Modelleren van eierstokkanker Meercellige Sferoïde Gedrag in een dynamische 3D peritoneale microdevice

Samenvatting

Ovariële tumorprogressie te bestuderen in een fysiologisch relevante model multicellulaire sferoïden werden gekweekt in een micro-inrichting onder gesimuleerde fluïdumstroming. Deze dynamische 3D-model emuleert de intraperitoneale omgeving met de cellulaire en mechanische componenten, waar eierstokkanker metastase optreedt.

Samenvatting

Eierstokkanker wordt gekenmerkt door uitgebreide peritoneale metastase, met tumor bollen vaak gevonden in de kwaadaardige ascites. Dit wordt geassocieerd met een slechte klinische resultaten en mist momenteel effectieve behandeling. Zowel de driedimensionale (3D) omgeving en de dynamische mechanische krachten zijn zeer belangrijke factoren in dat metastatische cascade. Echter, traditionele celculturen niet aan deze natuurlijke tumor micro recapituleren. Dus, in vivo-achtige modellen die de intraperitoneale omgeving kan emuleren zijn evident belang. In deze studie werd een nieuwe microfluidic platform van het peritoneum werd opgezet om de situatie van eierstokkanker sferoïden na te bootsen in de peritoneale holte tijdens metastase. Eierstokkanker sferoïden die onder een niet-hechtende toestand werden gekweekt in microfluïdische kanalen bekleed met peritoneale mesotheelcellen onderworpen aan fysiologisch relevante shear stress. Kortom, deze dynamische 3D eierstokkanker-mesothelium microfluidic platform kan nieuwe inzichten verschaffen over fundamentele biologie van kanker en dienen als een platform voor potentiële screening en de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Inleiding

Eierstokkanker is de meest dodelijke gynaecologische kanker en wordt gekenmerkt door wijdverbreide peritoneale verspreiding en de vorming van kwaadaardige ascites ^1. Deze uitgebreide peritoneale metastasen is een belangrijke klinische uitdaging en wordt geassocieerd met slechte klinische resultaten. Unlike stevigste carcinomen die metastaseren via het bloed, eierstokkanker verspreidt vooral in de peritoneale holte. Tumorcellen bestaan als multicellulaire aggregaten / sferoïden tijdens het proces van metastase ^2. Dat suspensiekweek eierstokkanker stam / tumor-initiërende cellen kunnen verrijken suggereert verder dat deze sferoïden worden geassocieerd met zowel tumor agressiviteit en verbeterde chemoresistance ^{3, 4.} Er zijn verschillen in reactie drug tussen 2D en 3D culturen, die vermoedelijk hebben verschillende moleculaire mechanismen ^5.

_content "> De essentiële interactie met de mesothelium construeert de eerste micro-omgeving voor ovariële progressie van de tumor. Deze mesotheelcelsuppletie liggen op een extracellulaire matrix (ECM), waarbij fibronectine is een alomtegenwoordige bestanddeel. Een koppeling tussen de verhoogde expressie van mesotheelcellen cel afkomstige fibronectine en tumorprogressie is aangetoond. fibronectine overvloedig aanwezig is in maligne ascites ^{6, 7.} eierstokkanker cellen kunnen ook de afscheiding van fibronectine van mesotheelcellen induceren teneinde beginnende eierstokkanker metastase ⁸ promoten.

Opkomende bewijs dat mechanische stimuli, waaronder afschuifspanning, celmorfologie, genexpressie kunnen moduleren en dus de fenotypen van tumorcellen ^{9, 10, 11.} Zoals maligne ascites ontwikkelen en accumuleren in tumor progressie, ovarium tumorcellen worden blootgesteld aan fluïdumstroming en de resulterende schuifspanning. Een aantal groepen, ons inbegrepen, hebben de invloed van schuifspanning op eierstokkanker progressie getoond, waaronder cytoskelet modificaties, epitheliale naar mesenchymale transities en kanker stemness ^{12, 13, 14, 15.} Dus een fysiologisch relevante micro belangrijk voor het onderzoek naar tumor peritoneale metastasen. De huidige in vitro hydrodynamische kweeksystemen hebben beperkingen op nabootsen en besturen van een constante, lage, fysiologisch relevante schuifspanning ^{16, 17, 18, 19.} Conventionele in vitro studie gericht op ofwel de cellulaire of mechanische omgeving zijn nog beperkt innabootsen van de complexiteit van de intraperitoneale micro met de juiste fysiologische relevantie.

Hier, om een ​​nieuw model van het peritoneum ingenieur beperkingen van conventionele strategieën overwinnen en de studie van de intraperitoneale compartiment kanker metastase bevorderen, een 3D-microfluïdische platform gecontroleerde fluïdumstroom is gemaakt. In dit model, eierstokkanker sferoïden werden samen gekweekt met primaire humane peritoneale mesotheelcellen in microfluïdische chips onder continue vloeibare stroom (Figuur 1A). De mesotheliale cellen werden uitgeplaat op fibronectine. Niet-hechtende eierstokkanker sferoïden werden uitgezaaid in microkanalen met continue stroom medium geperfundeerd door een spuitpomp. Zowel de 3D-omgeving en de dynamische mechanische krachten zijn zeer belangrijke factoren van de metastatische cascade. Dit platform kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de intraperitoneale micro qua complexe CELlaire en co-cultuur interacties, alsook met betrekking tot dynamisch mechanische signalen.

Protocol

1. microfluïdische apparaat ontwerp en de fabricage

1. Microfluïdische meester ontwerp
   1. Ontwerp en teken de microfluïdische kanaal patroon met elke computer-aided design (CAD) software.
      OPMERKING: Normaal zal de CAD tekening kan een fotomasker bedrijf naar het fotomasker te produceren. De microfluïdische die bestaat uit drie identieke parallelle kanalen, elk met de volgende afmetingen: 4 mm x 25 mm x 250 urn (breedte x lengte x hoogte) en stel 2 mm. Beide kanaal uiteinden werden ontworpen met 127 ° hoek ten opzichte van vloeibare in- en uitgang (Figuur 1B) te vergemakkelijken. Het kanaal gebruikt in dit protocol werd bij een eerdere publicatie ^13.
   2. Was de siliciumwafel met ultrasone trillingen (500 W / 42 kHz) in aceton, isopropanol en gedeïoniseerd water gedurende 15 minuten elk. Drogen van de wafel met stikstofgas onder druk. Verwarm de siliciumwafel op een hete plaat bij 250 ° C gedurende 15 minuten volledig drogenhet.
   3. Spin-coat een laag van SU-8 2075 fotoresist (125 micrometer dik) op het silicium wafer met een draaiende snelheid van 1800 rpm. Bak de fotolak bedekte wafel direct op een hete plaat bij 65 ° C en vervolgens bij 95 ° C, om overmaat oplosmiddel respectievelijk verwijderen, 5 en 25 min (volgens de SU-8 producthandboek).
   4. Herhaal stap 3 en spin-coat een andere laag van SU-8 2075 fotoresist tot een uiteindelijke dikte van 250 pm te verkrijgen. Bak de fotolak bedekte wafel direct op een hete plaat bij 65 ° C gedurende 7 minuten en daarna bij 95 ° C gedurende 30 minuten. Langzaam koelen wafel tot kamertemperatuur. Niet koelen met perslucht.
   5. Lijn en zet het fotomasker direct op de wafer. Blootgesteld aan UV-licht gedurende 20 s om het patroon te verknopen.
   6. Bak de wafer met fotolak bij 65 ° C en 95 ° C op een verwarmingsplaat gedurende 5 en 12 minuten, respectievelijk, het oplosmiddel voor polymerisatie verwijderd (volgens de SU-8 producthandboek). Daarna Koel de wafelkamertemperatuur.
   7. Opheffen van de niet-verknoopte fotoresist door onderdompeling van de wafer in SU-8 ontwikkelaar 25 min. Spoel de wafer met isopropanol en droog met perslucht.
      LET OP: Als een melkachtige oplossing als spoelen met isopropanol, met vermelding van onvolledige ontwikkeling werd waargenomen, dompel de wafer terug in SU-8 developer voor een langere tijd ontwikkelen.
   8. Plaats de wafer op een hete plaat bij 180 ° C gedurende 10 minuten om het patroon van potentiële scheuren genezen. Schakel de hete plaat en langzaam afkoelen van de wafer op kamertemperatuur door het verlaten van het op de hete plaat.
   9. Voeg enkele druppels trichloor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silaan in een dop. Doe de dop in de vacuümexsiccator. Plaats de wafer naast de dop op de wafel silaniseren gedurende 10 min.
2. PDMS chip fabricage
   1. Wikkel de wafer met aluminiumfolie om een ​​houder te maken.
   2. Meng de polydimethylsiloxaan (PDMS) basis en verharder in een 10: 1 massaverhoudingmet een centrifugaal mixer onder de meng- en ontgassingsfunctie. Giet het PDMS mengsel langzaam op de wafer tot een hoogte van ongeveer 5 mm. Ontgas de PDMS onder vacuüm gedurende 40 min. Genezen van de PDMS in een oven bij 65 ° C gedurende 2 uur.
   3. Verwijder voorzichtig de PDMS plaat uit de master en snijd de PDMS langs de kanalen totdat het is de grootte van een glasplaatje. Pons de PDMS met een 1-mm biopsie punch om de in- en uitlaten van het apparaat te maken.
   4. Reinig de PDMS oppervlak met perslucht en plakband om stof en vuil te verwijderen PDMS.
   5. Plaats de PDMS plaat, met het kanaal kant naar boven, in een plasma schoner. Plaats een schoon glasplaatje in het plasma schoner naast de PDMS plaat.
   6. Behandel de PDMS en glazen schuif onder lucht plasma bij hoge RF niveau gedurende 1 minuut. Bind de PDMS aan het glaasje om een ​​onomkeerbare covalente binding te creëren.
   7. Plaats de PDMS chip op een hete plaat bij 150 ° C gedurende 1 uur om de hechtsterkte te verbeteren en de hydrop terugkerenhobicity van het PDMS voor gebruik.

2. Seeding de microfluïdische chip met primaire peritoneale mesotheelcellen (HPMCs)

1. Fibronectine coating van microfluïdische kanalen
   1. Steriliseer het microfluïde kanaal met 30 ui 75% ethanol. Wordt de ethanol en tweemaal spoelen met 30 ul van gesteriliseerde met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met een pipetpunt. Grondig aspireren PBS in de kanalen.
      Opmerking: Om contaminatie te minimaliseren, de microfluïdische celkweek worden zorgvuldig onder volledig aseptische omstandigheden uitgevoerd door het gebruik van een laminaire stroming kap.
   2. Bereid een 10 ug / ml fibronectine oplossing in serumvrij M199: MCDB105 (1: 1) -medium. Pipetteer de oplossing op en neer, met speciale zorg te borrelen vorming te voorkomen. Doe niet vortex.
   3. Langzaam vullen elk kanaal met 30 pi van fibronectine oplossing. Dicht de kanalen met tape en overnachting incubeer de chip bij 4 ° C.
2. Seeding HPMCs in de microfluïdische kanalen
   1. HPMCs cultuur in 10% foetaal runderserum (FBS) kweekmedium (M199: MCDB105 aangevuld met 10% FBS en 100 U / ml penicilline / streptomycine) onder _5% CO2 bij 37 ° C tot 80% confluentie.
   2. Spoel de HPMCs met 3 ml PBS en trypsinize met 2 ml 0,05% trypsine / 0,01% EDTA (TE) oplossing voor 30 s. Neutraliseren met 4 ml 10% FBS kweekmedium en spin down de cellen bij 1000 g gedurende 5 min.
   3. Resuspendeer de HPMCs in 2 ml 10% FBS kweekmedium. Tel het aantal cellen met een hemocytometer en stel de celconcentratie tot 3,5 x 10 ⁶ / ml.
   4. Verwarm het met fibronectine gecoate microfluïdische chip in een 37 ° C incubator gedurende 5 minuten vóór gebruik. Volledig zuig het fibronectine oplossing.
   5. Langzaam pipet 30 pi van HPMC suspensie in elk kanaal. Verzegel de kanalen met tape en plaats de apparaten in de _CO2 incubator gedurende de nacht.

3. Eierstokkanker Sferoïde Vorming en Co-cultuur

1. Eierstokkanker sferoïde formatie
   1. Handhaaf de menselijke ovariumcarcinoom-cellijn SKOV-3 in 5% FBS kweekmedium (M199: MCDB105 met 5% FBS en 100 U / ml penicilline / streptomycine) onder _5% CO2 bij 37 ° C voordat de experimenten.
   2. Ontbinding van 0,5% agarose in gesteriliseerd water door koken. Verdeel 50 ul van agarose oplossing in elke well van 96-well platen. Laat de platen in de kap 20 min om de agarose te stollen; gestolde agarose bekleden van de putjes kan celadhesie voorkomen en geeft aan dat de platen klaar voor gebruik.
   3. Spoel de SKOV-3 cellen met 3 ml PBS. Trypsinize met 2 ml TE oplossing gedurende 3 min. Neutraliseren met 4 ml 5% FBS kweekmedium en spin down de cellen bij 1000 g gedurende 5 min.
   4. Tel de SKOV-3 aantal cellen met een hemocytometer en resuspendeer de cellen in 5% FBS cultuurmedium in een dichtheid van 5000 cellen / ml. Transfer 200 pi celsuspensie in elk agarose gecoate goed en cultuur onder _5% CO2 bij 37 ° C gedurende 48 uur.
2. spheroïde kanker loading
   1. Transfer kanker sferoïden een 50 ml centrifugebuis vooraf bevochtigd met 1 ml serumvrij medium en spin neer op 750 xg gedurende 5 minuten.
      OPMERKING: Pre-nat pipet tips en centrifuge buizen kunnen ongewenste spheroïde bevestiging op de centrifuge buizen te voorkomen.
   2. Bereid 2,5 pg / ml 5-chloromethylfluorescein diacetaat (CMFDA) oplossing in serumvrij M199: MCDB105 medium. Resuspendeer kanker sferoïden in 1 ml CMFDA oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Centrifugeer bij 750 xg gedurende 5 minuten.
   3. Spoel de kanker sferoïden met 2 ml serumvrij medium en centrifugeer bij 750 xg gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap tweemaal de resterende fluorescerende kleurstof uit het medium te verwijderen.
      OPMERKING: De fluorescentiesignaal kan sferoïden worden gehandhaafd gedurende meer dan 96 uur.
   4. Resuspendeer de kankersferoïden in serumvrij M199: MCDB105 medium en tel het aantal sferoïde met een hemocytometer. Stel de concentratie sferoïden 2000 / mL serumvrij medium.
   5. Vóór het laden sferoïde injecteer langzaam 100 ui serumvrij M199: MCDB105 medium van de niet-gehecht mesotheelcellen wegspoelen in de kanalen.
      LET OP: Een snelle injectie, aspiratie, of de vorming bel zal leiden tot het detachement van de mesotheelcellen monolaag.
   6. Belasting 30 pi van fluorescent-gelabelde sferoïde suspensie in elk kanaal. Plaats de microfluïdische chip in de CO ₂ incubator.
3. Perfusie platform montage en co-cultuur
   1. Bevestig een injectiespuit geladen met verse, serumvrij M199: MCDB105 medium om een ​​1 meter lange buis.
   2. Plaats de spuit op de spuitpomp en zet de zuiger en het lichaam van de spuit. Installeer de spuitpomp horizontaal op dezelfde hoogte als de microfluïdische chip in de incubator.
      NOTE: Het aantal en de grootte van spuiten afhankelijk van het aantal gebruikte kanalen en de duur van het experiment.
   3. Snel trekken de hele buis met medium door te drukken en de fast forward knop ingedrukt te houden totdat het medium overloopt de slang.
   4. Voer de injectie op de gewenste stroomsnelheid. Schat de wandschuifspanning met behulp van de volgende vergelijking:
      
      waarbij τ vertegenwoordigt de wandschuifspanning binnen de kamer, ǫ = debiet, μ = viscositeit (0,01 g cm ^-1); h = hoogte stromingskamer en w = breedte stromingskamer.
   5. Sluit de slang aan de inlaat van het kanaal. Plaats de overmaat inlaatslang in de incubator zodat het medium wordt opgewarmd voordat geïnjecteerd in de kanalen. Om de verbinding tussen de buis en het kanaal te vergemakkelijken, kunnen passende connectoren worden gekozen. LET OP: Pas op elke bubble niet te laten kennismaken met de syringe, slangen en aansluitingen.
   6. Sluit de uitgang van het kanaal een 50-ml conische buis om de uitstroom medium met een korte uitgang reageerbuis te verzamelen.
      NB: De volledige dynamische co-kweeksysteem wordt getoond in figuur 1D.

4. Waarneming van HPMCs en kanker sferoïden na perfusie

1. Let op de HPMCs en kanker sferoïden met een heldere-veld of fluorescentie microscoop en foto's te nemen na 1 uur van de perfusie.

Resultaten

Met behulp van dit protocol werd een microfluïdische platform opgezet om eierstokkanker sferoïden met mesotheelcelsuppletie onder hydrodynamische omstandigheden te modelleren. Primaire humane peritoneale mesotheelcellen werden gekweekt in de micro-inrichting voor 16 uur en bekeken onder een helder-veld microscoop. Zoals getoond in Figuur 2A, is het kanaal onderste succes bedekt met een monolaag van HPMCs. Het is belangrijk dat belvorming tijdens fibronectine of HPMC patr...

Discussie

Deze test heeft een flexibele en fysiologisch relevante model met verschillende biochemische en op cellen gebaseerde assays, zoals kan worden opgenomen, maar niet beperkt tot, adhesie testen mesotheelcellen klaring assays en drug discovery. Het kan worden toegepast op de evaluatie van het effect van intraperitoneale micromilieu op progressie van kanker. Echter nodig verschillende proefomstandigheden worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de doelen van het project (bijvoorbeeld het aantal HPMCs en kanker sferoï...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Silicon wafer	University wafer	#1196	100 mm
SU-8 2075 photoresist	Microchem
SU-8 developer	Microchem	108-65-6
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma	448931
Sylgard 184	Dow Corning	1673921	Polydimethylsiloxaan (PDMS) + uithardingsmiddel kit
Biopsy punch	Miltex	33-31AA	1 mm diameter
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
Polyethyleen buis	SCI	BB31695-PE/5	0.86 mm (binnendiameter)
Spuit	Terumo
Spuitpomp	Longer precision pump	LSP01-2A
Medium 199	Invitrogen	31100-035	Voeg 2,2 g/L natriumbicarbonaat toe
MCDB 105 Medium	Sigma	M6395
Fetaal bovien serum (FBS)	Hyclone	SH30068.02
Penicilline/streptomycine	Invitrogen	15070-063
Trypsine EDTA oplossing	Gibco	25300-054	0,05% Trypsine - 0,01% EDTA, fenol rood
Fibronectine menselijk	BD	354008
Agarose	Invitrogen	15510-027
5-chloromethylfluoresceine diacetaat	Life technologies	C7025	Groen CMFDA
CO2 incubator	SANYO	MCO-18AIC
Centrifuge	Hitachi	CT15RE
Fluorescentiemicroscoop	Nikon		Model: 80i of ECLIPSE Ti; software: SPOT
SKOV-3			Gift van Dr. N Auersperg (University of British Columbia)