Method Article

Methoden om te studeren epitheliale Transport Protein functie en de expressie in Inheemse darm en Caco-2-cellen gekweekt in 3D

DOI:

10.3791/55304

⸱

March 16th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven eenvoudige methoden de regulering van intestinale serotonine transporter (SERT) functie en expressie onder toepassing van een in vitro celkweek model van Caco-2-cellen gekweekt in 3D en een ex vivo model van muis darmen bestuderen. Deze methoden zijn geschikt voor de studie van andere epitheliale transporters.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het darmepitheel heeft belangrijke transport en barrière functies die een belangrijke rol spelen in de normale fysiologische functies van het lichaam, terwijl het verstrekken van een barrière voor vreemde deeltjes. Verminderde epitheliale transport (ionen, nutriënten of drugs) is geassocieerd met vele ziekten en kan gevolgen die verder gaan dan de normale fysiologische functies van de transporteurs, zoals door beïnvloeding van epitheliale integriteit en de darmen microbiome hebben. Inzicht in de functie en regulatie van transporteiwitten is cruciaal voor de ontwikkeling van verbeterde therapeutische interventies. De grootste uitdaging in de studie van epitheliale transport ontwikkelt een geschikt modelsysteem dat belangrijke kenmerken van de natieve darmepitheelcellen recapituleert. Verscheidene in vitro celkweekmodellen, zoals Caco-2, T-84, en HT-29-cellen Cl.19A worden doorgaans gebruikt in epitheliale vervoersonderzoek. Deze cellijnen zijn een reductionistische benadering van het modelleren van de epithelium en zijn gebruikt in tal van mechanistische studies, met inbegrip van hun onderzoek van epitheliale-microbiële interacties. Echter, celmonolagen geen nauwkeurige weergave van cel-cel interacties en in vivo micro-omgeving. Cellen gekweekt in 3D blijkt veelbelovend modellen permeabiliteit studies. We laten zien dat Caco-2-cellen in 3D kan worden gebruikt voor epitheliale transporters bestuderen. Het is ook belangrijk dat studies in Caco-2-cellen worden aangevuld met andere modellen uitsluiten celspecifieke effecten en rekening houdend met de complexiteit van de natieve darm. Verscheidene werkwijzen zijn eerder gebruikt om de functionaliteit van transporteurs, zoals eversie sac en opname in geïsoleerde epitheelcellen of geïsoleerde plasmamembraan vesikels beoordelen. Rekening houdend met de uitdagingen op ten opzichte van modellen en het meten van transportfunctie, tonen we hier een protocol voor Caco-2 cellen groeien in 3D en beschrijven het gebruik van een Ussing kamer alseffectieve aanpak serotonine transport, zoals in intacte gepolariseerde intestinale epitheel te meten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het darmepitheel is voorzien van diverse transporteiwitten (kanalen, ATPasen, co-transporters en wisselaars) dat talrijke functies variërend van de opname van voedingsstoffen, elektrolyten voeren, en middelen om de uitscheiding van vocht en ionen in het lumen. Transporteiwitten genereren elektrochemische gradiënt die de beweging van ionen of moleculen toestaan ​​in een vectoriële wijze. Dit wordt bereikt door de asymmetrische verdelingen van de transportsystemen van de apicale en basolaterale membranen van gepolariseerde epitheliale cellen. Bovendien tight junctions die tegen epitheelcellen tether, spelen een belangrijke rol in dit proces door als een barrière voor h....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Studie van Intestinale Transporters in een 3D-cultuur systeem van Caco-2: Groeiende 3D Caco-2 Cell Culture op een Gelatineachtig eiwitmengsel

  1. Dooi groeifactor verminderde gelatineuze proteïnemengsel op ijs gedurende 8 uur (of O / N) bij 4 ° C. Eenmaal ontdooid, maak 1 ml of 500 ul porties voor gebruik of op te slaan bij -20 ° C voor later gebruik.
  2. Op de dag van de cultuur, te koelen de kweekplaten (voor RNA en eiwit extractie) of chambered dia's (voor immunokleuring) op ijs. Voeg 30 ul van geleiachtige eiwit mengsel aan elk putje van een acht-well chambered-glasplaatje (of 120 ul per putje van een 6-wells plaat) en gelijkmatig verdelen. Zo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunokleuring in 3D Caco-2 cysten weergegeven in figuur 1. Een representatief beeld van een XY-vlak toont goed afgebakende lumen in de 3D cyste gekleurd met falloïdine actine is in Figuur 1A. De kant van het lumen geeft de apicale kant. Epitheelcellen gekweekt in een 3D-omgeving resulteren in een robuuste epitheliale fenotype. Verschillende Caco-2 cysten op dag 12, als actine en SERT werden samen gekleurd, worden getoond in Figuur 1B. I.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volledig gedifferentieerde Caco-2-celmonolagen werden uitgebreid gebruikt als gepolariseerde epitheliale monolagen intestinale transport 10, 11, 12, 13, 14, 15 bestuderen. Echter, de fysiologische organisatie van darmepitheelcellen na te bootsen, is er aanzienlijke belangstelling voor de ontwikkeling van een Caco-2 cultuur i.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBSATCCATCC® HTB­37™Cells
10x PBSCarl ZeissMicrosope for confocal Imaging
3[H]-5-HT LabtekII152453Culturing cells for microscopy
5-HT Gibco70013-032Not a hazardous substance
95% O2- 5% CO2 cylinderKPL71-00-27Not a hazardous substance
Agar (for Agar plates)FischerBP151-100Acute toxicity, Ora
Agar (for electrode)SigmaG7126-1KGNot a hazardous substance
Alexa Fluor PhalloidinSigmaC3867-1VLNot a hazardous substance
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaP6148-500GHarmful if swallowed or if inhaled
CaCl2LifeTechnologiesA12380Not a hazardous substance
Caco-2 CellsSigmaA8806-5GNot a hazardous substance
Cell lysis BufferFischerBP337-100Not a hazardous substance
Chabered slidesSigmaS5886-1KGNot a hazardous substance
Collagen Type-1 SolutionSigmaS8045-500G
ElectrodesSigmaS-0876
EMEMGibco by Life Technologies25200-056
Fetal bovine serum (FBS)Corning356234Used as Extracellular matrix
FluoxetineQiagen74104
GentamicinATCC30-2003Cell culture Media
GlycinCell Signaling, Danvers, MA
Hepes Roche11836145001
IndomethacinGibco by Life Technologies15070-063
K2HPO4Gibco by Life Technologies15710-064
KOHGibco by Life Technologies15630-080
L-ascorbic acid Gibco by Life Technologies10082147
Liquid scintillation counter Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710 MetaPhysiologic Instruments, San Diego, CA EM-CSYS-8
MannitolPhysiologic Instruments, San Diego, CA P2304
MatrigelPhysiologic Instruments, San Diego, CA VCC MC8
MgCl2Physiologic Instruments, San Diego, CA DM MC6
Multichannel Voltage/current ClampPhysiologic Instruments, San Diego, CA P2300
NaClPhysiologic Instruments, San Diego, CA P2023-100
NaClFisher Scientific, Hampton, NHBP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich, St Louis, MOS5886
Normal Goat Serum (NGS, 10%)Fisher Scientific, Hampton, NHS233
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich, St Louis, MOP288
Pen-StrpSigma-Aldrich, St Louis, MOC3881
Protein assay reagentSigma-Aldrich, St Louis, MO10420
Proteinase Inhibitor CocktailMEDOX, Chicago, IL style G- 12300
RNA easy Mini kitSigma-Aldrich, St Louis, MOM4125
Single Channel Electrode Input Module Sigma-Aldrich, St Louis, MOA92902
Sliders for snapwell ChambersSigma-Aldrich, St Louis, MOH9523
Sodium Phosphate (Na2HPO4)Sigma-Aldrich, St Louis, MOF132
Sodium-Hydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich, St Louis, MOT7039
TGF-β1Perkin-Elmer,Waltham, MANFT1167250UC
Triton X-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
Trypsin EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO221473
Tween-20Bio Rad Laboratories, Hercules, CA5000006
Ussing Chamber (chamber only)Sigma-Aldrich, St Louis, MOI7378
Ussing Chamber SystemsSigma-Aldrich, St Louis, MOA1296

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
  2. Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. B....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Caco 2 Cells3D CultureUssing ChamberSerotonin TransportEpithelial TransportIntestinal EpitheliumSERT ProteinWestern BlotImmunofluorescenceCell Culture

Related Articles