Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

Summary

Hier beschrijven we een complete workflow voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van immuun synapsen tussen primaire menselijke T-cellen en cellen antigeen-presenteren. De methode is gebaseerd op imaging stroom cytometry, waarmee de verwerving en evaluatie van verscheidene duizend cel beelden binnen een relatief korte periode van tijd.

Abstract

De immuun SYNAPS is het gebied van communicatie tussen T-cellen en antigeen-presenteren cellen (APCs). T-cellen polariseren oppervlakte receptoren en eiwitten naar de immuun SYNAPS signaal uitwisseling te verzekeren van een stabiele binding. Klassieke confocal, TIRF of Super resolutie microscopie zijn gebruikt om het bestuderen van de immuun synaps. Aangezien deze methoden handmatige Beeldacquisitie en tijdrovende kwantificering vereisen, is de beeldvorming van zeldzame gebeurtenissen uitdagend. Hier beschrijven we een workflow waarmee de morfologische analyse van tientallen duizenden cellen. Immuun synapsen veroorzaakt tussen primaire menselijke T-cellen in pan-leukocyte preparaten en Staphylococcus aureus enterotoxine B SEB-geladen Raji cellen als APCs. Beeldacquisitie wordt uitgevoerd met imaging stroom cytometry, ook wel genoemd In-Flow microscopie, die eigenschappen van de cytometer van een stroom en een fluorescentie Microscoop combineert. Een complete gating strategie voor de identificatie van T-cel/APC paren en analyseren van de immuun synapsen wordt verstrekt. Als deze werkstroom kan de analyse van immune synapses in ongezuiverde pan-leukocyte preparaten en vandaar vereist slechts een kleine hoeveelheid bloed (dat wil zeggen, 1 mL), het kan worden toegepast op monsters van patiënten. Nog belangrijker is, kunnen verschillende monsters worden voorbereid, gemeten en geanalyseerd in parallel.

Introduction

T-cellen zijn grote regulatoren van het adaptieve immuunsysteem en worden geactiveerd door middel van antigene peptiden die worden gepresenteerd in het kader van grote comptabiliteit complexen (MHC). Volledige T-cel activatie vereist twee signalen, de bevoegdheid signaal via de antigeen-specifieke T-cel receptor (TCR) / CD3 complex en het costimulatory signaal via accessoire receptoren. Beide signalen worden gegenereerd door de directe interactie van T cellen met antigeen-presenteren cellen (APCs). Volwassen APCs geven het signaal van de bevoegdheid voor T-cel activatie door MHC-peptide complexen, en zij uiten costimulatory liganden (bijvoorbeeld, CD80 of CD86) om te verzekeren van de progressie van T-cel activatie¹. Een belangrijke functie van costimulatie is de omlegging van de actine cytoskelet^2,3,4. De corticale F-actine is tamelijk statisch in de rust van T-cellen. T-cel stimulatie door antigeen-bevattende APCs leidt tot een ingrijpende herinrichting van het cytoskelet actine. Actin dynamics (dwz, snel actine polymerisatie/depolymerization cirkels) kunnen de T-cellen maken van troepen die worden gebruikt voor het vervoer van proteïnen of organellen, bijvoorbeeld. Het cytoskelet actine is bovendien belangrijk voor de ontwikkeling van een speciale contact zone tussen T-cellen en APCs, genaamd de immuun synaps. Vanwege het belang van het cytoskelet van de actine aan de immuun SYNAPS, het essentieel geworden methoden kwantificeren van veranderingen in het actine cytoskelet van T cellen^5,6,7,8 te ontwikkelen ^{, 9}.

Door middel van actine cytoskeletal hulp, worden oppervlakte receptoren en signalering eiwitten gescheiden in supramoleculaire activering clusters (SMACs) binnen de immuun synaps. De stabiliteit van de immuun SYNAPS wordt verzekerd door de binding van de receptoren naar F-actine bundels, waardoor de elasticiteit van het cytoskelet van actine. Immuun synapse formatie is aangetoond dat het van doorslaggevend belang voor de generatie van de adaptive immuunrespons. De nadelige gevolgen van een defecte immuun synapse formatie in vivo werden voor het eerst besefte bij patiënten met van Wiskott Aldrich syndroom (WAS), een ziekte in de polymerisatie van welke actine en, gelijktijdig, immuun synapse formatie worden verstoord¹⁰ . WAS patiënten kunnen lijden aan eczeem, ernstige recidiverende infecties, auto-immune ziekten en melanomen. Ondanks deze bevinding, is het op dit moment niet bekend of immuun synapse formatie verschilt in de T-cellen van gezonde individuen en patiënten met een immuun afwijkingen of auto-immune ziekten.

Fluorescentie microscopie, confocal waaronder, TIRF en super resolutie microscopie, werden gebruikt om te ontdekken de architectuur van de immuun synapse^11,12,13,14. De hoge resolutie van deze systemen en de mogelijkheid om live-cel imaging kunnen de collectie van exacte, spatio-temporele informatie over het cytoskelet actine en oppervlakte of intracellulaire eiwitten in de immuun synaps. Veel resultaten worden gevonden, zijn echter gebaseerd op de analyse van slechts enkele tientallen T-cellen. Bovendien moeten de T-cellen worden gezuiverd voor deze soorten fluorescentie microscopie. Voor veel onderzoeksvragen echter het gebruik van ongezuiverde cellen in plaats van de hoogst mogelijke resolutie van het grootste belang. Dit is relevant als T-cellen van de patiënten worden geanalyseerd, aangezien het bedrag van donorbloed beperkt is en er de noodzaak wellicht voor het verwerken van vele monsters in parallel.

We gevestigde microscopische methoden waarmee de analyse van het cytoskelet van actine in de immuun SYNAPS in de menselijke systeem^15,16,17. Deze methoden zijn gebaseerd op imaging stroom cytometry, ook wel genoemd In-Flow microscopie¹⁸. Als een hybride tussen multispectrale stroom cytometry en fluorescentie microscopie, imaging stroom cytometry heeft zijn sterke punten in het analyseren van morfologische parameters en eiwit localisatie in heterogene cel populaties, zoals pan-leukocyten van de perifeer bloed. We introduceerden een methodologie waarmee we kunnen kwantificeren F-actine in T-cel/APC geconjugeerde van menselijke T-cellen van de volbloed monsters, zonder de behoefte aan tijdrovende en dure zuivering stappen¹⁷. De techniek die hier gepresenteerd omvat de gehele werkstroom, van het krijgen van het bloedmonster naar de kwantificering van F-actine in de immuun synaps.

Protocol

1. voorbereiding van de Pan-leukocyten

1. 1 mL van perifeer bloed trekken van een gezonde donor (of patiënt) in een heparinized spuit. Zorg ervoor dat de goedkeuring door de verantwoordelijke Ethische Commissie voor het doneren van bloed.
2. Meng 1 mL van menselijke perifere bloed met 30 mL lysisbuffermengsel ACK (150 mM NH₄Cl, 1 mM KHCO₃en 0.1 mM EDTA, pH 7.0) in een tube van 50 mL en incubeer gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur.
3. Vul de buizen met PBS en centrifugeer bij 300 x g gedurende 6 min. Aspirate het supernatant en resuspendeer de pellet in 30 mL ACK lysis-buffermengsel.
4. Herhaal stap 1.2 en 1.3 totdat het supernatans helder is. Ten slotte, de cellen in PBS, centrifuge op 300 x g gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur, wassen en resuspendeer de pellet cel in 2 mL gestolde voedingsbodem (RPMI1640 + 10% FCS). Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 60 minuten.

2. laden van Raji cellen met SEB

1. Bereiden twee 15 mL Falcon buizen met 1.5 x 10⁶ Raji cellen per buis. Spin down de cellen (300 x g gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur) en verwijder het supernatant.
2. Resuspendeer de cellen in de resterende medium (ongeveer 50-100 µL), voeg 1.9 µL (1,9 µG) SEB, Incubeer bij kamertemperatuur voor 15 min. toevoegen 5 mL gestolde voedingsbodem, spin down de cellen (300 x g gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur) en resuspendeer de pellet in een kweekvloeistof (RPMI 1640 + 10% FCS) bij een dichtheid van 1 x 10⁶ cellen/mL.

3. de inductie van immuun synapsen en vlekken Protocol

1. Pipetteer 500 µL van het preparaat van SEB-geladen Raji cellen in een buis FACS en 500 µL van de voorbereiding van gelost Raji cellen in een ander FACS buis. 650 µL van pan-leukocyten aan elke buis en spin down de cellen (300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur) toevoegen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 150 µL cultuurmedium (RPMI1640 + 10% FCS). Incubeer bij 37 ° C (typisch voor 45 min).
2. Zachtjes vortex de cellen (10 s bij 1000 omwentelingen per minuut) en voeg 1,5 mL paraformaldehyde (1,5%) tijdens de vortex te lossen van de cellen. Stop de fixatie door toevoeging van 1 mL PBS + 1% BSA. Pellet van de cellen (300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en resuspensie de cel pellet in 1 mL PBS + 1% BSA na incubatie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
3. Pellet (300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur) en resuspendeer de cellen in 100 µL van PBS 1% BSA + 0,1% saponine gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur tot permeabilize van de cellen (96-wells-plaat, U-vormige).
4. Wassen van de cellen in PBS, 1% BSA + 0,1% saponine met centrifugeren (300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur) en resuspendeer de pellet cel in 50 µL van PBS, 1% BSA + 0,1% saponine bevattende fluorophore-gelabelde antilichamen of verbindingen (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150), en de DAPI (1:3, 000)).
5. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur in het donker voor 30 min. Wash de cellen 3 keer door toevoeging van 1 mL PBS, 1% BSA + 0,1% saponine. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Re-resuspendeer de cellen in 60 µL van PBS voor imaging cytometry van de stroom.

4. Beeldacquisitie met behulp van een stroom Cytometer

Opmerking: De volgende afbeelding overname procedure en data analyse zijn gebaseerd op imaging cytometry van de stroom met behulp van software zoals imagestream (IS100), INSPIRE en ideeën. Andere flow cytometers en analyse software kan echter ook worden gebruikt.

1. Open de analysesoftware op de computer is verbonden met de beeldvorming stroom cytometer en klik op initialiseren Fluidics van het Instrument-menu. De kralen zijn van toepassing op de juiste poort wanneer gevraagd dit te doen.
2. De standaardsjabloon laden in het menu bestand en klik op Run/Setup. Kralen kiezen in het dropdown-menu Beeld.
3. Het hulplicht helder-veld aanpassen door te klikken op intensiteit ingesteld als de aangegeven waarde lager dan 200 is.
4. Voer de kalibratie en routine in het Assist-tabblad test door te klikken op Start alle.
5. Klik op Flush/Lock/laden en toepassen van de monsters in de linker haven wanneer gevraagd dit te doen. Na het laden van de cellen in de cytometer van de stroom, de classificatie van de cel open en wijzig de waarden als volgt: piek intensiteit bovengrens op 1,022 voor elk kanaal, piek intensiteit ondergrens op 50 voor kanaal 2 (DAPI) en kanaal 5 (CD3-Pe-TxR), de ondergrens van het gebied op 50 voor kanaal 1 (kant spreiding) en de bovengrens op 1.500.
6. De kracht van de laser excitatie omzetten in 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW), en 647 nm (90 mW) in het tabblad Setup.
7. Schakel het dropdown-menu Beeld tussen cellen en kralen om te evalueren van de cel classificatie en laser de aanpassingen van de macht.
   Opmerking: Zorg ervoor dat alle cellen en cel paren de mobiele weergave te vinden zijn en dat cel klontjes, puin en beelden met verzadigde pixels in de weergave van het puin worden gevonden door het veranderen van de cel classificaties en/of de bevoegdheden van de laser excitatie.
8. Definieert de naam van het monster en de hoeveelheid beelden te verwerven (15.000-25.000 voor monsters) en 500 voor compensatie besturingselementen in de Setup tab. Klik op Run/Setup om te beginnen met de overname.

5. de gegevensanalyse

1. Overbrengen van de raw-afbeeldingsbestanden (.rif) naar de data analyse computer en open de analysesoftware.
2. Het produceren van een matrix van de vergoeding volgens de instructies van de compensatie-dropdown. Sla de compensatie-matrix als comp_Date.ctm.
3. Open een voorbeeldbestand voor raw-afbeeldingen (.rif) en toepassing van de comp_Date.ctm in het venster dat verschijnt om de gecompenseerd afbeeldingsbestanden (.cif) en het hulpprogramma voor het analyse van het standaard-gegevensbestand (.daf) te produceren.
4. Open de gecompenseerd spiegelbeeld vijl. De beelden omzetten in kleurmodus en aanpassen van de opzoektabellen met het oog op een optimale zichtbare kleuren in de werkbalk afbeeldingseigenschappen van fotocollage. Het verkrijgen van een RGB-samengevoegde beeld met behulp van de samengestelde tabblad van de werkbalk afbeeldingseigenschappen van fotocollage.
5. Open de masker Manager in de vervolgkeuzelijst van de analyse. Het maken van maskers om te definiëren van de T-cellen en de immuun SYNAPS, als volgt:
   1. Selecteer de T-cel-masker: "(opvulling (Threshold_Ch05, 60)." Selecteer de vallei masker: "Valley(Ch02,3)." Selecteer de T-cel synapse masker: "T-cel masker en Valley (M02, Ch02, 3)."
6. Open de functie Manager in de vervolgkeuzelijst van de analyse. Bereken de volgende functies:
   1. Voor de totale CD3 meningsuiting in T-cellen, selecteert u "Intensity_T-cells_Ch5." Voor de totale hoeveelheid F-actine in de T-cellen, selecteert u "Intensity_T-cells_Ch6." Voor CD3 expressie in de immuun SYNAPS, selecteert u "Intensity_T-cel synapse_Ch5." Voor het bedrag van F-actine in de immuun SYNAPS, selecteer "Intensity_T-cel synapse_Ch6."
   2. Als u wilt berekenen van de oppervlakte van de T-cel, selecteert u "Area_T-cellen." Als u wilt berekenen van de oppervlakte van de immuun synapse T-cel, selecteert u "Area_T-cel synaps."
7. De F-actine en CD3 verrijking in de immuun SYNAPS bepalen met behulp van de vergelijking in de Manager van de functie:
   
8. De volgende gating strategie toepassen met behulp van histogrammen en dot plots uit het analysegebied (voor verdere details, zie verwijzingen 17 en 19):
   1. Out-of-focus cellen negeren door het uitzetten van de "Gradient RMS_M2_Ch2" in een histogram; de drempel vastgesteld op 15.
   2. De WS versus CD3 intensiteit in een dot plot plot. Een poort aangezet CD3-positieve gebeurtenissen.
   3. Uitzetten van de "Aspect ratio" van M02 (DAPI vlek) ten opzichte van het gebied van M02 (Dapi vlek). Gate op onderhemden T-cel en cel paren dienovereenkomstig. Voor echte cel paren met behulp van het gebied van de synaps masker, zoals eerder beschreven^17,19corrigeren.
   4. Het bepalen van het bedrag van F-actine in onderhemden T-cel en T-cellen van T-cel/APC paren en het percentage van de F-actine in de immuun synaps.

Results

Een belangrijk doel van de hier beschreven methode is de kwantificering van eiwitverrijking (b.v., F-actine) in de immuun SYNAPS tussen surrogaat APCs (Raji cellen) en T cellen in ongezuiverde pan-leukocyten ontleend aan menselijke bloedmonsters van laag-volume (1 mL). De screenshot in Figuur 1 geeft een overzicht van de kritische gating strategie van deze methode. Het toont de image gallery op de linker- en het analysegebied aan de rechterkant (Figuur 1<...

Discussion

De hier gepresenteerde workflow maakt de kwantificering van immuun synapsen tussen menselijke T cellen (ex vivo) en APCs. Met name werden erytrocyt-lysed pan-leukocyten gebruikt als T-cel-bronnen, T-cel zuivering stappen overbodig maken. De B-cel lymfoom cellijn Raji diende als surrogaat APCs. Dit draagt aanzienlijke voordelen, omdat het maakt vergelijkingen tussen bloeddonoren van de kant van de T-cel van de immuun synaps. Autologe DCs kunnen bovendien nauwelijks rechtstreeks vanaf het perifere bloed. De productie van m...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
>Multifuge 3 SR	Heraeus
RPMI 1640	LifeTechnologies	#11875085	500 mL
FCS	Pan Biotech#3302-P101102
Polystyrene Round Bottom Tube	Falcon	#352054	5 mL
Kulturflasche	Thermo Scientific	#178883
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8662
Bovine Serum Albumin	Roth	#8076.3
Saponin	Sigma	S7900
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	#16005
FACS Wash Saponin		PBS 1% BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaB	Sarstedt	72.699.002	0.5 mL
Speed Bead	Amnis	#400041
Minishaker MS1	IKA Works	MS1
Mikrotiterplatte	Greiner Bio One	#650101	96U
Enterotoxin SEB	Sigma Aldrich	S4881
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	1:3000
CD3-PeTxR	Invitrogen	MHCD0317	1:30
Phalloidin-AF647	Molecular Probes	A22287	1:150
IS100	Amnis		Imaging flow cytometer
IDEAS	Amnis		Software
INSPIRE	Amnis		Software