Methodenartikel

Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

10.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55341

⸱

5 mei 2017

 ,  ,  , 
1Physiology, Michigan State University, 2Center for Neurodegenerative Science Van Andel Institute, 3Pharmaceutical Sciences, Wayne State University

In dit artikel

Samenvatting

Een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsellysaat onder toepassing van een amino-reactieve eiwit-crosslinker gekoppeld aan een nieuw tweedimensionaal polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) systeem wordt gepresenteerd.

Samenvatting

Er zijn veel goed ontwikkelde methoden voor het zuiveren en bestuderen van enkele eiwitten en peptiden. Echter, de meeste cellulaire functies worden uitgevoerd door netwerken van interactie-eiwitcomplexen, die vaak moeilijk te onderzoeken zijn, omdat hun binding niet-covalent is en gemakkelijk verstoord wordt door zuiveringstechnieken. Dit werk beschrijft een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsel door gebruik te maken van tweedimensionale polyacrylamide gelelektroforese. Weefsellysaat wordt geladen op een niet-denaturerende blue-native polyacrylamidegel, dan wordt een elektrische stroom aangebracht totdat het eiwit een korte afstand in de gel migreert. De gelstrook die het gemigreerde eiwit bevat, wordt dan uitgesneden en geïncubeerd met het amine-reactieve verknopingsreagensdithiobis (succinimidylpropionaat) dat eiwitcomplexen covalent stabiliseert. De gelstrook die verknoopte complexen bevat, wordt dan gegoten in een natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegel en tHij complexen zijn volledig gescheiden. De methode is gebaseerd op technieken en materialen bekend bij de meeste moleculaire biologen, wat betekent dat het is goedkoop en makkelijk te leren. Terwijl het is beperkt in haar vermogen om adequaat te scheiden extreem grote complexen, en is nog niet universeel succesvol geweest, de methode was in staat om een ​​breed scala van goed bestudeerde complexen vast te leggen, en is waarschijnlijk van toepassing op veel systemen van belang.

Inleiding

Normale cellulaire functie is afhankelijk eiwit-eiwitinteracties 1, 2. Daardoor worden menselijke ziekten vaak gekenmerkt door verstoringen in de assemblage en het gedrag van verschillende eiwitcomplexen 3. Het vermogen om dergelijke interacties te karakteriseren is daarom cruciaal. Gangbaar detecteren van deze interactie vereist zuivering van doeleiwitten, vaak gevolgd door pull-down hun interactie partners. Klassieke zuiveringstechniek wordt bereikt door differentiële centrifugatie, precipitatie en / of chromatografie 4. Deze werkwijzen zijn tijdrovend, moeten zij gedurende elk doelwiteiwit, vaak leiden tot lage opbrengsten. Moderne zuiveringsmethoden omvatten de fusie van peptidelabels om eiwitten te richten, gevolgd door immuunprecipitatie of extractie op kolommen beladen met kralen gebonden aan een vangmolecuul 5,"> 6. Hoewel dit rekbaar veel eiwitten, vereist sequentie modificatie van het doel, wat mogelijk tot constructies die verschillen in affiniteit voor hun gebruikelijke bindingspartners. De gevoelige aard van bepaalde eiwit-eiwit interacties betekent deze werkwijze niet van toepassing is te veel scenario's. Daarnaast is de pull-down assays gebruikt om in kaart eiwit-eiwit interacties kunnen geen nauwkeurige cellulaire beeld vast te leggen, als gevolg van beperkte mate van vrijheid en non-native niveaus van het aas eiwit.

Idealiter zou eiwitcomplexen worden gedetecteerd in hun eigen staten, zonder de noodzaak van zuivering of pull-down. Blauw natieve polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) werd ontwikkeld als een minder denaturerende alternatief natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en maakt de scheiding van sommige eiwitten en complexen uit biologische monsters 7. Echter, eiwitten in BN-pagina's te scheiden op basis van een LARge aantal variabelen, zoals grootte, lading, driedimensionale structuur, en samen met andere moleculen. De interactie van deze factoren leiden vaak tot co-scheiding van eiwitten, aggregaatvorming en slechte eiwitband resolutie. Tweedimensionale native-polyacrylamidegelelektroforese lost sommige, maar niet alle, van deze problemen 8.

Om de complicaties van natief scheiding omzeilen sommige auteurs amine-reactieve verknopingsmiddelen, zoals dithiobis (succinimidylpropionaat) (DSP), om eiwitcomplexen te vangen in weefsellysaten 4. Deze behandelde lysaten kunnen vervolgens worden gedenatureerd en gescheiden door SDS-PAGE, met behoud van de oorspronkelijke afmeting en samenstelling van eiwitcomplexen. Aangezien verknoping reagentia reageren op basis van de nabijheid van één molecuul naar een ander, en eiwitten in weefsellysaten veel vrijheidsgraden en kan communiceren stochastisch niet-specifieke achtergrond kruis-linking kan hoog zijn, vooral in geconcentreerde monsters. Dit kan leiden tot moeilijk te interpreteren resultaten.

Hier tonen we het gebruik van een hybride BN-PAGE / SDS-PAGE-werkwijze, aangeduid als multimeer-polyacrylamidegelelektroforese (multimeer-PAGE), te scheiden en te detecteren eiwit samenstellingen in complexe mengsels. Aanvankelijk wordt cellysaat gesuspendeerd in polyacrylamidegel via BN-PAGE. Het lysaat bevattende gel wordt vervolgens met de verknopingsreagens DSP. Pseudo-geïmmobiliseerde en enigszins gescheiden op gel, eiwitten veel minder kans op niet-specifieke wijze reageren, waardoor achtergrond verknopingsmiddel reactiviteit wordt verminderd. Na verknoping wordt het gel banden uitgesneden en gescheiden via SDS-PAGE. De verkregen gel kan vervolgens worden geanalyseerd met alle middelen die gewoonlijk met polyacrylamidegelelektroforese. Deze werkwijze maakt de scheiding en detectie van eiwitcomplexen in ongemodificeerde weefsel lysaat zonder de noodzaak van extra zuivering of pull-down.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Weefselbereiding

  1. Bereid 10 ml 4x BN-PAGE monsterbuffer (200 mM Bis (2-hydroxyethyl) amino-tris (hydroxymethyl) methaan (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w / v glycerol, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ).
    LET OP: Deze voorraad oplossing kan vooraf worden gemaakt en opgeslagen bij 4 ° C.
  2. Verdunnen 250 ul van 4x monsterbuffer in 750 pi dH 2 O uit 1x commerciële proteaseremmercocktail. Vortex en te rusten op ijs.
  3. Homogeniseer 20 mg doelweefsel in 1 ml 1x ijskoude BN-PAGE monsterbuffer met 30 slagen van een clean homogeniseerinrichting.
    LET OP: Voor deze demonstratie experiment, het doelweefsel is geheel rat hersenweefsel. Na homogenisatie kan het monster worden behandeld met een mild detergens zoals 2% digitonine voor het solubiliseren en maken elektroforese van membraaneiwitten.
  4. Breng de homogenaat om een ​​microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 30 min om onoplosbaar celinhoud pelleteren. afteR centrifugeren, dek de supernatant in een schone buis op ijs.
  5. Volg de instructies van de fabrikant om de concentratie van supernatant eiwitten te meten met behulp van bicinchoninezuur (BCA) of soortgelijke eiwitquantificatietest.
  6. Als het homogenaatmonster (s) een detergent bevat, voeg een hoeveelheid van 5% Coomassie Blue G-250 in een waterige oplossing toe om de homogenaatoplossing op 0,25% Coomassie te brengen.

2. BN-PAGE

  1. Verdun 25 ml 20x blauwe inheemse (BN) elektroforese buffer voorraad (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M tricine, pH 6,8) in 475 ml dH20 met 0,002% Coomassie Blue om 500 ml 1x loopbuffer te maken.
    1. Als monsters detergent bevatten, maak dan in plaats daarvan 250 ml 1x rennende buffer met 0,02% Coomassie en nog eens 250 ml die geen bevatten.
  2. Chill buffer (s) tot 4 ° C.
  3. Maak een polyacrylamide gelgietcassette schoon en monteer volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Pour BN polyacrylamide gel (3% T stapellaag, 6% T oplossen layer) volgens een standaard recept 7, en plaatst de put kam.
  5. Nadat de gels gepolymeriseerd, spoel de cassette met dH 2 O en monteer de electroforese-inrichting volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Verwijder de put kam en vul de putjes met 1x BN-PAGE running buffer. Voorkomen vullen het gehele binnenkamer met buffer tot monsters worden geladen.
    1. Indien monsters bevatten detergens, vul de putjes met de buffer met 0,02% Coomassie Blue.
      OPMERKING: Voer de stappen 2,7-2,9 bij 4 ° C.
  7. Via gel-lading-punten, Pipetteer volume homogenaat met 20 ug van eiwit in de gewenste putjes. Pipet een gelijkwaardige hoeveelheid 1x BN-PAGE monsterbuffer in ongebruikte wells.
    OPMERKING: Gebruik de eiwitconcentratie bepaald door de BCA assay om het geschikte volume homogenaat berekenen toevoegende putten.
  8. Nadat monsters zijn geladen, vult de inwendige kamer met 1x BN-PAGE running buffer. Zorg ervoor dat de gel volledig ondergedompeld in buffer. Vervolgens vult de buitenkamer met 1 x loopbuffer met de door de fabrikant aangegeven niveau.
    1. Indien monsters bevatten detergens, vult de inwendige kamer met 1 x buffer die 0,02% Coomassie blauw en de buitenkamer met kleurstofvrije 1 x loopbuffer.
  9. Verbinden de elektroden met de spanningsbron en Electrophorese de eiwitten in de gel bij 150 V totdat de kleurstof band vordert ~ 2 cm in de oplossing laag. Stop en stekker uit het stopcontact.

3. Cross-linking

OPMERKING: Voer de stappen 3,1-3,6 bij 4 ° C.

  1. Demonteer de electroforese-inrichting, en scheiden de ruiten van de gelcassette. Verwijder de stapellaag.
  2. Knip de gel net onder de onderrand van de kleurstof voorkant. Nemenzorg bij het knippen zo glad en recht mogelijk te maken, en gooi de ongebruikte stukje gel. Dit laat een ~ 2 cm breed, horizontale strook polyacrylamidegel, die alle het eiwit in het homogenaat monster bevat.
  3. Knip ongebruikte gedeelten langs de randen van de gel strip.
  4. Plaats voorzichtig de strook in 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een kleine houder en meng door nutatie gedurende 30 minuten equilibreren.
  5. Na equilibratie weggooien en vervangen PBS met nog eens 10 ml. Pipetteer 500 ul van 25 mM DSP opgelost in dimethylsulfoxide in PBS en verder mengen zoals hierboven beschreven (stap 3.4) gedurende 30 minuten.
  6. Giet het DSP oplossing. Voeg 10 ml 0,375 M tris (hydroxymethyl) aminomethaan hydrochloride (Tris-HCl), pH 8,8, die 2% natriumdodecylsulfaat (SDS) niet-omgezet DSP blussen. Nutatie verder gedurende 15 min.

4. SDS-PAGE

  1. Terwijl gel strip afschrikken bereiden SDS-PAGE gel oplossingen volgens standaardwerkwijzen 9. Niet polymerisatie reagentia toe te voegen.
  2. Na blussen ingevuld, ΒΝ gelstrip tot kamertemperatuur en gegoten de strook in een nieuwe gelcassette.
    1. Hiertoe voorzichtig pak de gel en plaats het op een schoon gelcassette afstandsplaat.
    2. Oriënteren de strip zodat de onderkant van de kleurstof voor het dichtst bij de bovenkant van de nieuwe cassette (dat wil zeggen, de zijde die het verst bezocht gedurende BN-PAGE moeten dichtst bij de bovenkant van de nieuwe cassette, de gel strip wordt gedraaid vanuit de stand oriëntatie). Zie figuur 3.
    3. Plaats de strip zodanig dat de bovenrand ligt zelfs wanneer de bovenkant van de afdekplaat wordt (dat wil zeggen, zal het aan de bovenkant van de nieuwe gel). Controleer de kleurstoffront evenwijdig aan de horizontale randen van de glasplaat.
    4. Druk op een kant van de uitgesneden strook tegen één van de scheidingswanden, waardoor er ruimte op tHij andere kant voor gel wordt gegoten en een eiwitstandaard of ladder te laden.
    5. Indien de onderrand van de gel strip bevat elke gekartelde of oneffenheden, mooigesneden ze weg. Indien aanwezig, zullen zij houden microbellen gel gieten.
    6. Zodra de gel strip correct gepositioneerd, lag de afdekplaat boven de tussenplaat. Druk zachtjes te duwen eventuele luchtbellen.
    7. Blijf de gel-gieten inrichting samenstellen volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Voeg polymerisatie reagentia om het oplossend gel buffer en giet het in de voorbereide gelcassette hand van een serologische pipet. Vul het gel cassette ~ 2 cm onder de uitgesneden BN-PAGE gel strip, om ruimte voor het stapelen laag verlaten.
  4. Voeg 100 pl butanol over de bovenkant van de gegoten gel en laat 30 minuten voor polymerisatie van het oplossend laag. Giet het butanol.
  5. Voeg polymerisatie reagentia om de stacking gel oplossing. Met behulp van een serological pipet, giet de stapellaag alle overblijvende lege ruimte in de gelcassette vullen.
    1. Tilt de gelcassette de stapellaag gegoten zodat de ruimte onder de gel strip vult en luchtbellen niet gevangen.
    2. De stacking gel buffer de lege ruimte onder de gel strip vult geleidelijk weer de gelcassette naar niveau voet.
    3. Blijf de lege ruimte bijna overlopen vullen naast het uitgesneden gel strip met de stacking gel buffer, totdat het.
  6. Laat de stapellaag polymeriseren gedurende 30 min.
    OPMERKING: 10x SDS-PAGE running buffer (250 mM tris (hydroxymethyl) aminomethaan (tris), 1,9 M glycine, 1% SDS), terwijl de gel polymeriseren. Dit kan ook vooraf worden gemaakt en bewaard bij kamertemperatuur.
  7. Verdun 50 ml 10X SDS-PAGE running buffer bouillon in 450 ml dH 2 O tot 1 x buffer te werken.
  8. Na het stapelen laag gepolymeriseerd, verwijder de gel cassette uit de stromendeInrichting afspoelen met dH 2 O en monteer de electroforese-inrichting volgens de instructies van de fabrikant.
  9. Vul de binnenkamer geheel met 1 x SDS-PAGE running buffer en vult de buitenkamer met de door de fabrikant aangegeven niveau.
  10. Laad de ruimte naast het uitgesneden gel strip met een molecuulgewicht ladder of geschikt eiwitstandaard.
  11. Bevestig de elektroden met de spanningsbron en Electrophorese de monsters bij 120 V. Als de kleurstof Coomassie de gel wegvloeit, stoppen en de stroomtoevoer.
  12. Analyseer de gel onder toepassing van standaard werkwijzen van elektroblotten en proteïnedetectie door antilichaambinding 10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit demonstratie-experiment werd multimer-PAGE uitgevoerd op gehele rat hersenlysaat. De resulterende gescheiden eiwitten werden op polyvinylideendiflouride (PVDF) membranen geblazen en vervolgens getest met antilichamen tegen eiwitten die bekend zijn om complexen te vormen. Figuur 1 toont een validatie van het protocol op twee manieren. Ten eerste tonen wij aan dat de verknoopte eiwitten splitsbaar zijn door toevoeging van een reductiemiddel, wat betekent dat de waar...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Eiwit-eiwit interacties zijn belangrijk voor elke taak levende dingen uit te voeren. Vanwege dit, ze zijn het onderwerp van intensief onderzoek en onderzoek. Multimeer-PAGE is een nieuwe werkwijze voor het vastleggen, scheiden en analyseren van een breed scala van eiwitcomplexen. We hebben eerder aangetoond dat de toepasselijkheid ervan op het bestuderen van oligimerization van de ziekte-geassocieerde eiwit α-synucleïne 11. Het is echter uitbreidbaar vele eiwitcomplexen, zoals aangetoond in

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Ondersteund door de NIH / NIDA DA034783. Wij danken Bryan A. Killinger voor technische bijstand met het multimeer-PAGE.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chemicals
ε-AminokapronzuurSigmaA2504
AcrylamidAcros Organics164855000Giftig.
Acrylamid/bisacrylamid 37,5:1 (40%T stockoplossing)BioRad161-0148Giftig.
AmmoniumpersulfaatSigmaA3678
Anti konijn IgG-HRP van geitSanta Cruz Biotechnologysc-2004
Bicinchoninezuur testkitThermofisher23225
Bis-trisSigmaB9754
Rund serum albumineSigmaA9647
ButanolFisher ScientificA399-1
Chemiluminescentie substraatkitThermoFisher24078
Coomassie blauw G-250Sigma-AldrichB0770
DigitonineSigmaD141Giftig.
Dimethyl sulfaatFisher ScientificD128-1
Dithiobis(succinimidepropionate)Thermo Scientific22585
Droog vetvrij melkpoederLabScientificM0841
GlycerolSigmaG9012
GlycineFisher ScientificBP381-5
Halt Protease Inhibitor CocktailThermofisher78430
ZoutzuurFisher ScientificA144SI-212Voor titratie. Corrosief.
MethanolFisher ScientificA412-4Voor PVDF membraan activering. Giftig.
Monoklonaal anti α-synuclein IgG van konijnSanta Cruz Biotechnologysc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethyletheenidiamineSigmaT9281
N,N'-methyleenbisacrylamideAcros Organics16479Giftig.
NP40Boston BioproductsP-872
Polysorbaat 20 (tween-20)Fisher ScientificBP337-500
Polyvinylideenfluoride transfermembranenThermo Scientific88518
Ponceau SSigmaP3504
KaliumchlorideFisher ScientificP217-3
Kaliumfosfaat monobasischSigmaP9791
Protease inhibitor cocktailThermo Scientific88265
SDS oplossing (10% w/v)BioRad161-0416
NatriumchlorideFisher ScientificBP358-212
NatriumdodecylsulfaatSigmaL37771
Natriumfosfaat monobasischFisher ScientificBP329-1
TricineSigmaT0377
Tris baseFisher ScientificBP152-500
Tris-HCl (0,5 M buffer, pH 6,8)BioRad161-0799
Tris-HCl (1,5 M buffer, pH 8,8)BioRad161-0798
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Instrumenten
GE Imagequant LAS 4000GE Healthcare28-9558-10
ImageJ softwareNIH
Synergy H1 microplate readerBioTek
Gel Former + StandBiorad
Microfuge 22R centrifugeBeckman Coulter
2 mL dounce homogenisator
Vortex mixerFisher Scientific
Ultrasoon weefsel homogenisatorFisher ScientificFB120220

Referenties

  1. Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
  2. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  3. Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
  4. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
  5. Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
  6. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
  7. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  8. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  10. Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
  11. Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
  12. Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314(2013).
  13. Wong, S. S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
  14. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  15. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
  16. Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
  17. Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
  18. Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
  19. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Analyse van prote necomplexenNative PAGEin gel crosslinkingSDS PAGE scheidingBlue Native gelgel hergietenDSP crosslinkerpreparatie van weefsellysatenimmunoblot detectiemoleculaire gewichtsmarker

Gerelateerde artikelen