Het samenvoegen van Ion Concentratie polarisatie tussen Naast elkaar Ion Exchange membranen aan de voortplanting van de Polarisatie Zone blokkeren

Samenvatting

Het protocol voor een nieuwe ionenconcentratie polarisatie (ICP) platform dat de voortplanting van de ICP zone kan stoppen, ongeacht de omstandigheden beschreven. Dit unieke vermogen van het platform ligt in het gebruik van fusie ion uitputting en verrijking, die twee polariteiten van de ICP fenomeen zijn.

Samenvatting

De ionconcentratie polarisatie (ICP) fenomeen is een van de meest gangbare methoden voor lage abundantie biologische monsters preconcentraat. De ICP induceert een niet-invasieve regio voor geladen biomoleculen (dwz het ion depletie zone), en doelstellingen kunnen worden gepreconcentreerd op deze regio grens. Ondanks de hoge prestaties preconcentratiestap met ICP, is het moeilijk om de bedrijfsomstandigheden van niet-voortplantende ion depletie zones vinden. Om deze smalle operationele venster te overwinnen, we recent ontwikkelde een nieuw platform voor spatiotemporeel vaste voorconcentrering. In tegenstelling tot voorgaande werkwijzen dat alleen ionen depletie gebruiken, dit platform gebruikt de tegengestelde polariteit van de ICP (dwz ion verrijking) tegen verspreiding van de ion uitputtingszone stoppen. Door de confrontatie met de verrijking zone met de uitputting zone, de twee zones samen te voegen elkaar en stoppen. In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd experimenteel protocol bij deze spatiotemporeel gedefinieerd ICP platf bouwenorm en kenmerken de voorconcentratie dynamiek van het nieuwe platform door vergelijking met die van de conventionele inrichting. Kwalitatieve ion concentratie profielen en de huidige-time reacties met succes vastleggen van de verschillende dynamiek tussen de gefuseerde ICP en de stand-alone ICP. In tegenstelling tot de conventionele dat de preconcentratiestap locatie op ~ 5 V kan oplossen, kan het nieuwe platform een ​​doelwit-gecondenseerd plug produceren op een specifieke locatie in het brede bereik van bedrijfscondities: spanning (0,5-100 V), ionsterkte (1-100 mM) en pH (3,7-10,3).

Inleiding

Ionenconcentratie polarisatie (ICP) verwijst naar een fenomeen dat optreedt tijdens ion ion verrijking en verarming een permselectief membraan, waardoor een extra potentiaaldaling met ionenconcentratie gradiënten ^{1, 2.} Deze concentratiegradiënt is lineair, en steiler als een hogere spanning wordt aangelegd (Ohmse regime) tot de ionenconcentratie op het membraan nul nadert (beperking regime). Dit diffusie beperkte conditie, is de gradiënt (en overeenkomstige ion flux) bekend te maximaliseren / verzadigd ^1. Afgezien van deze conventionele begrip, wanneer de spanning (of stroom) verder wordt verhoogd, een overlimiting stroom wordt waargenomen, met een flatscreen uitputting zones en zeer scherpe concentratie gradiënten op de zonegrens ^{1, 3.} De vlakke zone heeft een zeer lage ionenconcentratie, maar oppervlaktegeleidingstype, elektro-osmoti c flow (EOF) en / of elektro-osmotische instabiliteit bevorderen ionflux en induceren een overlimiting huidige ^{3, 4, 5.} Interessant is dat de vlakke uitputtingszone fungeert als elektrostatische barrière, die filtert ^{6, 7, 8, 9} en / of preconcentraten target ^{10, 11.} Aangezien er een onvoldoende hoeveelheid ionen aan het oppervlak beschuldiging van geladen deeltjes (om te voldoen elektroneutraliteit) scherm, kunnen de deeltjes niet door deze depletiezone en daarom line-up op de grens. Deze lineaire ICP effect is een generiek verschijnsel in verschillende typen membranen ^{10, 11, 12, 13,}> 14 en geometrieën ^{6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21;} daarom onderzoekers in staat om verschillende soorten filtratie ^{6, 7, 8} hebben kunnen ^{ontwikkelen, 9} en preconcentratiestap ^{10, 11} apparaten met behulp van de niet-lineaire ICP.

Zelfs bij een zo hoge flexibiliteit en stevigheid, het is nog steeds een praktische uitdaging om de bedrijfsomstandigheden voor de ICP-lineaire inrichtingen verduidelijken. De lineaire regime van de ICP snel verwijdert kationen door een kationenwisselingsmembraan, waarbij de verplaatsing van anionen richting van de anode veroorzaakt. Als eenHierdoor is de flat depletiezone propageert snel, wat doet denken aan shock voortplanting ^22. Mani et al. noemde deze dynamische de deïonisatie (of uitputting) schokken ^23. Om doelen preconcentraat op een aangewezen taststand, waardoor de uitbreiding van het ion uitputtingszone noodzakelijk, bijvoorbeeld door toepassing of EOF drukgedreven stroom tegen de expansie zone ^24. Zangle et al. ²² verduidelijkt de criteria voor ICP propagatie in een eendimensionale model en sterk afhankelijk van elektroforetische mobiliteit ^{17, 18} ionsterkte, pH ^25, enzovoort. Dit geeft aan dat de juiste bedrijfsomstandigheden wordt navenant te worden monstercondities.

Hier presenteren wij gedetailleerde ontwerp en experimentele protocollen voor een roman ICP-platform dat de streefcijfers preconcentraten binnen een spatiotemporaal gedefinieerde positie ^26. De uitbreiding van de ionen uitputtingszone wordt geblokkeerd door de ion verrijking zone, waardoor een stationaire preconcentratiestap stekker aan een toegewezen positie, ongeacht de bedrijfstijd, aangelegde spanning, ionensterkte en pH. Deze gedetailleerde video protocol is bedoeld voor de eenvoudigste methode om kationenuitwisselingsmembranen integreren in microfluïdische inrichtingen en de voorconcentratie prestaties van de nieuwe ISP platform ten opzichte van de conventionele tonen tonen.

Protocol

1. Fabricage van kationuitwisselingsmembraan geïntegreerde microfluïdische chips

1. Bereiding van silicium masters
   1. Ontwerp twee soorten silicium meesters: een voor de patroonvorming van een kationenuitwisselingshars en de andere voor het bouwen van een microkanaal met polydimethylsiloxaan (PDMS).
      NB: Het detail geometrie zal in de stappen 1.3.1 en 1.4.1 worden beschreven.
   2. Fabriceren het silicium masters met behulp van conventionele fotolithografie of diepe reactief ion etsen ^27.
   3. Silaniseren de micropatterned silicium meesters met trichloorsilaan (~ 30 pi) in een vacuüm pot voor 30 min.
      LET OP: Trichloorsilaan is een pyrofore vloeistof die is brandbaar en heeft een acute toxiciteit (inhalatie, orale inname).
2. Bereiding van PDMS mallen
   1. Meng een siliconenelastomeer basis met een verharder in een 10: 1 verhouding en het kopje met deze uitgeharde PDMS(30-40 ml voor het repliceren van microstructuren op een 4-in silicium wafer) in een vacuüm pot voor 30 minuten om de luchtbellen te verwijderen.
      NB: De siliconen basis bevat siloxaan oligomeren eindigt met vinyl groepen en een platina gebaseerde katalysator. De verharder bevat crosslinking oligomeren die drie silicium hydride bindingen ²⁸ hebben.
   2. Giet de uitgeharde PDMS op silicium meesters, de bellen met een ventilator en genezen van de PDMS bij 80 ° C gedurende 2 uur in een convectieoven.
   3. Maak de uitgeharde PDMS van silicium meesters en juiste vorm van de PDMS met een mes (vierkante vormen, zoals getoond in figuur 2a-b, iv).
3. Patroonvorming van de kationenuitwisselmembranen
   1. Snijd de helft van de PDMS mal loodrecht op de twee parallelle microkanalen en perforeren aan de uiteinden van de PDMS kanalen met een 2,0-mm biopsie punch.
      LET OP: De PDMS mal voor de patroonvorming van het kation selectieve membraan heeft twee parallel microkanalen (width: 100 pm; height: 50 micrometer; interchannel afstand: 100 pm; figuur 1a). De oorspronkelijke vorm van de mal kan worden voorgesteld door het te spiegelen de gesneden mal langs de snijlijn. L-vormige microkanalen worden aanbevolen voor ponsen de twee gaten niet overlappen.
   2. Reinig een glasplaatje en de PDMS mal met tape en een blower en zet de mal op het glaasje te omkeerbare bevestiging tussen hen te creëren.
   3. Volgens de microflow patroonvormende techniek ^29, vrijgave ~ 10 pi van een kationuitwisselingshars bij het open einde van het kanaal dat is gesneden in stap 1.3.1 (Figuur 1b). Plaats de spuit hoofd op de geponste gaten en trek de zuiger (zwarte pijlen in figuur 1b); een lichte negatieve druk zal trekken de kationenwisselaarhars, en de hars zullen de twee kanalen te vullen.
      LET OP: Het wordt aanbevolen dat de hoogte van het microkanaal is groter dan 1581, m, vanwege de hoge viscositeit van de hars vereist hoge druk om de kanalen te vullen. Aan de andere kant is het beter dat niet hoger is dan 100 pm, omdat de gevormde ionen selectief membraan dikker dan 1 urn wordt; dergelijke dikke membraan kan een spleet tussen het membraan en de PDMS kanaal ¹³ te creëren.
   4. Maak de PDMS mal zonder het gevormde hars en plaats het glaasje de verwarming bij 95 ° C gedurende 5 minuten om het oplosmiddel in de hars verdampt.
      OPMERKING: De dikte van het gevormde membraan gewoonlijk minder dan <1 urn. De mal wordt voorzichtig losgemaakt door scharnierend de vorm om de open-ended zijde (stippellijn en pijl in figuur 1b). Het beste is om de mal los minder dan 1 minuut na het vullen van de hars. Als de mal een paar minuten later wordt losgemaakt, kunnen dikkere membranen worden verkregen, maar ze een concave vorm hebben als gevolg van de capillaire werking.
   5. Verwijder de onnodigedeel van het gevormde membraan met een scheermesje, waardoor twee afzonderlijke lijn-patroon (figuur 1c).
      Opmerking: Het kationuitwisselmateriaal hier gebruikt heeft geperfluoreerde groepen, wat betekent dat de patroon niet sterk gebonden aan het glas. Daarom kan de eenvoudige werkwijze lamellen eenvoudig verwijderen van de onnodige deel van het membraan.
4. Integratie van het microkanaal en de membraan-patroon substraat
   1. Punch twee gaten aan de uiteinden van microkanalen en nog twee gaten waar het membraan patronen zich na hechten van de PDMS kanaal naar de membraan gevormde substraat vervaardigd in stap 1,3.
      Opmerking: De PDMS microkanaal één kanaal (breedte: 50-100 urn; hoogte: 10 um), maar het is gebonden aan de uiteinden van de naburige kanalen (figuur 1d).
   2. Binden de PDMS microkanaal naar het membraan-patroon substraat onmiddellijk na zuurstof plasmabehandeling gedurende 40 s bij 100 W en 50 mTorr.
      LET OP: Plaats de patroon membraan loodrecht op het midden van het microkanaal.

2. ICP voorconcentrering

1. Voorbereiding voor het experiment
   1. Bereid verschillende testoplossingen, zoals 1-100 mM KCl, 1 mM NaCl (pH ~ 7), het mengsel van 1 mM NaCl en 0,2 mM HCl (pH ~ 3,7), het mengsel van 1 mM NaCl en 0,2 mM NaOH (pH ~ 10,3), en 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing.
   2. Voeg een negatief geladen fluorescente kleurstof (~ 1,55 uM) aan de testoplossingen.
      Opmerking: De concentratie van de toegevoegde kleurstof moet veel lager dan die van de zoutionen (<10 uM) zodat de geladen kleurstoffen niet bijdragen aan een elektrische stroom ^{30, 31.}
   3. Laad de monsteroplossing in een reservoir van het kanaal en toepassen negatieve druk op het andere reservoir om het kanaal te vullen met de oplossing. Sluit de twee reservoirs hydrodynamisch door releasing een grote druppel aan de drukgradiënt langs het kanaal (figuur 2a) te elimineren.
   4. Vul de twee reservoirs, die zijn verbonden met de kationuitwisseling patronen met bufferoplossingen (1 M KCl of 1 M NaCl) met een injectiespuit of een pipet ter compensatie van de ICP effect in de reservoirs.
   5. Plaats de draden in de reservoirs, over de twee gevormde membranen (anode links reservoir en kathode rechts) en verbindt ze met een bron meeteenheid (Figuur 2a).
2. Visualisatie van de ICP fenomeen en ICP voorconcentrering
   1. Laad de ICP-apparaat op een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop. Toepassen van een spanning (V 0,5100) en meet de stroomresponsie met een bron meeteenheid.
   2. Leg fluorescerende beelden met een ladingsgekoppelde inrichting camera en analyseren van de fluorescentie-intensiteit met behulp beeldverwerkingssoftware ^32.

Resultaten

Het schema fabricagestappen van een membraan geïntegreerde microfluïdische preconcentrator zijn weergegeven in figuur 1. Een gedetailleerde beschrijving van de vervaardiging wordt in het protocol. De ontwerpen en apparaatbeelden van de spatiotemporeel gedefinieerde preconcentrator ²⁶ worden gecontrasteerd met die van een conventionele preconcentrator ¹¹ (figuur 2). De ICP fenomeen in de spatiotemporeel gede...

Discussie

We hebben beschreven de vervaardiging protocol en het uitvoeren van een spatiotemporeel gedefinieerd preconcentrator in een bereik van de aangelegde spanning (0,5-100 V), ionsterkte (1-100 mM) en pH (3,7-10,3), het bereiken van een 10.000-voudige voorconcentrering van kleurstoffen en eiwitten binnen 10 min. Zoals net als vorige ICP-apparaten, de preconcentratiestap prestaties beter wordt bij een hogere spanning en tegen lagere ionsterkte. Een extra parameter kunnen we hier te overwegen is de afstand tussen twee kationen...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning
Trichlorosilane	Sigma Aldrich	175552	Zeer giftig
Nafion pergefluoreerde hars, 20 wt%	Sigma Aldrich	527122
Natriumchloride	Sigma Aldrich	71394
Kaliumchloride	Sigma Aldrich	60121
Alexa Fluor 488 carbonzuur, succinimidyl ester	Invitrogen	A20000
Isothiocyanaaat-geconjugeerd albumine	Sigma Aldrich	A9771
Fosfaatbufferoplossing, 1x	Wengene	LB004-02
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379
Epifluorescentiemicroscoop	Olympus	IX-71
Charge-coupled device camera	Hamamtsu Co.	ImageEM X2
Bronmeeteenheid	Keithley Instruments	2635A
Covance-MP	Femto Science