Methodenartikel

In vivo Tracking van Oedema Ontwikkeling En Microvasculaire Patologie In Een Model Van Experimentele Cerebrale Malaria Met Magnetic Resonance Imaging

DOI:

10.3791/55334

⸱

8 juni 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroradiology, Heidelberg University Hospital, 2Division of Experimental Radiology, Department of Neuroradiology, Heidelberg University Hospital, 3NeuroImaging Centre Research, Department of Neuroscience, Ruhr-University Bochum, 4Centre for Infectious Diseases, Parasitology Unit, Heidelberg University Hospital, 5German Centre for Infection Research (DZIF), 6Department of Neuroradiology, University of Würzburg, 7Center for Childhood and Adolescent Medicine, General Pediatrics, Heidelberg University Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een muismodel van experimentele cerebrale malaria en laten zien hoe inflammatoire en microvasculaire pathologie in vivo kunnen worden gevolgd met behulp van magnetische resonantie beeldvorming.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cerebrale malaria is een teken van ernstige malaria en is vaak een voorbode van de dood. Hoewel agressieve behandeling levensreddend kan zijn, kan de detectie van cerebrale malaria moeilijk zijn. We presenteren een experimenteel muismodel van cerebrale malaria dat meerdere kenmerken van de menselijke ziekte deelt, inclusief oedeem en microvasculaire pathologie. Met behulp van magnetische resonantie beeldvorming (MRI) kunnen we de verstoring van de bloed-hersenbarrière, de ontwikkeling van oedeem en de daaropvolgende hersenzwelling detecteren en volgen. We beschrijven meerdere MRI-technieken die deze relevante pathologische veranderingen kunnen visualiseren. Daarom laten we zien dat MRI een waardevol hulpmiddel is om pathologische veranderingen, zoals oedeem, hersenzwelling en microvasculaire pathologie, in vivo te visualiseren en te volgen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malaria is een belangrijk wereldwijd gezondheidsprobleem. 1 Ernstige malaria wordt in het bijzonder gekenmerkt door cerebrale betrokkenheid en is vaak een slechte prognostische factor. Cerebrale betrokkenheid is gebruikelijk bij kinderen jonger dan vijf jaar in gebieden met een hoge transmissie van malaria en vertegenwoordigt de belangrijkste oorzaak van malariaverwante dood in die leeftijdsgroep. 1 Terwijl agressieve behandeling levensreddend kan zijn, kan het opsporen van cerebrale malaria, vooral in vroege fasen, moeilijk zijn. De pathologische processen die betrokken zijn bij cerebrale malaria omvatten microvasculaire verstoring en cerebrale oedeem, die kan leiden tot ernstige hersenzwelling. In dit artikel presenteren we een magnetisch resonantiebeeldvorming (MRI) protocol dat de gehele hersenen in vivo beeldvorming van experimentele cerebrale malaria (ECM) mogelijk maakt. Gehele hersenen met hoge resolutie beeldvormingsmethoden zijn in deze ziekte wijd ondergebracht, alhoewel weinig bekend is over de manier waarop ECM in de centrale startZenuwstelsel of welke specifieke mechanismen leiden tot de ziekte. In vivo MRI, die de hele hersenen bedekt, vertegenwoordigt een belangrijk onderzoeksinstrument om een ​​beter begrip van ECM pathologie te krijgen. MRI is in staat om wereldwijde cerebrale hersenswelling te beoordelen, die onlangs werd erkend als een belangrijke voorspeller van de dood, niet alleen bij ECM, maar ook bij menselijke cerebrale malaria. 2 , 3 Ernstige hersenzwelling komt voor bij dodelijke ziekte en vertegenwoordigt één van verschillende pathologische kenmerken tussen de ECM-modellen en de menselijke ziekte, een ziekte die wordt gekenmerkt door zowel inflammatoire als microvasculaire veranderingen. 4

ECM kan geïnduceerd worden in CBA- of C57BL-muizen door infectie met dodelijke Plasmodium berghei ANKA. 5 Het ontstaan ​​van ECM komt meestal voor tussen de dagen 6 en 10 na infectie en resulteert in montage, ataxie, ademhalingsstoornissen en coma, die tot rap leidenId dood. 4 De Rapid Murine Coma and Behavior Scale (RMCBS) is een nuttige score om klinische symptomen van ECM te evalueren. Het bestaat uit 10 parameters, elk gescoord van 0 tot 2, met een maximale score van 20. 6 Onlangs hebben we een goede afspraak gemaakt tussen de ernst van de RMCBS scores in ECM muizen en pathologische veranderingen aangetoond door MRI. 7 In dit protocol beschrijven we ECM-inductie bij muizen en in vivo magnetische resonantiebeeldvorming van muizen met ECM.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven die in dit artikel zijn gerapporteerd, werden uitgevoerd volgens de richtlijnen Federatie voor Laboratorium Diervoederverenigingen (FELASA) categorie B en de richtlijnen Samenleving van Laboratorium Diervoederkunde (GV-SOLAS) en werden goedgekeurd door de lokale Duitse autoriteiten in Karlsruhe (Regierungspräsidium Karlsruhe , Duitsland). Let op dat biosavety level 2 van toepassing is op muggen en Plasmodium berghei ANKA sporozoite werk.

1. Infectie

  1. Infect Anopheles stephensi muggen met Plasmodium berghei ANKA door ze 15 minuten op een gametocytemische muis te voeden. Bewaar de geïnfecteerde muggen bij 80% vochtigheid en 21 ° C.
  2. Verzamel vrouwelijke muggen uit hun kooi 17 tot 22 dagen na de bloedmaaltijd. Plaats ze op ijs om hen te verdoving.
  3. Met behulp van pincet, plaats drie tot vier muggen op een glazen glijbaan bedekt met een druppel koud RPMI medium. Plaats de dia onder een microscoop.
  4. Trek de muskus zorgvuldig uit tussen het hoofd en het lichaam. Isoleer de speekselklier met behulp van een spuit en naald. Herhaal deze procedure met de overige muggen.
  5. Verzamel de speekselklieren uit de glazen glijbaan door ze met een glazen pipet te zuigen en ze te verzamelen in een 1,5 ml centrifugebuis.
    OPMERKING: Afhankelijk van de infectiesnelheden, kunnen bij voorkeur 8000 tot 15.000 infectieuze sporozoieten per speekselklier worden verkregen.
  6. Breek ongeveer drie minuten de geïsoleerde speekselklieren binnen de centrifugebuis met een kleine plastic stok om de sporozoieten van het speeksel van speeksel te isoleren.
  7. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 1000 xg en 4 ° C om de sporozoieten te zuiveren uit het resterende weefsel.
  8. Pipetteer de supernatant, die de sporozoieten (SPZ) bevat, naar een nieuwe centrifugebuis en tel de gezuiverde sporozoieten in een Neubauer hemocytometer.
  9. Pas de concentratie van gezuiverde sporozoieten aan op 10.000 / ml door phOsfaat-gebufferde zoutoplossing.
  10. Injecteer in totaal 1 000 sporozoieten (0,1 ml) in de staartvenen van ingeboren C57BL / 6 muizen om infectie te starten. Om de injecties te vergemakkelijken, plaats de C57BL / 6-muizen in een restrainer en zet de staarten warm in (ongeveer 37 ° C) water om te helpen bij het visualiseren van de staartvenen;
    OPMERKING: De injectie zelf is een korte procedure die binnen enkele seconden kan worden uitgevoerd.
  11. Eens daags, controleer bloedstamsparasitemie op bloeduitstrijkjes vanaf dag 3 na de SPZ-infectie.
    OPMERKING: Monitoring parasitemie is eerder in een JoVE-artikel van Mueller et al voorgesteld . 8
  12. Evalueer de muizen eenmaal per dag met de score van de snelle muizencommando en gedragscode (RMCBS), vanaf 5 dagen na de injectie van de sporozoïet.
    OPMERKING: een gedetailleerde beschrijving van deze procedure, inclusief een videodemonstratie, is gepubliceerd door Caroll et al. 6
  13. schattenDe muizen met MRI beeldvorming volgens de RMCBS score en de onderzoeksvraag die moet worden aangepakt. 6

2. Magnetische Resonantie Imaging Setup

  1. Voer MR uit op een 9.4T kleine dieren scanner met behulp van een volume resonator voor radiofrequentie transmissie en een 4-kanaals fase-array oppervlak ontvanger spoel. Zet het temperatuurgestuurde waterbad aan op 42 ° C om de lichaamstemperatuur van de muis te behouden.
  2. Verdamp anesthesie in een kamer met 2% isofluraan en perslucht totdat de muis niet meer reageert op een teenknijp. Behoud de anesthesie bij 1-1,5%.
  3. Plaats een staartvaatkatheter in de staartader van de muis. Plaats de muis voor MRI door het gevoelig te maken en met een gekrompte rug op een dierenbed uitgerust met een hoofd- en tandbalk om de hoofdbeweging te minimaliseren. Zorg ervoor dat u de cervicale wervelkolom van de muis niet rechtstelt.
  4. Sluit een injectie systeem voor het contrastmiddel aan op de staartvaatkatheter. Gebruik een op maat gemaakt injectiesysteem gevuld met een Gd-DTPA (0,3 mmol / kg) spuit of gebruik een PE-buis aangesloten op een Gd-DTPA (0,3 mmol / kg) spuit.
  5. Breng dexpanthenol oogsalf aan beide ogen aan. Plaats de 4-kanaals-fase-array-oppervlaktontvangerkopspoel op het hoofd van de muis. Plaats een ademhalingstapje op de achterkant van de muis en sluit deze aan op een ademhalingsbewakingsapparaat.

3. Imaging Protocol

OPMERKING: Kies afbeeldingssequenties uit het onderstaande protocol volgens de te onderzoeken onderzoeksvragen. Alle vermelde parameters zijn geldig voor de MRI-software, maar moet mogelijk worden aangepast als andere softwareprogramma's worden gebruikt.

  1. Begin door een lokaliserende scan uit te voeren om ervoor te zorgen dat de muisbrein in het isocenter van de magneet zit.
  2. Om het vasogenische oedeem kwalitatief te beoordelen, gebruik 3D T2-gewogen beeldvorming door een multi-slice RARE-volgorde te selecteren.
    1. Voer de volgende pa inRameters in de MRI-software: herhalingstijd = 2.000 ms, echo-tijd = 22 ms, isotrope resolutie = 0,1 mm, zichtveld = 20 x 10 x 12 mm 3 ; Matrix = 200 x 100 x 120, fliphoek = 90-180 °; (Spin-echo) en zeldzame factor = 8. Start de volgorde en wacht 10 min 48 s om de ruwe beelden te verkrijgen.
  3. Om vasogeen oedeem kwantitatief te bepalen, voer T2 relaxometrie uit door een multi-slice, multiple spin echo sequentie te selecteren.
    1. Gebruik de volgende parameters: herhalingstijd = 3.100 ms, echo tijd = 8-136 ms in stappen van 8 ms, aantal slices = 17, slice dikte = 0,7 mm, in vlakke resolutie = 0.116 mm x 0.116 mm, zichtveld 20 X 20 mm 2 , matrix = 172 x 172, fliphoek = 90-180 graden; (Spin-echo). Start de volgorde en wacht 8 min 53 s om de ruwe beelden te verwerven.
  4. Om kwantitatief zowel vasogeen oedeem als cytotoxisch oedeem te beoordelen, voer diffusiegewogen beeldvorming / schijnbare diffusiecoëFficient (ADC) mapping door een spin-echo EPI diffusie sequentie te selecteren.
    1. Gebruik de volgende parameters: herhalingstijd = 3.400 ms, echo-tijd = 20 ms, schijfdikte = 0,7 mm, aantal slices = 17, aantal diffusiegevoelige richtingen = 30, b waarde = 1.500 s / mm 2 , δ = 3 ms , Δ = 9 ms, gedeeltelijke Fourier coderende versnellingsfactor = 1,51, gezichtsveld = 12 x 15 mm 2 , matrix = 96 x 128, in-vlak resolutie = 0.125 mm x 0.117 mm, fliphoek = 90-180 graden, en Aantal verzadigingsplaten (sagittal) = 1. Start de volgorde en wacht 7 min 56 s tot de ruwe beelden worden verkregen.
  5. Om microhemorrhages te beoordelen, gebruik 3D T2 * -gewogen beeldvorming. Selecteer een flow-gecompenseerde FLASH-volgorde.
    1. Voer de volgende parameters in in de MRI-software: herhalingstijd = 2.000 ms, echo-tijd = 22 ms, isotrope resolutie 0,08 mm, zichtveld = 32 x 15 x 8 mm 3 , matrixgrootte = 400 x 188 x 100 en fLiphoek = 12 graden. Start de volgorde en wacht 15 min 40 s om de ruwe beelden te verwerven.
  6. Om arteriële patency te beoordelen, gebruik de tijd van de vlucht angiografie door een 3D FLASH-sequentie te selecteren.
    1. Gebruik de volgende parameters in de MRI-software: herhalingstijd = 16 ms, echo-tijd = 3,5 ms, schijfdikte = 0,07 mm, in-plane resolutie = 0.104 x 0.104 mm, zichtveld = 20 x 20 x 10 mm 3 , matrix = 192 x 192 x 142, en fliphoek = 15 graden. Start de volgorde en wacht 7 min 16 s tot de afbeeldingen worden verkregen.
  7. Om de bloed-hersenbarrière verstoring te beoordelen, gebruik 3D T1-gewogen beeldvorming voor en na een injectie van een contrastmiddel van 0,3 mmol / kg. Selecteer een radiofrequentie-verwende FLASH-sequentie met een globale radiofrequentie excitatie.
    1. Gebruik de volgende volgordeparameters in de MRI-software: herhalingstijd = 5 ms, echo-tijd = 1,9 ms, isotrope resolutie = 0,156 mm, gezichtsveld 20 x 18,7X 18,7 mm 3 , matrix 128 x 120 x 120 en fliphoek = 8,5 °; Begin de volgorde en wacht 1 min 14s tot de beelden zijn verkregen.

4. Beeldverwerking en analyse

  1. Om de bloed-hersenbarrière verstoring te analyseren, trek 3D niet-verbeterde T1-gewogen beelden af ​​van verbeterde T1-gewogen afbeeldingen met het rekenkundig gereedschap of beeldrekenaargereedschap in ImageJ. Evalueer de aftrekbeelden voor een toename van het signaal, dat overeenkomt met bloed-hersenbarrière verstoring. 9
  2. Om hersenvolume te analyseren, gebruik native 3D T1- of 3D T2-gewogen datasets. Delineer de hersenen van de olfactorische bol naar het cerebellum met behulp van de segmenteringsredacteur. 10
  3. Vasogeen oedeem
    1. Verwerk de T2 relaxometrie data met MRI software of gebruik een nonlinear least squares fit procedure. 11 Proces diffusie gewogen gegevens om ADC kaarten te verkrijgen met behulp van MRI sofTware of FDT toolbox (zie Material Table ).
    2. Plaats gebieden van belang handmatig in de verschillende anatomische gebieden.
      OPMERKING: Automatische plaatsing van belangengebieden kan onjuist inschrijven als gevolg van significante hersenzwelling. De T2-tijden en ADC-waarden van de gekozen anatomische gebieden worden op deze wijze verkregen.
  4. Om microhemoragevolume te analyseren, worden microhemorrhages afgebeeld die als ovoide, dark foci op T2 * -gewogen datasets verschijnen, met behulp van de segmenteringsredacteur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij C57BL / 6 muizen kunnen de eerste klinische symptomen van ECM tussen dagen 6 en 10 worden waargenomen na infectie met P. berghei ANKA sporozoites. ECM ontwikkelt zich in 60-80% van de geïnfecteerde muizen en komt snel binnen 24 tot 48 uur naar de coma en de dood. In tegenstelling tot deze, komen muizen die geen ECM ontwikkelen na de tweede week na infectie af aan ernstige bloedarmoede door hyperparasitemie. 12

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel beschrijven we een volledig hersen MRI protocol om veranderingen in experimentele cerebrale malaria te definiëren. Wij zijn ervan overtuigd dat MRI tot op heden onvoldoende benut is in het onderzoek naar malaria en hoop dat onze protocollen andere onderzoekers zullen helpen. We willen graag enkele extra punten omschrijven die nuttig kunnen zijn.

Als ernstig zieke muizen worden afgebeeld, is positionering van cruciaal belang. Vanwege de verhoogde intracraniale druk zijn muizen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De deskundige technische bijstand van Miriam Reinig wordt dankbaar erkend. AH heeft financiering ontvangen van een postdoctorale beurs van de Medische Faculteit van de Universiteit van Heidelberg. MP wordt ondersteund door een memorandum van de Stichting Else-Kröner-Fresenius. AKM is een ontvanger van een moederschapsverlof van de DZIF Academie van het Duitse Centrum voor Infectie Onderzoek (DZIF). JP is de ontvanger van een Heidelberg Research Center for Molecular Medicine (HRCMM) Loopbaanontwikkelingsgenootschap. We erkennen ook dankbaar Julia M. Sattler en Friedrich Frischknecht voor het verschaffen van een voorbeeldige film van sporozoite beweging.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
IsofluraanBaxter1001747voor anesthesie
DotaremGuebert1086923Gd-DTPA contrastmiddel; 0,5 mmol/mL
Amira (beeldverwerkingsprogramma)FEI GroupVersie Amira 5.3.2
MATLAB The MathWorks, Inc.,Release 2012b
FDT toolbox FMRIB's Software Libraryhttp://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
  2. Seydel, K. B., et al. Brain swelling and death in children with cerebral malaria. N Engl J Med. 372 (12), 1126-1137 (2015).
  3. Penet, M. F., et al. Imaging experimental cerebral malaria in vivo: significant role of ischemic brain edema. J Neurosci. 25 (32), 7352-7358 (2005).
  4. de Souza, J. B., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes Infect. 4 (3), 291-300 (2002).
  5. Curfs, J. H., van der Meide, P. H., Billiau, A., Meuwissen, J. H., Eling, W. M. Plasmodium berghei: recombinant interferon-gamma and the development of parasitemia and cerebral lesions in malaria-infected mice. Exp Parasitol. 77 (2), 212-223 (1993).
  6. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), (2010).
  7. Hoffmann, A., et al. Experimental Cerebral Malaria Spreads along the Rostral Migratory Stream. PLoS Pathog. 12 (3), e1005470(2016).
  8. Mueller, A. K., Behrends, J., Blank, J., Schaible, U. E., Schneider, B. E. An experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei. J Vis Exp. (84), e50829(2014).
  9. Hynynen, K., McDannold, N., Sheikov, N. A., Jolesz, F. A., Vykhodtseva, N. Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. Neuroimage. 24 (1), 12-20 (2005).
  10. Nag, N., Mellott, T. J., Berger-Sweeney, J. E. Effects of postnatal dietary choline supplementation on motor regional brain volume and growth factor expression in a mouse model of Rett syndrome. Brain Res. 1237, 101-109 (2008).
  11. Giri, S., et al. T2 quantification for improved detection of myocardial edema. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 56(2009).
  12. Engwerda, C., Belnoue, E., Gruner, A. C., Renia, L. Experimental models of cerebral malaria. Curr Top Microbiol Immunol. 297, 103-143 (2005).
  13. Zhao, H., et al. Olfactory plays a key role in spatiotemporal pathogenesis of cerebral malaria. Cell Host Microbe. 15 (5), 551-563 (2014).
  14. Nacer, A., et al. Experimental cerebral malaria pathogenesis--hemodynamics at the blood brain barrier. PLoS Pathog. 10 (12), e1004528(2014).
  15. Nacer, A., et al. Neuroimmunological blood brain barrier opening in experimental cerebral malaria. PLoS Pathog. 8 (10), e1002982(2012).
  16. Pai, S., et al. Real-time imaging reveals the dynamics of leukocyte behaviour during experimental cerebral malaria pathogenesis. PLoS Pathog. 10 (7), e1004236(2014).
  17. Shaw, T. N., et al. Perivascular Arrest of CD8+ T Cells Is a Signature of Experimental Cerebral Malaria. PLoS Pathog. 11 (11), e1005210(2015).
  18. Potchen, M. J., et al. Acute brain MRI findings in 120 Malawian children with cerebral malaria: new insights into an ancient disease. AJNR Am J Neuroradiol. 33 (9), 1740-1746 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

bloed hersenbarri revasogeen oedeemT2 gewogen beeldvormingdiffusiegewogen beeldvormingtime of flight angiografieGd DTPA contrastexperimenteel muismodel

Gerelateerde artikelen