Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

Samenvatting

Hier beschrijven we een complete workflow voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van immuun synapsen tussen primaire menselijke T-cellen en cellen antigeen-presenteren. De methode is gebaseerd op imaging stroom cytometry, waarmee de verwerving en evaluatie van verscheidene duizend cel beelden binnen een relatief korte periode van tijd.

Samenvatting

De immuun SYNAPS is het gebied van communicatie tussen T-cellen en antigeen-presenteren cellen (APCs). T-cellen polariseren oppervlakte receptoren en eiwitten naar de immuun SYNAPS signaal uitwisseling te verzekeren van een stabiele binding. Klassieke confocal, TIRF of Super resolutie microscopie zijn gebruikt om het bestuderen van de immuun synaps. Aangezien deze methoden handmatige Beeldacquisitie en tijdrovende kwantificering vereisen, is de beeldvorming van zeldzame gebeurtenissen uitdagend. Hier beschrijven we een workflow waarmee de morfologische analyse van tientallen duizenden cellen. Immuun synapsen veroorzaakt tussen primaire menselijke T-cellen in pan-leukocyte preparaten en Staphylococcus aureus enterotoxine B SEB-geladen Raji cellen als APCs. Beeldacquisitie wordt uitgevoerd met imaging stroom cytometry, ook wel genoemd In-Flow microscopie, die eigenschappen van de cytometer van een stroom en een fluorescentie Microscoop combineert. Een complete gating strategie voor de identificatie van T-cel/APC paren en analyseren van de immuun synapsen wordt verstrekt. Als deze werkstroom kan de analyse van immune synapses in ongezuiverde pan-leukocyte preparaten en vandaar vereist slechts een kleine hoeveelheid bloed (dat wil zeggen, 1 mL), het kan worden toegepast op monsters van patiënten. Nog belangrijker is, kunnen verschillende monsters worden voorbereid, gemeten en geanalyseerd in parallel.

Inleiding

T-cellen zijn grote regulatoren van het adaptieve immuunsysteem en worden geactiveerd door middel van antigene peptiden die worden gepresenteerd in het kader van grote comptabiliteit complexen (MHC). Volledige T-cel activatie vereist twee signalen, de bevoegdheid signaal via de antigeen-specifieke T-cel receptor (TCR) / CD3 complex en het costimulatory signaal via accessoire receptoren. Beide signalen worden gegenereerd door de directe interactie van T cellen met antigeen-presenteren cellen (APCs). Volwassen APCs geven het signaal van de bevoegdheid voor T-cel activatie door MHC-peptide complexen, en zij uiten costimulatory liganden (bijvoorbeeld, CD80 of CD8....

Protocol

1. voorbereiding van de Pan-leukocyten

1. 1 mL van perifeer bloed trekken van een gezonde donor (of patiënt) in een heparinized spuit. Zorg ervoor dat de goedkeuring door de verantwoordelijke Ethische Commissie voor het doneren van bloed.
2. Meng 1 mL van menselijke perifere bloed met 30 mL lysisbuffermengsel ACK (150 mM NH₄Cl, 1 mM KHCO₃en 0.1 mM EDTA, pH 7.0) in een tube van 50 mL en incubeer gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur.
3. Vul de buizen met PBS en centrifugeer bij 300 x g gedurende 6 min. Aspirate het supernatant en resuspendeer de pellet in 30 mL ACK lysis-buffermengsel.
4. Herhaal stap 1.2 en....

Resultaten

Een belangrijk doel van de hier beschreven methode is de kwantificering van eiwitverrijking (b.v., F-actine) in de immuun SYNAPS tussen surrogaat APCs (Raji cellen) en T cellen in ongezuiverde pan-leukocyten ontleend aan menselijke bloedmonsters van laag-volume (1 mL). De screenshot in Figuur 1 geeft een overzicht van de kritische gating strategie van deze methode. Het toont de image gallery op de linker- en het analysegebied aan de rechterkant (Figuur 1<.......

Discussie

De hier gepresenteerde workflow maakt de kwantificering van immuun synapsen tussen menselijke T cellen (ex vivo) en APCs. Met name werden erytrocyt-lysed pan-leukocyten gebruikt als T-cel-bronnen, T-cel zuivering stappen overbodig maken. De B-cel lymfoom cellijn Raji diende als surrogaat APCs. Dit draagt aanzienlijke voordelen, omdat het maakt vergelijkingen tussen bloeddonoren van de kant van de T-cel van de immuun synaps. Autologe DCs kunnen bovendien nauwelijks rechtstreeks vanaf het perifere bloed. De productie van m.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
>Multifuge 3 SR	Heraeus
RPMI 1640	LifeTechnologies	#11875085	500 mL
FCS	Pan Biotech#3302-P101102
Polystyrene Round Bottom Tube	Falcon	#352054	5 mL
Kulturflasche	Thermo Scientific	#178883
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8662
Bovine Serum Albumin	Roth	#8076.3
Saponin	Sigma	S7900
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	#16005
FACS Wash Saponin		PBS 1% BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaB	Sarstedt	72.699.002	0.5 mL
Speed Bead	Amnis	#400041
Minishaker MS1	IKA Works	MS1
Mikrotiterplatte	Greiner Bio One	#650101	96U
Enterotoxin SEB	Sigma Aldrich	S4881
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	1:3000
CD3-PeTxR	Invitrogen	MHCD0317	1:30
Phalloidin-AF647	Molecular Probes	A22287	1:150
IS100	Amnis		Imaging flow cytometer
IDEAS	Amnis		Software
INSPIRE	Amnis		Software