Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

Summary

Een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsellysaat onder toepassing van een amino-reactieve eiwit-crosslinker gekoppeld aan een nieuw tweedimensionaal polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) systeem wordt gepresenteerd.

Abstract

Er zijn veel goed ontwikkelde methoden voor het zuiveren en bestuderen van enkele eiwitten en peptiden. Echter, de meeste cellulaire functies worden uitgevoerd door netwerken van interactie-eiwitcomplexen, die vaak moeilijk te onderzoeken zijn, omdat hun binding niet-covalent is en gemakkelijk verstoord wordt door zuiveringstechnieken. Dit werk beschrijft een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsel door gebruik te maken van tweedimensionale polyacrylamide gelelektroforese. Weefsellysaat wordt geladen op een niet-denaturerende blue-native polyacrylamidegel, dan wordt een elektrische stroom aangebracht totdat het eiwit een korte afstand in de gel migreert. De gelstrook die het gemigreerde eiwit bevat, wordt dan uitgesneden en geïncubeerd met het amine-reactieve verknopingsreagensdithiobis (succinimidylpropionaat) dat eiwitcomplexen covalent stabiliseert. De gelstrook die verknoopte complexen bevat, wordt dan gegoten in een natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegel en tHij complexen zijn volledig gescheiden. De methode is gebaseerd op technieken en materialen bekend bij de meeste moleculaire biologen, wat betekent dat het is goedkoop en makkelijk te leren. Terwijl het is beperkt in haar vermogen om adequaat te scheiden extreem grote complexen, en is nog niet universeel succesvol geweest, de methode was in staat om een ​​breed scala van goed bestudeerde complexen vast te leggen, en is waarschijnlijk van toepassing op veel systemen van belang.

Introduction

Normale cellulaire functie is afhankelijk eiwit-eiwitinteracties ^{1, 2.} Daardoor worden menselijke ziekten vaak gekenmerkt door verstoringen in de assemblage en het gedrag van verschillende eiwitcomplexen ^3. Het vermogen om dergelijke interacties te karakteriseren is daarom cruciaal. Gangbaar detecteren van deze interactie vereist zuivering van doeleiwitten, vaak gevolgd door pull-down hun interactie partners. Klassieke zuiveringstechniek wordt bereikt door differentiële centrifugatie, precipitatie en / of chromatografie ^4. Deze werkwijzen zijn tijdrovend, ....

Protocol

1. Weefselbereiding

1. Bereid 10 ml 4x BN-PAGE monsterbuffer (200 mM Bis (2-hydroxyethyl) amino-tris (hydroxymethyl) methaan (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w / v glycerol, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ).
   LET OP: Deze voorraad oplossing kan vooraf worden gemaakt en opgeslagen bij 4 ° C.
2. Verdunnen 250 ul van 4x monsterbuffer in 750 pi dH ₂ O uit 1x commerciële proteaseremmercocktail. Vortex en te rusten op ijs.
3. Homogeniseer 20 mg doelweefsel in 1 ml 1x ijskoude BN-PAGE monsterbuffer met 30 slagen van een clean homogeniseerinrichting.
   LET OP: Voor deze demonstratie experiment, het doelweefsel is geheel rat hersenweefsel. Na....

Results

In dit demonstratie-experiment werd multimer-PAGE uitgevoerd op gehele rat hersenlysaat. De resulterende gescheiden eiwitten werden op polyvinylideendiflouride (PVDF) membranen geblazen en vervolgens getest met antilichamen tegen eiwitten die bekend zijn om complexen te vormen. Figuur 1 toont een validatie van het protocol op twee manieren. Ten eerste tonen wij aan dat de verknoopte eiwitten splitsbaar zijn door toevoeging van een reductiemiddel, wat betekent dat de waar.......

Discussion

Eiwit-eiwit interacties zijn belangrijk voor elke taak levende dingen uit te voeren. Vanwege dit, ze zijn het onderwerp van intensief onderzoek en onderzoek. Multimeer-PAGE is een nieuwe werkwijze voor het vastleggen, scheiden en analyseren van een breed scala van eiwitcomplexen. We hebben eerder aangetoond dat de toepasselijkheid ervan op het bestuderen van oligimerization van de ziekte-geassocieerde eiwit α-synucleïne ^11. Het is echter uitbreidbaar vele eiwitcomplexen, zoals aangetoond in

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
ε-Aminocaproic acid	Sigma	A2504
Acrylamide	Acros Organics	164855000	Toxic.
Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)	BioRad	161-0148	Toxic.
Ammonium persulfate	Sigma	A3678
Anti rabbit IgG-HRP from goat	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Bicinchoninic acid assay kit	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Bovine serum albumin	Sigma	A9647
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Chemiluminescence substrate kit	ThermoFisher	24078
Coomassie blue G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toxic.
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate)	Thermo Scientific	22585
Dry nonfat milk	LabScientific	M0841
Glycerol	Sigma	G9012
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Halt Protease Inhibitor Cocktail	Thermofisher	78430
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144SI-212	For titration. Caustic.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4	For PVDF membrane activation. Toxic.
Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
N,N'-methylenebisacrylamide	Acros Organics	16479	Toxic.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbate 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Polyvinylidene fluoride transfer membranes	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-3
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P9791
Protease inhibitor cocktail	Thermo Scientific	88265
SDS solution (10% w/v)	BioRad	161-0416
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	L37771
Sodium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)	BioRad	161-0798
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJ software	NIH
Synergy H1 microplate reader	BioTek
Gel Former + Stand	Biorad
Microfuge 22R centrifuge	Beckman Coulter
2 mL dounce homogenizer
Vortex mixer	Fisher Scientific
Ultrasonic tissue homogenizer	Fisher Scientific	FB120220