen bootsen deze kenmerken van de natieve darm (bijvoorbeeld polariteit, differentiatie en tight junction integriteit) zijn essentieel voor de studie van de functionaliteit van epitheliale transportsystemen.

Met betrekking tot de modellen, de typische cellijnen die momenteel worden gebruikt in intestinale epitheliale transport onderzoek zijn Caco-2, een model van volledig gedifferentieerde, absorberend dunne darm epitheelcellen; en T84 cellen of HT-29 subklonen, modellen of-crypt afgeleide grote darmepitheelcellen ^1. Gewoonlijk worden deze cellijnen gekweekt als monolagen in kunststofoppervlakken of beklede Transwell inzetstukken. Trans-well celcultuur inserts enigszins lijken op de in vivo omgeving doordat gepolariseerde cellen basolateraal voeden. Echter een beperking in conventionele 2D kweeksystemen is dat de cellen moeten aanpassen aan een kunstmatige, vlak en stijf oppervlak. Aldus wordt de fysiologische complexiteit van de natieve epitheel niet correct in een 2D systeem. Deze beperking overwonnen door werkwijzen om cellen groeien in 3D in een bepaald micro-omgeving, zoals gelatineuze eiwit Mixture, met een verscheidenheid van extracellulaire matrixcomponenten ^{2, 3.} Niettemin kan het in vitro kweken van de complexiteit van het darmepitheel, die meerdere celtypes en regiospecifieke architectuur in de darm niet simuleren. Zo, de studies met behulp van celkweek modellen vereisen verdere validering in de moedertaal darm. Met behulp van de in vitro 3D celcultuur en muis darmslijmvlies, beschrijven we hier eenvoudige methoden om de regulatie van de intestinale serotonine transporter (SLC6A4, SERT) te bestuderen.

De SERT transporteur regelt de extracellulaire beschikbaarheid van een belangrijke hormoon en neurotransmitter 5-hydroxytryptamine (5-HT) door het snel transporteren door een Na ⁺ / Cl ^- afhankelijke proces. SERT is een bekend doelwit van antidepressiva en recentelijk naar voren gekomen als een nieuw therapeutisch doelwit van maag-darmaandoeningen, zoals diarree en darmontsteking.Werkwijzen onderzoeken 5-HT opname in intestinale epitheliale cellen zijn eerder beschreven. Bijvoorbeeld zijn Caco-2-cellen gekweekt op plastic dragers of doorlatende inzetstukken aangetoond dat fluoxetine-gevoelige ^3H-5-HT opname vertonen zowel apicale en basolaterale domeinen ^4. De meting van SERT functie in geïsoleerde Brush membraanblaasjes (BBMVs) bereid uit menselijk orgaan donor dunne darm is ook beschreven door ⁵ ons. ^3H-5-HT opname in humane BBVMs bleek fluoxetine-gevoelige en Na ⁺ / Cl zijn ^- afhankelijke en vertoonde verzadigingskinetiek met een _Km van 300 nM ^5. Met behulp van vergelijkbare methoden, hebben we ook eerder gemeten SERT functie als ^3H-5-HT opname in de muis intestinale BBMVs ^6. De bereiding van zuivere plasmamembraan vesikels vereist een grote hoeveelheid weefsel mucosa. Andere methoden, zoals radiographic visualisatie van ^3H-5-HT opname plaatsen, ook eerder aangetoond in cavia en rat dunne darm ^7.

De Ussingkamer een meer fysiologisch systeem voor het transport van ionen, nutriënten en geneesmiddelen in verschillende epitheliale weefsels te meten. Het belangrijkste voordeel van de Ussingkamer techniek is dat daardoor de nauwkeurige meting van de elektrische en transportparameters van intacte, gepolariseerde darmepitheel. Verder de invloed van de intrinsieke neuromusculaire systeem te minimaliseren, kan seromuscular strippen van intestinale mucosa worden uitgevoerd om de regulering van transporters onderzoeken het epitheel ^8.

We laten zien dat Caco-2-cellen gekweekt in 3D op gelatineachtige eiwitten vormen een hol lumen expressie afzonderlijke apicale en basolaterale markers. Deze cellen vertonen hogere expressie van SERT dan 2D Caco-2 cellen. Werkwijzen groeien 3D cellen en perform immunokleuring of RNA en eiwit extractie beschreven. Daarnaast beschrijven we methoden om SERT functie en regulatie bestuderen door TGF-β1, een pleiotrope cytokine, in kleine darmmucosa door toepassing van een Ussingkamer techniek.

Protocol

1. Studie van Intestinale Transporters in een 3D-cultuur systeem van Caco-2: Groeiende 3D Caco-2 Cell Culture op een Gelatineachtig eiwitmengsel

1. Dooi groeifactor verminderde gelatineuze proteïnemengsel op ijs gedurende 8 uur (of O / N) bij 4 ° C. Eenmaal ontdooid, maak 1 ml of 500 ul porties voor gebruik of op te slaan bij -20 ° C voor later gebruik.
2. Op de dag van de cultuur, te koelen de kweekplaten (voor RNA en eiwit extractie) of chambered dia's (voor immunokleuring) op ijs. Voeg 30 ul van geleiachtige eiwit mengsel aan elk putje van een acht-well chambered-glasplaatje (of 120 ul per putje van een 6-wells plaat) en gelijkmatig verdelen. Zorg ervoor dat luchtbellen niet te genereren tijdens het proces.
3. Plaats de objectglaasjes / platen in een cel incubator bij 37 ° C gedurende 15-30 minuten en laat het gelatineuze eiwitmengsel te stollen.
4. Terwijl het gelatineuze eiwitmengsel wordt stollen, trypsinize een confluente kolf van Caco-2 cellen.
5. Tel het aantalcellen en draaien ze bij 500 xg in een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cel pellet in 3D Caco-2 Medium als dat nodig is.
6. Het zaad van de glazen kamer dia's bij 4.000 cellen per putje (voor borden, 20.000 per putje). Laat de cellen groeien in een _5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. Verander medium om de 3 - 4 d.

2. Immunofluorescentie kleuring voor epitheliale Transporters in 3D Caco-2-cellen: Dag 1

1. Zuig het medium en vast de cellen met 400 ul van 2% paraformaldehyde (PFA) (in PBS met pH bijgesteld tot 8,5 met NaOH) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: PFA oplossing niet bewaren langer dan 1 week bij 4 ° C, en vers gemaakte oplossing kan worden gebruikt. LET OP: PFA is zeer giftig en een mogelijke kankerverwekkende stof. omgaan altijd met de nodige voorzichtigheid in een chemische kap en het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen.
2. Spoel de putjes tweemaal met 1x PBS en de glijbanen bewaren bij 4 ° C in PBS (400 ul /goed). Eenmaal vastgesteld, bewaar ze bij 4 ° C gedurende maximaal een week.
3. Verwarm de kamer dia's RT (dit zal de geleiachtige eiwitmengsel bed verharden en maken het gemakkelijk om aspireren tijdens het wassen stappen).
4. Permeabilize de cellen met 0,5% Triton in PBS gedurende maximaal 15 minuten.
5. Bereid PBS-glycinebuffer (130 mM NaCl, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3,5 mM NaH _{2PO 4} en 100 mM glycine). 3x spoelen met 1x PBS-glycine gedurende 10 min elk bij kamertemperatuur.
6. Bereid immunofluorescentie buffer (IF): 130 mM NaCl, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3,5 mM NaH _{2PO 4,} 100 mM glycine, 7,7 mM _NaN3, 0,1% BSA, 0,2% Triton X-100 en 0,05% Tween-20 .
7. Was 3x in IF-buffer gedurende 10 minuten elk bij kamertemperatuur. Blok in 5% Normaal Geit Serum (NGS) in IF-buffer. Incubeer met primaire antilichaam verdund in IF + 1% geit serum, 200 ul / putje, gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur. Wassen met IF-buffer 3x gedurende 10 minuten elk.
8. Incubate met secundaire antibody (1: 200) verdund in IF + 1% NGS, 200 ul / putje, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
9. Wassen met IF-buffer driemaal gedurende 10 minuten elk. Houd de dia's in het donker van deze stap op. Til de plastic kamers van de glaasjes door het plaatsen van de kamer dia in een zwarte houder schuiven en een witte lifter door de houder totdat de rand contact maakt met de rand van de putjes. Trek de kamers (de houder en lifter moet komen met de cultuur dia's).
10. Monteer met trage anti-fade medium en laat ze drogen gedurende 10 minuten bij RT.
11. Eenmaal volledig opgedroogd, sluit de dia's met nagellak en beeld ze met confocale microscopie. Bewaar de objectglaasjes bij 4 ° C gedurende twee weken bij -20 ° C gedurende enkele maanden.

3. RNA en eiwit extractie van 3D Caco-2 cellen

1. Behandel de cellen gekweekt op gelatineuze eiwitmengsel voor 12 - 14 met een testmiddel, zoals TGF- β1 (10 ng / ml, 1 h).
2. Na de behandeling, was de cellen met 1x PBS. Houd de cellen op ijs gedurende 30 min om het gelatineuze proteïnemengsel vloeibaar.
3. Was de putjes met gekoelde PBS en verzamelen van de cellen in de verschillende centrifugebuizen. Verzamel de cellen door lage snelheid centrifugatie bij 500 xg en 4 ° C gedurende 10 minuten. Extraheer het RNA met behulp van standaardprocedures en gebruik real time RT-PCR.
4. Voor eiwitextractie lyseren van de cellen met behulp 1x cellysis buffer aangevuld met 1x protease inhibitor cocktail. Na toevoeging cellysis buffer om de pellet lyseren de cellen door sonificatie en verwijder de celresten door centrifugatie bij 7500 xg en 4 ° C gedurende 10 minuten.

4. Meting van de 5-HT opname in Mouse Ileum Gebruik makend van een Ussing Kamer: Intestinale Voorbereiding en Seromuscular Strippen

1. Naar aanleiding van euthanasie, ontleden de muizen en verwijder de dunne darm (na de maag en voor de blindedarm). Verdeel de dunne darm in drie delen. Gooi het middelste derde, gebruik maken van de proximale derdeals jejunum, en gebruik maken van de distale derde als ileum. Vermijd trekken de darm van de mesenteriale gehechtheid aan beschadiging van het epitheel te voorkomen. Houd het weefsel sectie kou door te bedekken met ijskoud Krebs-Ringer bicarbonaat (KBR) buffer.
2. Open de darm longitudinaal met een schaar. Incubeer vers uitgesneden intestinale secties in ijskoude, gassing KBR met 1 uM indomethacine gedurende 10 min voor het seromuscular strippen.
3. Speld de intestinale sectie (~ 1 cm in lengte) mucosale naar beneden om een ​​plaat met 7% agarose of siliconen elastomeer (0,5 cm dik).
4. Strip de seromuscular lagen onder een dissectie stereomicroscoop met een bottom-verlichting. Snijd de seromuscular laag met behulp van een veer scalpel. Gebruik fijne tang om de rand van de laag langs de lengteas van de darm te verkrijgen.
   LET OP: Tijdens het strippen procedure, de onderkant verlichting van de stereomicroscoop helpt om gebieden aan te wijzen en te voorkomen dat met de patch Peyer'ses.
5. Na de voltooiing van de seromuscular strippen, zet de mucosa voorzichtig op de pinnen van een Ussing halve kamer. Gedurende het hele proces, zorg om de gestripte mucosale weefsel te houden aan de randen om scheuren te voorkomen.

5. Evenwicht en Tissue Treatment

1. Bereid Krebs oplossing: 115 mM NaCl, 25 mM NaHCO _3, 2,4 mM K ₂ HPO _4, 1,2 mM _CaCl2, 1,2 mM _MgCl2 en 0,4 mM KH _{2PO 4} bij pH 7,4, begast met _95% O2 / 5% CO ₂ bij 37 ° C. Voeg 10 mM glucose aan de serosale bad om te dienen als een energie substraat en 10 mM mannitol aan het mucosale bad om de osmotische evenwicht.
   OPMERKING: Krebs oplossing wordt aangevuld met L-ascorbinezuur (100 uM) en pargyline (100 uM, monoamine oxidase inhibitor) intracellulaire 5-HT afbraak voorkomen.
2. Plaats de schuifknop in de kamer om zowel de apicale (lumen) si blooten de basolaterale (serosale) zijde van het weefsel Krebs oplossing.
3. Na een equilibratieperiode van 10 minuten, voorbehandelen ileale weefsel met fluoxetine (10 uM) gedurende 30 min aan de apicale kant voor J _ms (mucosaal naar serosaal flux).
4. Behandelen van het weefsel met TGF-β1 (10 ng / ml) gedurende 1 uur op basolaterale kant en incubeer vervolgens met ³ [H] -5-HT (20 nM) gedurende 30 min aan de apicale kant.

6. Kwantificering van mucosale tot serosale Flux (J _ms) en ³ [H] -5-HT accumulatie in het weefsel

1. Verzamel 0,75 ml porties van de serosale reservoir (totaal 5 ml) om de radioactiviteit in een vloeistofscintillatieteller en mucosale naar serosaal (J _ms) flux berekenen; fluoxetine-gevoelige flux representeert SERT-gemedieerde ³ [H] -5-HT opname.
2. Om hydrostatische druk verschillen tussen het slijmvlies tijdens een flux periode te voorkomen, nemen monsters uit de sereuze kant en replaats ze met identieke volumes badmedium.
   OPMERKING: De flux berekening gecorrigeerd voor de verdunning van het eindmonster (4,25 ml / 5 ml = 0,85).
3. Voor de kwantificering van ³ [H] -5-HT geaccumuleerd in het weefsel, demonteer de slijmvlies van de slider, was het eens met ijskoude KRB buffer, en plaats het in glascultuur buizen.
4. Incubeer de mucosa in 0,5 ml 10% KOH nacht bij 37 ° C. Meet de radioactiviteit in 150 pl hoeveelheden van de lysaten (in triplo) met een vloeistofscintillatieteller.
5. Gebruik aliquots (3-5 ui) van de lysaten eiwitconcentratie gemeten met de Bradford methode.
   OPMERKING: 10 ml incubatiemedium met radioactieve serotonine wordt gebruikt als een standaard. 5-HT in het weefsel vastgehouden wordt uitgedrukt als pmol / mg proteïne / min.

Results

Immunokleuring in 3D Caco-2 cysten weergegeven in figuur 1. Een representatief beeld van een XY-vlak toont goed afgebakende lumen in de 3D cyste gekleurd met falloïdine actine is in Figuur 1A. De kant van het lumen geeft de apicale kant. Epitheelcellen gekweekt in een 3D-omgeving resulteren in een robuuste epitheliale fenotype. Verschillende Caco-2 cysten op dag 12, als actine en SERT werden samen gekleurd, worden getoond in Figuur 1B. I...

Discussion

Volledig gedifferentieerde Caco-2-celmonolagen werden uitgebreid gebruikt als gepolariseerde epitheliale monolagen intestinale transport ^{10, 11, 12, 13, 14, 15} bestuderen. Echter, de fysiologische organisatie van darmepitheelcellen na te bootsen, is er aanzienlijke belangstelling voor de ontwikkeling van een Caco-2 cultuur i...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	ATCC	ATCC® HTB­37™	Cellen
10x PBS	Carl Zeiss		Microscoop voor confocale beeldvorming
3[H]-5-HT	LabtekII	152453	Cellen kweken voor microscopie
5-HT	Gibco	70013-032	Niet een gevaarlijke stof
95% O2- 5% CO2 cilinder	KPL	71-00-27	Niet een gevaarlijke stof
Agar (voor Agar platen)	Fischer	BP151-100	Acute toxiciteit, Ora
Agar (voor elektrode)	Sigma	G7126-1KG	Niet een gevaarlijke stof
Alexa Fluor Phalloidin	Sigma	C3867-1VL	Niet een gevaarlijke stof
Bovine Serum Albumine (BSA)	Sigma	P6148-500G	Schadelijk indien ingeslikt of ingeademd
CaCl2	LifeTechnologies	A12380	Niet een gevaarlijke stof
Caco-2 Cellen	Sigma	A8806-5G	Niet een gevaarlijke stof
Cell lysis Buffer	Fischer	BP337-100	Niet een gevaarlijke stof
Chabered slides	Sigma	S5886-1KG	Niet een gevaarlijke stof
Collageen Type-1 Oplossing	Sigma	S8045-500G
Elektroden	Sigma	S-0876
EMEM	Gibco by Life Technologies	25200-056
Foetaal bovien serum (FBS)	Corning	356234	Wordt gebruikt als extracellulaire matrix
Fluoxetine	Qiagen	74104
Gentamicine	ATCC	30-2003	Celkweekmedium
Glycine	Cell Signaling, Danvers, MA
Hepes	Roche	11836145001
Indomethacin	Gibco by Life Technologies	15070-063
K2HPO4	Gibco by Life Technologies	15710-064
KOH	Gibco by Life Technologies	15630-080
L-ascorbinezuur	Gibco by Life Technologies	10082147
Liquide scintillatieteller	Gibco by Life Technologies	70013--032
LSM710 Meta	Physiologic Instruments, San Diego, CA	EM-CSYS-8
Mannitol	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2304
Matrigel	Physiologic Instruments, San Diego, CA	VCC MC8
MgCl2	Physiologic Instruments, San Diego, CA	DM MC6
Multichannel Voltage/current Clamp	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2300
NaCl	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2023-100
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP1423
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	S5886
Normaal geitenserum (NGS, 10%)	Fisher Scientific, Hampton, NH	S233
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	P288
Pen-Strp	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	C3881
Eiwit analyse reagens	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	10420
Proteinase Inhibitor Cocktail	MEDOX, Chicago, IL	style G- 12300
RNA easy Mini kit	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	M4125
Single Channel Electrode Input Module	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A92902
Sliders voor snapwell Chambers	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	H9523
Natriumfosfaat (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	F132
Natrium-Hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	T7039
TGF-β1	Perkin-Elmer,Waltham, MA	NFT1167250UC
Triton X-100	Packard Instruments, Downers Grove, IL	B1600
Trypsine EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	221473
Tween-20	Bio Rad Laboratories, Hercules, CA	5000006
Ussing Chamber (alleen de kamer)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	I7378
Ussing Chamber Systemen	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A1296