Vele biologische structuren ontbreken gemakkelijk definieerbare bezienswaardigheden, waardoor het moeilijk is om de moderne morfometrische methoden toe te passen. Hier tonen we methoden om de muis baculum (een bot in de penis), waaronder dissectie en microCT scannen, gevolgd door computationele werkwijzen semi-monumenten die worden gebruikt om de grootte en vorm kwantificeren variatie definiëren bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dissection, MicroCT Scanning en Morfometrische Analyses van de Baculum
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Modern morfometrie biedt krachtige methoden om de grootte en vorm variatie kwantificeren. Een eerste vereiste is een lijst van coördinaten die mijlpalen te definiëren; maar dergelijke coördinaten moeten homologe structuren vertegenwoordigen in specimens. Hoewel veel biologische objecten bestaan uit gemakkelijk te herkennen oriëntatiepunten tot de veronderstelling van homologie te voldoen, veel ontberen dergelijke structuren. Een mogelijke oplossing is om plaats semi-oriëntatiepunten mathematisch op een object dat dezelfde morfologische regio over exemplaren vertegenwoordigen. Hier illustreren we een recent ontwikkelde pijpleiding naar semi-oriëntatiepunten van de muis baculum (penis bot) mathematisch te definiëren. De methoden van toepassing worden op uiteenlopende voorwerpen.
Inleiding
Het gebied van morfometrie bevat diverse methoden om de grootte en vorm van de biologische vorm, een fundamentele stap in wetenschappelijk onderzoek 1, 2, 3, 4, 5, 6 kwantificeren. Traditioneel is de statistische analyse van de grootte en vorm begint door het identificeren oriëntatiepunten op een biologische structuur, en vervolgens meten van lineaire afstanden, hoeken en verhoudingen, die in een multivariate kader kunnen worden geanalyseerd. -Landmark gebaseerde Geometric Morfologie is een aanpak die de ruimtelijke positie van monumenten behouden, behoud van geometrische gegevens uit het verzamelen van gegevens door middel van analyse en visualisatie 5. Gegeneraliseerde Procrustes Analyse (GPA) kan worden toegepast om de variatie in de locatie, omvang, en de rotatie van bezienswaardigheden verwijderen om een afstemming tussen specimens dat m producereninimizes hun kwadraat verschillen - wat overblijft is vorm verschil 7.
Een belangrijk concept van elke morfometrische analyse homologie, of het idee dat men een betrouwbare oriëntatiepunten die biologisch zinvolle en discrete functies die overeenkomen tussen exemplaren of structuren kunnen identificeren. Bijvoorbeeld, menselijke schedels hebben homologe processen foramina, hechtingen, en leidingen die kunnen toelaten morfometrische analyses. Helaas, de identificatie van overeenkomstige plekken die moeilijk in veel biologische structuren, vooral die met gladde oppervlakken of bochten 8, 9, 10.
We benaderen dit probleem hieronder met behulp van computationele geometrie. De algemene werkstroom is een driedimensionale scan van het object dat kan worden voorgesteld als een puntenwolk genereren en draai transformeren dat puntenwolk zodat alle specimens zijn gericht op een gemeenschappelijk coördinatensysteem. Toen we mathematisch definiëren semi-oriëntatiepunten van specifieke regio's van het object. Discrete semi-oriëntatiepunten geplaatst op deze regio's zijn biologisch arbitrair 11. Het uitvoeren van GPA en de daaropvolgende statistische analyses kan ongewenste artefacten produceren 8, 12 omdat willekeurig geplaatst oriëntatiepunten niet biologisch homoloog kan zijn. Daarom laten we deze semi-oriëntatiepunten om mathematisch "slide". Deze procedure minimaliseert het potentiaalverschil tussen de structuren. Zoals elders voerden de schuivende algoritme hier gebruikt dient soortgelijke anatomische gebieden die niet gemakkelijk te kwantificeren die overeenkomt oriëntatiepunten 3, 6, 8, 10, 11, 12. Deze methoden hebben hun limitations 13, maar moet worden aangepast aan voorwerpen van verschillende grootte en vorm.
Hier tonen we hoe deze methode in een recente studie van de muis baculum 14 werd toegepast, een bot in de penis die is opgedaan en meerdere onafhankelijke keren verloren tijdens de evolutie van zoogdieren 15. We bespreken de dissectie en de voorbereiding van een specifiek bot, de baculum (Protocol 1), het genereren van microCT beelden (Protocol 2), en de omzetting van deze beelden naar een formaat dat alle downstream computationele geometrie maakt (Protocollen 3 en 4). Na deze stappen, wordt elk monster vertegenwoordigd door ~ 100K xyz-coördinaten. We dan lopen door een reeks van veranderingen die effectief alle exemplaren in een gemeenschappelijke oriëntatie (Protocol 5) af te stemmen, hier semi-oriëntatiepunten van uitgelijnde exemplaren (Protocol 6). Protocollen 1-4 moet ongeacht het object dat wordt onderzocht gelijk zijn. Protocol 5 en 6 Protocol zijn specifiek ontworpen voor een baculum, maar het is onze hoop dat door detaillering deze stappen, kunnen de onderzoekers voorstellen wijzigingen die relevant zijn voor hun doel van belang zou zijn. Zo werden modificaties van deze methoden toegepast op walvissen bekken en ribben 16 te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures en personeel werd goedgekeurd door de University of Southern California Institute for Animal Care en gebruik Comite (IACUC), protocol # 11394.
1. Baculum Dissection en voorbereiding
- Euthanaseren een geslachtsrijpe mannelijke muis via koolstofdioxide overmatige blootstelling, volgens de protocollen uiteengezet door de relevante Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
- Leg het dier in rugligging, en rekken de penis door het toepassen van druk met de duimen lateraal van de preputiale opening.
- Zodra de penis is langdurig, uitbreiding van het weefsel door de voorhuid zoveel mogelijk.
- Met een schaar, knip de penis lichaam proximaal van de eikel waar de baculum woont.
- Breng de ontleed penis naar een 1,7 ml buis en voeg 200 pi water uit de kraan. Zorg ervoor dat de penis volledig is ondergedompeld in de vloeistof.
- Incubeer het weefsel in water bij -50 ° C gedurende 3-5 dagen.
- Na een goede incubatie, verwijder het omringende weefsel uit de baculum, met behulp van pincet onder een dissectie microscoop. Voorzichtig spuiten 70% ethanol af te duwen resterende weefsel en het reinigen van de bot.
- Plaats de ontleed baculum in een nieuwe microcentrifugebuis met de kap open. Verlof kap open O / N te drogen bot.
2. MicroCT Scannen
- Druk op een microCT scan cilindrische houder in een baksteen van bloemist schuim om een cilinder van bloemist schuim te creëren.
- Pak de cilinder van de bloemist schuim en snijd plakjes ~ 2-5 cm dik.
- Druk gedroogd bacula in de oasis, rond de omtrek van een segment om interferentie te minimaliseren tijdens het scannen. De precieze oriëntatie van de botten moet worden opgemerkt, waardoor een goede identificatie van individuele exemplaren in Protocol 4.
- Plaats voorzichtig het schijfje met de embedded botten in de microCT houder.
- Acquire microCT scans. Bij muis Bacula 14 , Gebruikten we een uCT50 scanner (Scanco Medical AG, Bruttisellen, Zwitserland) bij het USC Molecular Imaging Center in het kader van de volgende instellingen: 90 kVp, 155 uA, 0,5 mm Al filter, 750 projecties per 180 (360 dekking), belichtingstijd van 500 ms, en voxel grootte van 15,5 mm.
3. MicroCT Processing: Het omzetten van een .DCM Stack voor een interne .xyz File
OPMERKING: Elke microCT scan levert een stapel .DCM, of 'DICOM', bestanden die het plakken genomen door het object te vertegenwoordigen. Alle stroomafwaartse computationele geometrie vereist vlakke .xyz bestanden, die eenvoudig een tekstbestand vier kolommen bevat - de x, y en z coördinaten van elke pixel en de intensiteit van de pixel, van -5000 (zwart) tot 5000 (wit). Een pixel drempel 3000 het algemeen goed functioneert als een drempelwaarde voor het definiëren botten.
- Installeer Python (www.python.org) en de PYTHON modules COMMANDS, DICOM, PYLAB, SYS, en numpy.
- Open "01_process_dicom.py "{} Figshare met elke tekstverwerker. Onder de sectie Variabelen, verandering pad, pixel drempels, en directory namen als dat nodig is.
- Run "python 01_process_dicom.py". De vooruitgang zal worden afgedrukt op het scherm. Binnen elke map met de naam in stap 3.2, wordt een nieuw bestand gemaakt met de naam; bijvoorbeeld directory_name.PT3000.xyz wanneer PT3000 geeft de pixel drempel die in stap 3,2.
4. MicroCT verwerking: segmenteren-out Individuele Specimen .xyz Files
- Installeer R (https://www.r-project.org/) met de bibliotheek RGL.
- Open het bestand '02_segment_dicoms.r' {} Figshare met elke tekstverwerker. Onder de sectie Variabelen, wijzigt de naam van het pad te wijzen op de .xyz bestand gemaakt in Protocol 3 hierboven.
- Vanuit R, voert u de opdracht 'source (' 02_segment_dicoms.r ') "(zonder de aanhalingstekens).
- Na de drie dimensionale afbeelding van de .xyz bestand gemaakt in Protocol 3 verschijnt, voert de number van specimens in de totale .xyz bestand. labelen dan en selecteer de punten van elk monster met behulp van de scroll en zoomfuncties.
LET OP: Op de achtergrond, aparte .xyz bestanden worden gemaakt voor elk specimen. Deze worden in een directory genaamd bijvoorbeeld XYZ_FILES_PT3000 wanneer PT3000 geeft de drempelwaarde voor pixels gebruikt.
5. "uitlijnen" Specimen .xyz bestanden naar Common Coördinaten.
- Open de Python-script "03_transform.py" {Figshare}, waarin de extra module mattdean_modules.py {Figshare}, evenals twee op zichzelf staande applicaties vereist: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) en "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) die worden gebruikt door dit script.
- Onder de sectie Variabelen, identificeren van de volledige namen pad naar mattdean_modules.py, rotate_path en qconvex_dir. Daarnaast identificeren het volledige pad naar de directory met de individuele .xyz bestanden die zijn gemaakt in stap 4.
- Run 03_transform.py, die een nieuw bestand per exemplaar met het achtervoegsel .TRANSFORMED.xyz creëert.
6. "Snijden" Aligned Specimen .xyz bestanden naar Semi-oriëntatiepunten te identificeren.
- Open en voer het Python-script "04_identify_landmarks.py" {Figshare}. In de sectie Variabelen identificeren volledige namen pad naar de map met de .TRANSFORMED.xyz bestanden. Dit script identificeert 802 semi-monumenten die kan worden gebruikt om de grootte en vorm van de structuur te kwantificeren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De xyz coördinaten van het semi-oriëntatiepunten geproduceerd in Protocol 6 kunnen direct worden geïmporteerd in any-monument op basis geometrische morfometrie analyse 17. De computationele pijplijn hierboven is toegepast voor muis- bacula 14, en walvissen bekken en ribben 16 bestuderen. Meer details over de rekenkundige bepaling van semi-plaatsen worden hier voorgesteld in een poging om onderzoekers visualiseren sta...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De kritische stappen in het bovenstaande protocol zijn: 1) het ontleden van de bacula, 2) het verzamelen van de microCT beelden, 3) het omzetten van de microCT uitvoer naar een plat bestand van xyz coördinaten, 4) het segmenteren uit elk monster's puntenwolk, 5) het transformeren van elk monster aan een gestandaardiseerd assenstelsel, en 6) die semi-oriëntatiepunten. Deze stappen worden gemakkelijk aangepast om verschillende objecten tegemoet.
Deze werkwijzen kunnen waarschijnlijk worden...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Tim Daley en Andrew Smith verstrekt veel nuttige computationele discussies tijdens de eerste dagen; Tim Daley schreef het programma rotate_translate_cylindrical die nodig zijn voor Protocol 5. Computational middelen werden door de High Performance Computing Cluster aan de Universiteit van Zuid-Californië. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie # GM098536 (MDD).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dissecting scissors | VWR | 470106-338 | De meeste maten zouden moeten werken |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved | VWR | 82027-406 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | Te verdunnen tot 70% voor dissecties |
| Floral Foam | Wholesale Floral | 6002-48-07 | |
| uCT50 scanner | Scanco Medical AG, Bruttisellen, Zwitserland |
Referenties
- Slice, D. E. Geometrics morphometrics. Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).
- Slice, D. E. Modern morphometrics in physical anthropology. 6, Springer. (2005).
- Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D. Geometric morphometrics for biologists: a primer. , 2nd, Elsevier. (2012).
- Bookstein, F. Morphometric tools for landmark data: geometry and biology. , Cambridge University Press. (1991).
- Rohlf, F. J., Marcus, L. F. A Revolution in Morphometrics. Trends. Ecol. Evol. 8 (4), 129-132 (1993).
- Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. Geometric morphometrics for biologists: a primer. , Elsevier. (2004).
- Rohlf, F. J., Slice, D. E. Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks. Syst. Zool. 39 (1), 40-59 (1990).
- Gunz, P., Mitteroecker, P. Semilandmarks: a method for quantifying curves and surfaces. Hystrix. 24 (1), 103-109 (2013).
- Gunz, P., Ramsier, M., Kuhrig, M., Hublin, J. J., Spoor, F. The mammalian bony labyrinth reconsidered, introducing a comprehensive geometric morphometric approach. J. Anat. 220 (6), 529-543 (2012).
- Mitteroecker, P., Gunz, P. Advances in geometric morphometrics. Evol. Biol. 36 (2), 235-247 (2009).
- Bookstein, F. J. Landmark methods for forms without landmarks: morphometrics of group differences in outline shape. Med. Im. Anal. 1 (3), 225-243 (1997).
- Gunz, P., Mitteroecker, P., Bookstein, F. Modern morphometrics in physical anthropology. Slice, D. E. , Kluwer Press. 73-98 (2005).
- Oxnard, C., O'Higgins, P. Biology Clearly Needs Morphometrics. Does Morphometrics Need Biology? Biological Theory. 4 (1), 84-97 (2009).
- Schultz, N. G., et al. The genetic basis of baculum size and shape variation in mice. G3. 6 (5), 1141-1151 (2016).
- Schultz, N. G., Lough-Stevens, M., Abreu, E., Orr, T. J., Dean, M. D. The baculum was gained and lost multiple times during mammalian evolution. Integr Comp Biol. 56 (4), 644-656 (2016).
- Dines, J. P., et al. Sexual selection targets cetacean pelvic bones. Evolution. 68 (11), 3296-3306 (2014).
- Adams, D. C., Otárola-Castillo, E. geomorph: an R package for the collection and analysis of geometric morphometric shape data. Methods Ecol. Evol. 4 (4), 393-399 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
