Het schalen van Engineered Vascular Enten Met behulp van 3D-Gedrukt Gidsen en de Ring Stapelen Method

Samenvatting

Schaalbare engineered bloedvaten zou de klinische toepasbaarheid te verbeteren. Gebruik gemakkelijk aanzienlijke 3D gedrukte geleiders, ringen van vasculaire gladde spieren zijn gemaakt en gestapeld in een buisvormige vorm, die een vasculair transplantaat. Enten kan worden aangepast aan de reeks van menselijke kransslagader afmetingen voldoen door eenvoudig de 3D gedrukte handleiding te wijzigen.

Samenvatting

Coronaire hartziekte blijft een belangrijke oorzaak van de dood, die miljoenen Amerikanen. Met het gebrek aan autologe vasculaire transplantaten beschikbaar, ontwikkeld grafts een groot potentieel voor de behandeling van patiënten. Echter, gemanipuleerde vasculaire grafts algemeen niet gemakkelijk schaalbaar, ter vervaardiging van aangepaste mallen of polymeer buizen om te passen aan de grootte, die een tijdrovende en kostbare praktijk. Menselijke slagaders variëren in lumen diameter van ongeveer 2,0-38 mm en een wanddikte van ongeveer 0,5-2,5 mm. We hebben een methode gecreëerd, aangeduid als de "Ring stapelmethode," waarin variabele grootte ringen van weefsel van het gewenste celtype, toonde hier met vasculaire gladde spiercellen (SMC), kan worden gemaakt met geleidingen centrum posten lumendiameter beheersen en buitenste schelpen wanddikte van het drukvat te dicteren. Deze weefsels ringen worden vervolgens gestapeld tot een buisvormige construct, het nabootsen van de natuurlijke vorm van een bloedvat. De lengte vat kan be afgestemd door simpelweg het aantal ringen die nodig is om de lengte nodig vormen stapelen. Met onze techniek, kan weefsels van buisvormige membranen, vergelijkbaar met een bloedvat, gemakkelijk worden vervaardigd in verschillende afmetingen en lengtes aan de behoeften van de kliniek en patiënt voldoen.

Inleiding

Bij de behandeling van coronaire hartziekte (CAD), zijn eigen bloedvaten van de patiënt geoogst als entmateriaal voor bypassoperatie. Echter, vaak, zieke patiënten hebben geen levensvatbare schepen om te doneren aan zichzelf, en wanneer ze dat doen, de donor gebied veroorzaakt aanzienlijke extra schade en heeft een ernstig risico op infectie. ¹ Engineered vasculaire implantaten kunnen deze behoefte in te vullen. Schaalbaarheid van het grootste belang voor engineering vaartuigen om de uiteenlopende patiëntafmeting verblijf voldoen. Echter, huidige methoden voor engineering schepen zijn niet gemakkelijk schaalbaar en vergen doorgaans herfabricage van complexe vormen of polymeer steigers. De meeste engineered grafts ofwel gebruik van een polymeer buisvormige scaffold dat is bezaaid met vasculaire fibroblasten, gladde spiercellen of endotheelcellen; of het werpen van een cel vel rond een doorn om een ​​tissue buis te creëren. Twee gemanipuleerde vasculaire implantaten in klinische studies gebaseerd op decellularized polymeer-ECM-platform. ^{2, 3, 4} Polymeer transplantaten beschikbaar voor gebruik in vasculaire reparatie reeds bekend om problemen met doorgankelijkheid, welke als een groot probleem bij langdurig gebruik van een implantaat met een voortdurende aanwezigheid polymeer kunnen aandienen. Buisvormige mallen werden gebruikt om volledig cellulaire schepen, ^{5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13} welke procedures zouden extra ontwerp en vervaardiging van werktuigen voor aangepaste matrijzen nodig hebben om schepen te produceren in een verscheidenheid van grootte fabriceren .

De hierin beschreven werkwijze omvat een nieuwe techniek voor het maken eenvoudig schaalbaar ontworpen vasculaireenten met behulp van aanpasbare 3D geprint inserts en traditionele cultuur platen. ¹⁴ Cellen worden gezaaid in platen met inzetstukken van een centrale post en buitenste schil. De controles achteraf lumen diameter en laat de cel monolaag om zelf te assembleren in een ring van weefsel. De behuizing controles dikte van de ring, en dus wanddikte van de uiteindelijke vat. Afgesloten weefsel ringen worden vervolgens gestapeld tot een buisvormige vasculaire graft vormen. Het voordeel van deze methode, de zogenaamde "Ring stapelmethode," dat aanhechtend celtype kan worden gezaaid in de plaat opstart en weefsel ringen of buizen van elke omvang die voor de gewenste toepassing kan worden gegenereerd door eenvoudig modificeren gids inserts. Vergelijkende technieken weefselengineering creëren ringen weefsel blijft moeilijk schaal ^{15, 16} ter verwerk van mallen voor elke gewenste afmeting. Bovendien, vasculaire transplantaten gemaakt met deze methode kan producerend in 2-3 weken, verscheidene weken sneller dan bij andere hoogwaardige schepen. ⁶ Voor de kliniek, kan deze tijd discrepantie een significant verschil in de behandeling van een verslechterende patiënt.

Protocol

1. Cel Cultuur Voorbereiding

1. Maak gebruik van menselijke aorta gladde spiercellen in de handel gekocht.
2. Handhaven cellen in gladde spier celgroei media bestaande uit 88,6% 231 media, 0,1% elk van recombinant humaan insuline (rv-insuline), recombinant humaan fibroblast growth factor (rv-FGF), recombinante humane epidermale groeifactor (rv-FGF), en ascorbinezuur; en 5% elk van foetaal runderserum (FBS) en L-glutamine; en 1% antibioticum / antimycoticum.
   OPMERKING: Elke groeifactor, FBS en L-glutamine worden gekocht als een vasculaire media groei kit.
3. Change media om de 48 uur tot de cellen zijn ongeveer 90% confluent en klaar voor weefsel zaaien.
4. Store cellen in een incubator in tussen media veranderingen voor uitbreiding.

2. Voorbereiding van de 3D Gedrukte Inserts en Custom Siliconen Gegoten Plates

1. Gebruik een commerciële 3D-printer (bijvoorbeeld Replicator Mini) voor 3D-printen van de plaat inserts.
   1. gebruik opnl source 3D-ontwerpsoftware, zoals Blender om de 3D-modellen van de gedrukte buitenste schelpen en posten.
   2. Exporteer het model driver-bestand via een .stl formaat waardoor draagbaarheid om de software van de 3D-printer.
   3. Produceren gedrukte posten en buitenmantels gebruikt poly (melkzuur) filament (PLA) geladen in de 3D printer.
   4. Na het afdrukken, het uitvoeren van een 30-minuten weken in een 70% -100% ethanol oplossing voor elke insert steriliseren.
2. Bereid een 1:10 hardingsmiddel polymeermengsel poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) siliconenpolymeer baseren en laat het mengsel ontgast bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
   1. Definieer petrischaal afmetingen als klein (35 mm), tussenproduct (60 mm) en grote (100 mm).
   2. Voeg 2 ml, 4 ml en 6 ml uitgeharde siliconen om elke kleine, gemiddelde en grote plaat, respectievelijk, en een dunne laag over de gehele bodem van de petrischaal.
   3. Maak berichten voor de kleine bord door het gieten van PDMS in een100 mm plaat tot een hoogte van 7 mm en laten uitharden op een hete plaat bij 60 ° C gedurende 2-3 uur. Maak dan gebruik van een 5 mm biopsie punch punch uit cilindrische berichten. Gebruik een kleine hoeveelheid onverhard PDMS beveiligen PDMS elke cilinder en het midden van elk plaatje.
   4. Voor de gemiddelde en grote platen vóór uitharden van de PDMS invullen op de bodem van het schaaltje, zet de 3D afgedrukte berichten 10 mm en 20 mm centraal in elk tussenliggende en grote platen, respectievelijk. Voor de grote platen, bovendien plaats een 3D geprint buitenste schil ongeveer 66,7 mm in diameter gelijke afstand van de post.
      1. Laat elk gerecht uitharden in de open lucht op een hete plaat bij 60 ° C gedurende ongeveer 2-3 uur, zodat 18 uren voor het ontgassen van het polymeer. Fix gedrukte elementen aan de plaat in de juiste regio en oriëntatie zoals getoond in figuur 1.
   5. Voeg een oplossing van 70% ethanol met 30% gedestilleerd water gedurende 30 minuten om de binnenkant van plates voor sterilisatie en vervolgens dekking elke plaat.
   6. Zorgvuldig aspireren de ethanol uit elke plaat en laat aan de lucht drogen.
   7. Schik elke plaat in een biologisch veiligheidskabinet (BSC) naast zijn deksel, face-up. Expose borden en deksels UV licht onder het BSC 30 minuten sterilisatie voltooien. Steriele techniek wordt uitgevoerd bij elke stap na blootstelling aan UV.

3. Bereiding van Hydrogel fibrine, enten met gladde spiercel en onderhoud van platen

1. Meng een oplossing van fibrine gel met groeimedia + 0,01% TGF-β1 in de hoeveelheden van 0,5 ml, 1,1 ml en 1,81 ml voor kleine, midden en grote plaat maten, respectievelijk.
   1. Voeg 40 pl, 88,4 uL en 145 uL van trombine uit een voorraad van 100 U / ml aan de media van elke kleine, gemiddelde en grote plaat, respectievelijk. Zwenk elke plaat met de hand om ervoor te zorgen dat trombine wordt gelijkmatig gemengd in de media.
   2. Voeg vervolgens 1601, L, 354 pl en 580 pl fibrinogeen, uit een voorraad van 20 mg / ml, druppelsgewijs circulair de trombine-media mengsel aan elke kleine, gemiddelde en grote plaat, respectievelijk. Zwenk de hand te waarborgen mengen en verdeling van de hydrogel in een gelijkmatige laag.
   3. Sta hydrogel uitharden gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur.
2. Trypsinize gladde spiercellen Geëxpandeerd 150 mm celkweekplaten en centrifuge volgens standaardprotocollen. De resulterende pellet worden geresuspendeerd in 3 ml differentiatie media bestaande uit 98% - 231 media, 1% FBS en 1% antibioticum / antimycoticum.
   1. Krachtig mengen cellen door titratie op en neer met een 2 mL pipet te breken een cel klonten. Aantal cellen met een hemocytometer en een celsuspensie van 2 x 10 ⁶ cellen / ml, 1,0 x 10 ⁷ cellen / ml en 1,4 x 10 ⁷ cellen / ml voor kleine, gemiddelde en grote platen respectievelijk.
   2. Voeg 1 ml elke celsuspensie into een overeenkomstige 50 ml conische gelabeld klein, midden en groot. Zo'n additioneel 50 ml conische deze wijze per extra weefselring gewenst.
   3. Voeg differentiatie media aan elke conische definitieve zaaien volumes van 2 ml, 4 ml en 5 ml voor elke kleine, gemiddelde en grote vaten te verkrijgen, respectievelijk. Vervolgens voorzichtig pipet de cel oplossing druppelsgewijs bovenop de bereide hydrogel in elke corresponderende plaat.
   4. Plaats platen in de incubator bij 37 ° C en _5% CO2.
3. Change differentiatie media elke 48-72 uur voor elke plaat. In het geval van de grotere plaat, veranderingsmedia aanvankelijk na 24 uur, dan veranderen om 48-24 uur te compenseren grootcellig zaaidichtheid.
   1. Na 2-4 dagen als de ringen volledig in zal hebben opgelopen in de richting van de post, voeg 10 pi, 20 pi en 35 pi van TGF-β1 aan elk klein, midden en grote ring, respectievelijk. Na blootstelling aan TGF-β, 1 ten minste 24 uur, ringen gereed zijn behandeld.

4. Montage van Vascular Construct en onderhoud

1. Voor de vervaardiging van de uiteindelijke vasculair construct, wordt een speciale houder gemaakt om het voltooide vat te houden.
   1. Voor de kleine vaartuig, zorgen voor een hoge kentekenplaat voor ring stapelen door het snijden van een 2-inch doorsnede uit de top van een 50 ml polycarbonaat conische buis, en vervolgens PDMS lijm de snijrand in een 35 mm plaat. Gebruik de conische deksel als de plaat deksel.
   2. Voor de tussenliggende en grote schip hoge ring stapelen platen, snijd een 1,75-inch diameter polycarbonaat buis in 2,5 inch secties in de lengte om te dienen als de grote plaat muren. Voor de lange plaat bodems, snijd een 0.125-inch dikke polycarbonaat in 2-inch cirkel met een diameter stukken. Met behulp van acryl lijm, binden de polycarbonaat buis sectie om de cirkelvormige gesneden stuk. Gebruik het deksel van een 60 mm petrischaal als het deksel voor de lange plaat.
   3. 3D print posten 5, 10 en 20 mm in diameter en 50 mm lang.
   4. Voeg 10 ml niet uitgeharde siliconen elke container. Voorafgaand aan de volledige uitharding van het PDMS, centraal plaatst elk bericht gemaakt in stap 4.1.3 in elke kleine, tussentijdse, en grote container.
   5. Laten uitharden op een hete plaat ingesteld op 60 ° C gedurende 2-3 uur.
   6. Steriliseren met een oplossing van 70% ethanol met 30% gedestilleerd water gedurende 30 minuten.
   7. Zorgvuldig aspireren de ethanol uit elke container en laat aan de lucht drogen in de BSC. Vervolgens regelen van de containers in de kap met elke plaat geplaatst naast het deksel, face-up. Blootstellen aan UV-licht onder de BSC gedurende nog 30 minuten verder sterilisatie. Gebruik steriele techniek bij elke stap na blootstelling aan UV.
2. Met behulp van zeer fijne tang, verwijder voorzichtig elke strak opgerold gladde spieren hydrogel ring uit zijn post en over te dragen aan de bijbehorende grotere container met de hoge posten.
   1. Gebruik een paarpincet in elke hand en hef één zijde van de ring van de paal, en dan de andere. Wees voorzichtig te beschermen en het lumen te handhaven.
   2. Voer de overdracht met deze twee handen werkwijze schuiven eerste zijde, dan de andere zijde van de ring op de hoge paal. Met behulp van zachte, geleidelijke bewegingen, en de omtrek werken, duw langzaam de ring naar beneden op de hoge paal. Vervolgens stapelen ringen weefsel tot de gewenste lengte vaartuig is verkregen, waarbij elke ring toevoeging van ongeveer 1-2 mm lengte aan de voltooide construct.
3. Met de ring stapel gepositioneerd op de lange 3D gedrukte berichten, zet de plaat, zodat de post parallel aan het werkoppervlak is.
   1. Met behulp van een micropipet, voeg 40, 80 en 160 ui thrombine met een concentratie van 100 U / mL voorzichtig aan het buitenoppervlak van elke kleine, gemiddelde en grote vaten, respectievelijk. Terwijl het toevoegen van de trombine, langzaam draai de plaat om de dekking van alle oppervlakken van het construct te verzekeren zelfs.Dit zal de basis voor de fibrinelijm gebruikt om de ring stapel construct veilig in de eerste dagen na constructie.
   2. Voeg vervolgens 40, 80 en 160 pi van fibrinogeen in een concentratie van 20 mg / ml tot elke kleine, intermediaire en grote construct, respectievelijk, met behulp van een micropipet terwijl sneldraaiende het construct. De trombine en fibrinogeen snel set in een stevige gel eenmaal gemengd. Door de korte uithardingstijd, toepassen fibrinogeen zo snel en gelijkmatig mogelijk.
4. Voeg 20 ml differentiatie medium elke container die het construct. Plaats kolven op een 37 ° C incubator tot gebruik. Wijzig de media elke 3-5 dagen.

Resultaten

Is hier zichtbaar vervaardiging van 3 verschillendenanomaterialen vasculaire graft maten (figuur 1), waaruit blijkt dat de ringstapeling Method (RSM) is schaalbaar. Om toepasbaarheid te bewijzen, de 3 verschillende grootte van de vaartuigen gekozen correlaat op ware grootte menselijke vaartuig voor de linker anterieure dalende slagader (small; lumen diameter = 4 mm) ^17, dalende aorta (tussenproduct; lumen diameter = 10 mm) en de stijgende aorta (g...

Discussie

De Ring Stacking Method biedt meerdere voordelen ten opzichte van de huidige vasculaire tissue engineered construct technieken. De RSM kan worden aangepast aan menselijke voertuigen van elke grootte door simpelweg aanpassen van de post en buitenschaal afmetingen. Onze methode maakt ontwikkeling van polymeervrije ontworpen vaartuigen uitsluitend uit menselijke cellen en snel afbreekbare dragermateriaal in het lichaam de natuurlijke wondgenezingsproces. Polymer grafts is bekend dat restenose veroorzaken in de kliniek en p...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Human Aortic Smooth Muscle Cells	ATCC	PCS-100-012	vasculaire gladde spiercellen
Medium 231	Gibco (Life Technologies	M-231-500	media specifiek voor vasculaire gladde spiercellen
Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PSC-100-042	groeifactoren voor het behoud van de levensvatbaarheid van vasculaire gladde spiercellen
Replicator Mini 3D printer	MakerBot	N/A	3D-printer
Poly(lactic acid) 3D ink (PLA)	MakerBot	N/A	3D-printerfilament
Poly(dimethlysiloxane) (PDMS)	Ellworth Adhesives	3097358-1004	polymeer voor het lijmen van plaatonderdelen
Fibrinogeen	Hyclone Labratories, Inc.	SH30256.01	fibrinegelcomponent
Thrombine	Sigma Life Sciences	F3879-5G	fibrinegelcomponent
Tranforming Growth Factor-Beta 1	PeproTech	100-21	groeifactor voor het stimuleren van collageenproductie
Hemocytometer	Hausser Scientific Co.	3200	voor celtelling
Polycarbonaatbuis	US Plastics	PCTUB1.750X1.625	materiaal voor het maken van hoge, ring-stapelplaten
Polycarbonaatplaat	Home Depot	409497	materiaal voor het maken van hoge, ring-stapelplaten
Kleefmiddelpolymeeroplosmiddel	SCIGRIP	10799	materiaal voor het maken van hoge, ring-stapelplaten
Instron 5940	Instron	N/A	trektestmachine
U-Stretch	Cell Scale	N/A	trektestmachine
Smooth Muscle Actin	MA5-11547	Thermo Fisher	antilichaam
Tropomyosine	MA5-11783	Thermo Fisher	antilichaam