Methodenartikel

Het gebruik van Trace Eyeblink klassieke conditionering te beoordelen Hippocampal dysfunctie in een Rat Model van Fetal Alcohol Spectrum Disorders

9.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55350

⸱

5 augustus 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychology, East Carolina University, 2Multidisciplinary Studies Program in Neuroscience, East Carolina University

In dit artikel

Samenvatting

Trace eyeblink klassieke conditionering (ECC) werd gebruikt om te beoordelen hippocampal-afhankelijke associative leren bij volwassen ratten die waren toegediend een hoge concentratie (11,9% v/v) van alcohol tijdens de vroege ontwikkeling van de neonatale hersenen. In het algemeen, zijn ECC procedures diagnostische hulpmiddelen voor het opsporen van hersenen dysfunctie over vele psychologische en biomedische instellingen voor geluid.

Samenvatting

Neonatale ratten werden toegediend een relatief hoge concentratie van ethylalcohol (11,9% v/v) tijdens postnatale dagen 4-9, een tijd waarin de foetale hersenen snelle organisatorische veranderingen ondergaat en is vergelijkbaar met versnelde hersenen veranderingen die zich tijdens het derde trimester bij de mens voordoen. Dit model van fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produceert ernstige schade aan de hersenen, het nabootsen van het bedrag en de patroon van binge-drinken dat zich in sommige zwangere alcoholische moeders voordoet. We beschrijven het gebruik van trace eyeblink klassieke conditionering (ECC), een variant van de hogere-orde van associative leren, om te beoordelen op lange termijn hippocampal dysfunctie, die meestal in volwassen nakomelingen alcohol-blootgesteld wordt gezien. Op de leeftijd van 90 dagen, knaagdieren waren operatief bereid met opname en stimulerende elektroden, die gemeten Electromyografische (EMG) knipperen van de activiteit van de spier links ooglid en milde schok posterieure voor het linker oog, respectievelijk afgeleverd. Na een herstelperiode van 5 dagen onderging ze 6 sessies van trace ECC associative leren verschillen tussen alcohol-blootgesteld en controle van de ratten te bepalen. Trace ECC is één van vele mogelijke ECC procedures die moeiteloos kunnen worden gewijzigd met behulp van dezelfde apparatuur en software, zodat verschillende neurale systemen kunnen worden beoordeeld. ECC procedures in het algemeen, kunnen dienen als diagnostische hulpprogramma's voor het opsporen van neurale pathologie in de hersenen van de verschillende systemen en verschillende omstandigheden die beledigen van de hersenen.

Inleiding

Het is moeilijk voorstelbaar dat alcoholmisbruik in de huidige tijd, met betere gezondheidszorg en toegang tot medische diensten, nog steeds een groot wereldwijd gezondheidsprobleem is. Helaas is aangetoond dat een zwangere vrouw die grote hoeveelheden alcohol drinkt, een kind kan krijgen met ernstige hersenschade en neuro-ontwikkelingsstoornissen die een leven lang aanhouden, zoals blijkt uit gevallen van foetaal alcoholsyndroom (FAS)1,2,3. Bij vrouwen met een bevestigde geschiedenis van materneel alcoholgebruik is de zich ontwikkelende foetus ook vatbaar voor kleine hoeveelheden alcohol of verschillende consumptiepatronen die variërende verschillen in bloedalcoholconcentraties veroorzaken. In dit laatste geval vertonen de kinderen mogelijk niet de ernstige morfologische of neurobehaviorale afwijkingen zoals bij FAS, maar kunnen zij nog steeds levenslange cognitieve beperkingen en emotionele stoornissen vertonen die variëren van mild tot ernstig3,4. Samen vormen FAS en minder ernstige vormen van prenatale alcohol-gemedieerde verstoringen een verzameling van foetale alcoholspectrumstoornissen (FASDs). Het is geen verrassing dat FASDs volledig te voorkomen zijn, maar verbazingwekkend genoeg tonen schattingen aan dat zij in populaties waar alcoholmisbruik veel voorkomt, de belangrijkste niet-genetische oorzaak blijven van neurale en cognitieve beperkingen, waarbij ongeveer 2% tot 5% van de jonge kinderen in de VS en in Europese landen zoals Frankrijk en Zweden wordt getroffen. Met betrekking tot de incidentie van alleen FAS in de VS bedraagt de prevalentie 2 tot 7 per 1.000 levendgeborenen5, wat impliceert dat de totale incidentie van FASDs veel hoger is dan die van FAS.

Neuroimagingstudies bij kinderen met FASD hebben aangetoond dat zij hersenafwijkingen vertonen, zoals een dunner corpus callosum6, een kleinere anterior cerebellar vermis7 en een kleinere hippocampus8. Deze hersenafwijkingen liggen ten gronden aan enkele van de langdurige neurocognitieve stoornissen die bij kinderen met FASD worden waargenomen. De exacte verbanden tussen variaties in door alcohol bij de moeder veroorzaakte hersenveranderingen en variaties in het profiel (d.w.z. type, omvang) van specifieke neurocognitieve beperkingen moeten nog duidelijk worden vastgesteld. Echter, als uitgangspunt is de hippocampus een uitstekende kandidaat om de vatbaarheid voor prenatale alcoholeffecten te bepalen. Kinderen met FASD vertonen inderdaad tekorten in hippocampus-gemedieerd gedrag, zoals plaatsleren9,10 en vertraagde objectherinnering11.

Knaagdiermodellen voor FASD's zijn van onschatbare waarde gebleken bij het verhelderen van de mechanismen die leiden tot de neurocognitieve verstoringen die worden gezien bij kinderen met FASD's. Een goed gevestigd binge-expositiemodel dat wij hebben overgenomen, houdt in dat ratten alcohol toegediend krijgen tijdens de postnatale dagen 4-912,13, een periode waarin de hersenen een snelle vorming van synapsen en dendritische contacten ondergaan, vergelijkbaar met de 24ste foetale week bij mensen en uitlopend tot in het 3de trimester14,15,16,17. Dit specifieke model induceert een significant verlies van hippocampale neuronen18,19 en neuronen in vele andere hersenregio's, zoals het cerebellum12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, gepaard gaand met ernstige beperkingen in cognitieve functies over verschillende domeinen21,24,25. Cognitieve verstoring door vroege alcoholblootstelling bij ratten kan op verschillende manieren worden beoordeeld, in het bijzonder met klassieke oogknipperconditionering (ECC). ECC is een paradigma dat al meer dan een eeuw wordt gebruikt om de fundamentele basis van leren wetenschappelijk te onderzoeken26,27 en biedt als zodanig een nuttige methode om de nadelige neurocognitieve gevolgen van foetale alcoholblootstelling beter te begrijpen. Het is een zeer flexibel paradigma dat onderzoekers in staat stelt een verscheidenheid aan verschillende ECC-procedures te gebruiken, waarvan elke procedure kan worden onderzocht bij vele zoogdiersoorten over de fylogenetische schaal heen (van muizen tot mensen) en gedurende verschillende stadia van de hersenontwikkeling28,29,30,31. Bovendien worden de fundamentele neurale circuits die associatief leren in dit paradigma bemiddelen, ondersteund door experimentele en neuropsychologische rapporten bij deze zelfde soorten26,32,33,34,35,36,37.

Eén vorm van ECC, trace ECC, wordt in dit artikel gedemonstreerd (Figuur 1). Ter context wordt dit vergeleken met de meer traditionele vorm: delay ECC. Het ECC-paradigma is gemodelleerd naar klassieke conditionering bij honden, voor het eerst uitgevoerd door de Nobelprijswinnende fysioloog Ivan Pavlov. Pavlov ontdekte dat bepaalde stimuli, zoals tonen, van nature geen speekselvloed opwekken, maar wanneer een toon voorafgaat aan en overlapt met het aanbieden van voedsel, kan de speekselreactie worden versterkt door herhaalde presentaties van beide, mits deze toon-voedselcontingentie wordt gehandhaafd. Dit is een voorbeeld van delay ECC, gebaseerd op de gedachte dat associatieve sterkte wordt gemedieerd door onmiddellijke temporele contiguïteit tussen de twee stimuli, waardoor de leercondities voor een dier optimaal zijn. Hij testte ook andere variaties van de toon-voedselcontingentie, zoals het uitschakelen van de toon en het laten verstrijken van een "trace"-periode (spoorperiode) voordat het voedsel werd toegediend. Wanneer deze twee stimuli voldoende discontinu waren, werd het voor de honden veel moeilijker om speekselreacties te vertonen voorafgaand aan de toediening van het voedsel. De discontinuïteit tussen het uitschakelen van de toon en de toediening van het voedsel is dus een voorbeeld van trace ECC. Aangezien knaagdieren van nature niet kwijlen bij de aanwezigheid van voedsel, worden in plaats daarvan meer soortspecifieke stimuli zoals een milde schok gebruikt; ze vertonen ook van nature geen defensieve knipperreflexen bij tonen. Tegen deze achtergrond houden ECC-procedures bij knaagdieren in dat een toon op een bepaald decibelniveau wordt gepresenteerd en op een bepaalde manier wordt gekoppeld aan een milde schok aan ofwel de ooglidspier (orbicularis oculi) of de temporalis-spier om een knipperreactie op te wekken. De toon wordt beschouwd als een geconditioneerde stimulus (CS), terwijl de schok wordt beschouwd als een ongeconditioneerde stimulus (US). Bij delay ECC wordt de CS eerst gepresenteerd; deze stimulus blijft gedurende een bepaalde duur aanstaan. Daarna wordt de US toegediend. Deze twee stimuli overlappen elkaar gedurende een bepaalde tijd en eindigen vervolgens gelijktijdig; de resulterende knipperreactie die door de US wordt opgewekt, wordt beschouwd als een ongeconditioneerde respons (UR). In deze procedure leren knaagdieren om knipperreacties te vertonen enige tijd nadat de CS is gepresenteerd, maar vlak voordat de US volgt, om deze aversieve stimulus te anticiperen. De aangeleerde knipperreactie wordt een geconditioneerde respons (CR) genoemd. Bij trace ECC worden de CS en US gescheiden door een tijdsperiode zonder stimuli, bekend als een trace-interval; ze overlappen elkaar in tijd niet, zoals bij delay ECC. Tijdens dit interval moet het dier de associatieve vereisten tussen de stimuli oplossen. Net als bij delay ECC vindt leren plaats wanneer het dier consequent een knipperreactie vertoont nadat de CS stopt, maar onmiddellijk voor de toediening van de US. Gedurende een bepaalde hoeveelheid acquisitietraining (CS gekoppeld aan US) ontwikkelen zich leercurves (d.w.z. op basis van verschillende CR-metingen). Lesie- en neuro-imagingstudies tonen aan dat succesvol leren bij delay ECC afhankelijk is van intacte neurale circuits tussen het cerebellum en de hersenstam38,39,40, terwijl trace ECC een procedure van hogere orde is die aanvullende neurale betrokkenheid van de hippocampus41,42,43,44 en andere corticale structuren45,46 vereist. Vanwege de timing-gerelateerde vereisten die nodig zijn om trace CR's succesvol aan te leren, is deze taak ook moeilijker aan te leren (zelfs voor normale subjecten).

figure-introduction-1
Figuur 1: Klassieke conditionering van de oogknippreflex via trace-conditioning. Er wordt een representatieve golfvorm getoond van een volwassen rat in de niet-geintubeerde controlegroep (UC). De toon CS (85 dB, 2,8 kHz) wordt eerst gedurende 380 ms gepresenteerd. Daarna volgt een trace-interval van 500 ms, waarin geen stimuli aanwezig zijn. Vervolgens wordt een schok US (1,6 mA) toegediend gedurende 100 ms. Succesvol leren in deze taak vindt plaats wanneer de frequentie (%) of amplitude (in volt) van oogknippen tijdens het tijdsvenster van de geconditioneerde respons (CR) (totale CR-periode) toeneemt over meerdere trainingssessies. In het bijzonder zullen knaagdieren met een intacte hippocampus gewoonlijk meer goed getimede CR's (adaptieve CR's) vertonen vlak voor het begin van de schok US (binnen een venster van 200 ms). Schrikreacties (SR's) tijdens de eerste 80 ms na het begin van de toon CS en ongeconditioneerde responsen (UR's) worden ook gemeten. Niet-associatieve SR's zijn doorgaans laag of afwezig bij goed getrainde knaagdieren, terwijl van UR's wordt verwacht dat ze hoog zijn in frequentie en amplitude. Deze taak vereist dat het knaagdier leert de associatie tussen het einde van de CS en het begin van de US te overbruggen (tijdens het trace-interval), waardoor het inherent moeilijker te verwerven is in vergelijking met delay-ECC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hier demonstreëren we de nadelige functionele gevolgen van neonatale alcoholblootstelling die op een binge-achtige manier wordt toegediend, beoordeeld via een trace ECC-procedure waarbij een 85 dB toon CS (2,8 kHz) wordt gegeven die 380 ms aanhoudt, gevolgd door een 1,6 mA schok US die 100 ms aanhoudt, waarbij deze stimuli worden gescheiden door een trace-periode van 500 ms. We hebben in eerdere studies naar choline-interventie en ijsuppvulling ter verzachting van de effecten van neonatale alcoholblootstelling melding gemaakt van het nut van deze gedragsmatige assay18,47. Trace ECC kan inderdaad worden gebruikt als diagnostisch instrument om neonatale alcohol-geïnduceerde hippocampale pathologie te beoordelen. Het voordeel ten opzichte van delay ECC is dat het gevoeliger is voor het detecteren van verstoringen in de hippocampale functie, die bij mensen met FASDs is aangetast.

De demonstratie van ECC reikt veel verder dan het veld van foetaal alcoholsyndroom. Veel varianten van ECC (bijv. vertraging, sporen, samengesteld, omkering) kunnen worden gebruikt om ontogenetische verschillen in leren gedurende de ontwikkeling te verduidelijken, de neurobiologische basis van associatief leren bij normale zoogdieren, alsofzoals de kwetsbaarheden van verschillende hersensystemen voor vele uitdagingen, inclusief (maar niet beperkt tot) teratogenen, omgevingsgifstoffen, traumatisch hersenletsel, neurodegeneratieve ziekten en psychiatrische aandoeningen.

Protocol

OPMERKING: Alle procedures zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen vastgesteld door de IACUC van de East Carolina University. Long-Evans ratten werden gefokt uit vrouwtjes gepaard met mannelijke fokdieren. Pupjes uit alle drie de behandelgroepen (zie 1.1) werden gegenereerd binnen een nest van dezelfde moeder. Er werden vijf nesten geproduceerd en elk nest werd op postnatale dag (PD) 3 teruggebracht naar 8 pupjes. De overige twee pupjes per nest werden toegewezen aan afzonderlijke experimenten. Zowel mannelijke als vrouwelijke nakomelingen (één per blootstellingsgroep) werden in de studie opgenomen. In totaal werden N = 27 volwassen nakomelingen in deze studie onderzocht; 3 ratten werden uitgesloten vanwege gebroken 3T-draden (zie 3.1.1) die op dag 1 van de ECC-training niet te repareren waren.

1. Voorbereiding van groepen, materialen en oplossingen

  1. Verwijder op PD 3 de pups van de moeder en plaats ze op een thermoregulerend waterverwarmingsmatje om ze warm te houden. Gebruik een willekeurige selectieprocedure om de ratpups in een van drie groepen te verdelen: (1) alcohol-geïntubeerd (AI); (2) sham-geïntubeerde controle (SI); of (3) niet-geïntubeerde controle (UC). Voer goedgekeurde identificatieprocedures uit, zoals het tatoeëren van de pootjes met [niet-giftige] inkt met een 30G x 1/2 in naald volgens een nummeringsschema. Plaats de pups terug bij de moeder zodra het tatoeëren is voltooid.
  2. Bereid één of meerdere intragastrische intubatiebuisjes voor met behulp van polyethyleen (PE) maat 50 en 10. De totale lengte van deze buis is afhankelijk van de gebruiker en kan dienovereenkomstig worden aangepast.
    1. Gebruik microdissectiescharen om een stuk PE-50 buis van 3 in en een stuk PE-10 buis van 6 in af te knippen.
    2. Bevestig de PE-50 buis voorzichtig aan een steriele 22 G x 1 in hypodermische naald.
    3. Steek één uiteinde van de PE-10 buis in het open uiteinde van de PE-50 buis. Een diagonale snede aan de punt van de PE-10 buis kan nodig zijn om deze in de PE-50 buis te geleiden.
    4. Knip een klein stukje PE-50 buis af (ongeveer 2-3 mm) en schuif dit op het open uiteinde van de PE-10 buis. Dit dient als visuele stop.
    5. Bewaar de complete intragastrische intubatiebuis in verse 70% isopropylalcohol om deze steriel te houden.
  3. Voer aseptische procedures uit om een voorraadmelkoplossing in flesjes van 50 mL te bereiden. De voorraadmelkoplossing is gebaseerd op een dieetformule die oorspronkelijk is vastgesteld door West et al. (1984)48. Bewaar de flesjes bij -18 °C tot het moment van gebruik. Ontdooi vóór gebruik twee flesjes melk met warm water.
    1. Trek met een steriele spuit 7,16 mL 95% ethylalcohol (USP) op en voeg dit toe aan één melkflesje van 50 mL. Dit resulteert in een alcoholoplossing van 11,9% v/v die aan de ratpups wordt toegediend tijdens de eerste twee voedingen van de dag (zie 2.1.1); de totale dagelijkse dosis alcohol is 5,25 g/kg/dag. Het is ontworpen om de alcohol in een volume (0,0278 mL/g per voeding) in verrijkte melkoplossing toe te dienen.
      OPMERKING: Deze hoeveelheid kan worden aangepast op basis van de worpgrootte en het verwachte gebruik over 3-4 dagen. De hoeveelheid toegevoegde alcohol moet ook worden aangepast om een 11,9% v/v oplossing te verkrijgen.
    2. Schud dit flesje goed en label het dienovereenkomstig (bijv. 11,9% v/v ethylalcohol in melk).
    3. Label het tweede flesje melk (zonder toegevoegde alcohol) dienovereenkomstig (bijv. alleen melk) en gebruik dit voor aanvullende voedingen zoals aangegeven in 2.1.1.
    4. Bewaar beide melkflesjes in de koelkast.

2. Neonatale blootstelling aan alcohol (postnatale dag 4-9)

  1. Geef AI- en SI-pups in totaal 4 intubaties per dag, beginnend op PD 4. Laat tussen elke intubatie 2 u passeren. Omdat AI-pups met een werkelijke oplossing worden geïntubeerd, worden al hun intubaties als voedingen beschouwd.
    1. Intubeer de AI-pups met de 11,9% v/v ethylalcohol-in-melk-oplossing tijdens de eerste twee voedingen van de dag, en intubeer hen vervolgens met de enkelmelk-oplossing tijdens de laatste twee voedingen van de dag om hun groei te ondersteunen.
    2. Intubeer de SI-pups 4 keer zonder oplossing elke twee uur, om ervoor te zorgen dat zij aan dezelfde blootstellingstijd van de PE-10-tube worden onderworpen als de AI-pups. De UC-groep krijgt geen intubaties.
  2. Haal de pups bij de moeder weg en plaats ze op een thermoregulatiemat met warm water om ze warm te houden. Weeg elke pup en noteer het lichaamsgewicht (in g). Raadpleeg een vooraf gemaakte voedingskaart om het intubatievolume voor elke AI-pup te bepalen en noteer dit op een registratieblad.
    1. Plaats de 11,9% v/v ethylalcohol-in-melk-oplossing in een warm waterbad en schud deze goed.
    2. Intragastrische intubatieprocedure:
      1. Spoel de intragastrische intubatietube, die in 70% isopropylalcohol was bewaard, goed uit met warm water.
      2. Trek de juiste hoeveelheid oplossing op met een steriele 1 mL spuit.
      3. Doop de punt van de intubatietube (PE-10 uiteinde) in verse maïsolie (dit vergemakkelijkt de inbrenging).
      4. Meet de lengte van de PE-10-tube van de bek van de pup tot aan de maag. Pas de PE-50-stopper aan om als stopmarker te dienen.
      5. Voer de PE-10-tube voorzichtig in de bek van de pup in, via de slokdarm, waarbij deze licht door de gastro-oesofageale sfincter gaat en in de maag terechtkomt. Controleer de pup, stabiliseer deze en druk de zuiger van de spuit in om de oplossing toe te dienen. Doe dit in een langzaam tempo.
        OPMERKING: Om te voorkomen dat de tube per ongeluk in de trachea wordt ingebracht, dient u de tube eerst zo te richten dat deze buigt en contact maakt met het zachte gehemelte voordat u verder gaat. Gebruik het gehemelte als gids; de tube zal daarvan natuurlijk afbuigen en via de slokdarm worden geleid. Anders kan elke aanzienlijke ventrale afwijking van de punt ertoe leiden dat deze in de trachea terechtkomt. Het is het beste om de tube te verwijderen en niet door te gaan met de intubatie als men onzeker is over de insteekpositie; voer de tube bij de volgende poging correct opnieuw in.
      6. Verwijder de PE-10-tubing voorzichtig en controleer de pup op terugstroming van de oplossing, bloed of fysiek letsel. Plaats de pup terug bij de nestgenoten als deze in orde is. De gehele intubatieprocedure duurt ongeveer minder dan 1 min per pup en ongeveer 4 min in totaal voor de 4 intubatiebehandelde pups in elk nest (2 AI, 2 SI).
      7. Intragastrische intubatieprocedure voor SI-pups: Volg dezelfde PE-10-inbrengprocedure als voor de AI-pups, maar zonder oplossing voor dezelfde duur (1 min).
      8. Plaats alle pups onmiddellijk na het voltooien van de procedures voor de laatste pup in het nest terug bij de moeder. Plaats de moeder terug in het vivarium tot de volgende voedingssessie (over 2 u).
      9. Spoel de intragastrische intubatietube uit met warm steriel water en plaats deze terug in 70% isopropylalcohol voor bewaring. Spoel de tube voor elke voedingssessie goed uit met water.
      10. Herhaal stap 2.2 (behalve het wegen van de pups) tot 2.2.2.9 voor de tweede voedingssessie. Intubeer bij de laatste twee voedingen de AI-pups met de enkelmelk-oplossing met behulp van dezelfde intubatievolumes als bepaald in stap 2.2.
  3. Weeg de ratten met regelmatige tussenpozen, zoals op PD 15 (wanneer de ogen openen), PD 21 (spenen), PD 30, PD 60 en PD 90 (operatie) om representatieve groeicurves te verkrijgen.

3. Fabricage en modificatie van elektroden

  1. Fabriceer één elektromyografische (EMG) "headstage" voor elke rat (Figuur 2). De headstage maakt de registratie van oogknipperreacties mogelijk via het oogknippersysteem (Figuur 4).
    1. Construeer een headstage bestaande uit twee roestvrijstalen draden met PTFE-coating (polytetrafluoretheen) van maat 3T (elk 5 cm), één roestvrijstalen draad met PTFE-coating van maat 10T (5 cm), drie mannelijke contactpennen en één microstrip-socketisolator die is ingekort tot 3 gaten (zie 3.1.4).
    2. Verwijder de PTFE-coating van de 10T-draad door het midden vast te pakken met een gekartelde precisie-pincet en de coating in beide richtingen te verwijderen met de gladde precisie-pincet. Zorg ervoor dat alle sporen van de coating van deze draad zijn verwijderd.
      1. Krimp één uiteinde van de 10T-draad aan een contactpen met een tandartang met gekarteld platform; deze dient als aarddraad. Houd een 3T-draad voorzichtig vast met de gladde precisie-pincet op 1 tot 1,5 mm van één uiteinde. Strip de PTFE-coating van 1 tot 1,5 mm weg, terwijl de rest van de coating intact blijft. Krimp een contactpen aan het blootgestelde uiteinde van de 3T-draad.
      2. Voer dezelfde procedures uit voor de tweede 3T-draad. Beide draden dienen als de positieve en negatieve leidingen van de EMG-registratie-elektroden.
    3. Voer trekproeven uit op alle draden om te controleren of ze stevig aan de pennen zijn bevestigd. Let erop dat de draden niet worden gebogen of beschadigd.
    4. Snijd een segment van een socketisolatiestrip in tot 3,5 gaten (snijd het midden van het vierde gat door) met het snijblad van een striptang. Kort dit segment in tot precies 3 volledige gaten en schuur indien nodig beide zijden af. Dit helpt om ervoor te zorgen dat 3 volledige gaten beschikbaar zijn. Plaats de pen-draad-eenheden in de drie gaten van de microstrip tot de gekrimpte uiteinden vlak liggen met de onderrand van het isolatiesegment. De 10T-assemblage moet zich in één van de buitenste gaten van de microstrip bevinden en niet in het midden.
  2. Modificeer bipolaire stimulatie-elektroden (Figuur 2).
    1. Geef elke rat één bipolaire stimulatie-elektrode. Deze elektrode brengt via een stimulusisolator (zie oogknippersysteem) een kleine hoeveelheid elektrische stroom toe als de shock US tijdens ECC. De elektroden worden bij de fabrikant in getwijnde vorm aangeschaft en zijn afgeschermd.
    2. Ontwind de twee metalen leidingen 2-3 keer om een V-vorm te maken (spreiding 5 mm) en gebruik vervolgens de gladde precisie-pincet om elke "prong" zo veel mogelijk recht te buigen. Schraap met een scheermesje 1 mm van de afscherming van de punt van elke prong af (rondom). Controleer elke prong op onregelmatigheden en buigingen, en corrigeer deze indien nodig zonder extra afscherming weg te schrapen.
  3. Verwijder productie-olie en vreemde resten van de EMG-headstages en bipolaire elektroden door ze te wassen in 95% ethylalcohol. Laat ze drogen en autoclaveer ze vervolgens.

figure-protocol-1
Figuur 2: Elektromyografische (EMG) registratie-elektroden en bipolaire elektrode. De voltooide EMG-headstage (rechts, oranje) is opgebouwd uit drie mannelijke contactpinnen, twee PTFE-gecoate draden van maat 3T, één PTFE-gecoate draad van maat 10T en een aangepaste microstrip. De drie draden zijn elk ongeveer 5 cm lang en zijn op de contactpinnen gekrimpt. De voltooide bipolaire elektrode (rechts, wit) is ontvlochten, opnieuw rechtgebogen en in een V-vorm gegoten (5 mm splitsing). De afscherming is verwijderd van de uiteinden van de twee pinnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Ooglidoperatieprocedure (postnatale dag 90)

  1. Voorbereiding van materialen (zie Materialen voor gedetailleerde leveringsinformatie), dieren, chirurgische en niet-chirurgische zones:
    1. Autoclaveer chirurgische instrumenten en benodigdheden - het getal tussen haakjes ( ) geeft ongeveer aan hoeveel er nodig is per volwassen rat of meting: chirurgische instrumenten (1 set per 4 ratten, goedgekeurd door de ECU IACUC), gaasjes (3-4), wattenstaafjes (5-6), 20 x 20 wikkel (4 per chirurgische sessie), porseleinen smeltkroes (1), roestvrijstalen microspatel (1), 0,9% fysiologische zoutoplossing (1 spuitfles), Petrischaal (1) en 0-80 roestvrijstalen schroeven (3/rat).
    2. Overige benodigde steriele materialen: chirurgisch scalpelmesje maat 10 (1 per 4 ratten), chirurgisch afdekdoek (1 per rat), veterinaire oogzalf, povidonjodium (1 spuitfles), 26G x 3/8" hypodermische naald (2), vernikkelde pinaal met #55 boor, vernikkelde platte juwelierstschroevendraaier (1,8-2 mm blad).
    3. Bereid een steriele bewaarzone voor voor alle chirurgische instrumenten en benodigdheden met een goedgekeurd desinfectiemiddel van medische/onderzoekskwaliteit. Plaats de materialen in deze zone zodra deze gereed is.
    4. Bereid een steriele chirurgische ruimte voor met een goedgekeurd desinfectiemiddel van medische/onderzoekskwaliteit. Deze ruimte bevat een thermoreguleerbare waterwarmtemat, een stereotaxisch apparaat voorzien van een anesthesiemasker voor ratten, een glasparelsterilisator en een isofluraan-verdamper (voor anesthesie). De verdamper is verbonden met slangen naar het anesthesiemasker en naar een inductiekamer in een aparte ruimte voor niet-steriele voorbereidingsprocedures van de dieren; elke slang wordt bediend door een eigen klep.
    5. Was handen en armen grondig met antimicrobiële zeep. Open items die in sterilisatiezakjes of wikkels zijn verpakt vooraf, zonder de binnenkant aan te raken. Trek steriele handschoenen aan volgens aseptische procedures en breng alle relevante items over naar de chirurgische zone. Stel de boor in op de juiste diepte in de pinaal (~ 2 mm) en bereid de schroevendraaier voor. Dek de steriele materialen af met een steriele wikkel totdat de operatie kan beginnen.
    6. Bereid een niet-steriele ruimte voor met een weegschaal, een elektrische vacuümtrimmer, steriele 1 mL spuiten met 26G x 3/8 in naalden (1 per rat), een operatielogboek en buprenorfine (concentratie 0,03 mg/mL) toegediend als 0,1 mL/100 gram.
      WAARSCHUWING: Buprenorfine is een DEA schedule III semisynthetisch opioïde en moet dienovereenkomstig worden opgesloten en geregistreerd.
    7. Controleer de isofluraan-verdamper op het juiste gasniveau; vul bij indien het niveau laag is. Laat de knoppen voor gasstroom en menging voorlopig uitstaan. Zet de O2-cilinder open en controleer of er voldoende gas is voor alle operaties.
    8. Weeg elke rat en noteer het lichaamsgewicht in het operatielogboek. Gebruik een injectieschema voor buprenorfine om het juiste injectievolume te bepalen.
    9. Open de klep van de verdamper naar de inductiekamer en laat de klep naar het operatiemasker gesloten. Stel de menging in op 3 en de stroomsnelheid op 3 (3% isofluraan met 100% O2 als dragersgas bij een volume van 3 L/min).
    10. Plaats een rat in de inductiekamer en wacht tot het juiste anesthesievlak is bereikt (trage ademhaling, afwezigheid van pedaalreflex, afwezigheid van knipperreflex). Haal de rat uit de kamer zodra het anesthesievlak is bereikt.
    11. Scheren de kop met de vacuümtrimmer, waarbij voldoende huid wordt blootgelegd voor de incisielocatie en het linkerlid. Plaats het dier indien nodig opnieuw in de inductiekamer om opnieuw het anesthesievlak te bereiken voordat het trimmen wordt hervat.
    12. Desinfecteer de blootgestelde huid door drie keer afwisselend isopropylalcohol en povidonjodium aan te brengen. Plaats het dier indien nodig opnieuw in de inductiekamer om opnieuw het anesthesievlak te bereiken, voorafgaand aan de overplaatsing naar de operatietafel.
  2. Operatie
    1. Open de klep van de verdamper naar het anesthesiemasker en sluit de klep naar de inductiekamer. Stel de menging in op 2,5 en de stroomsnelheid op 2 (2,5% isofluraan met 100% O2 als dragersgas bij een volume van 2 L/min). Plaats de rat in het stereotaxische apparaat en volg de standaardprocedures om de kop aan de incisivustang en oorstaven te bevestigen (zie Geiger et al., 200849 voor een voorbeeld).
    2. Geef de rat een pre-operatieve injectie buprenorfine (SC) en gooi de naald (zonder dop) zorgvuldig weg in een naaldencontainer. Plaats een steriel chirurgisch afdekdoek op de rat, waarbij alleen het operatiegebied wordt blootgesteld en geïsoleerd van de rest van het lichaam.
    3. Trek een chirurgisch masker, een chirurgische muts, een chirurgische jas, een veiligheidsbril en alle andere persoonlijke beschermingsmiddelen aan die door de IACUC zijn vereist. Was en schrob handen en armen grondig met antimicrobiële zeep. Trek steriele handschoenen aan volgens steriele procedure.
    4. Breng met een wattenstaafje een kleine hoeveelheid oogzalf aan in beide ogen om uitdroging te voorkomen.
    5. Ga verder met de operatie zodra de rat het juiste anesthesievlak vertoont. Monitor de rat continu gedurende de operatie en controleer periodiek het isofluraanniveau. Pas de stroom- en mengknoppen tijdens de operatie dienovereenkomstig aan op basis van de reactie van de rat op de anesthesie.
    6. Maak met een scalpelmesje een anterieur-posterieure incisie in de middellijn van het schedeldak. Deze incisie moet voldoende gebied voor de ogen (d.w.z. het frontale bot blootleggen) en net achter de lambdoïde naad blootleggen.
    7. Schraap het periosteum bovenop het schedeldak voorzichtig weg om overmatige bloedingen te voorkomen. Veeg overtollig bindweefsel en bloed weg met een wattenstaafje.
    8. Boor een gat met de boor met behulp van een pinaal, beginnend direct achter de coronale naad op één pariëtaal bot. Verwijder bloed en botresten met een wattenstaafje. Pak een 0-80 schroef bij de draad vast met splintersplitterpincetten en bevestig deze in het gat met de juwelierstschroevendraaier; draai de schroef slechts net genoeg aan zonder het corticale hersenweefsel te beschadigen (meestal 3-4 volledige slagen).
    9. Volg dezelfde procedures zoals beschreven in 4.2.8 om nog twee 0-80 schroeven aan de schedel te bevestigen, één direct achter de coronale naad van het tegenovergestelde pariëtaal bot en één direct anterieur aan de rechter lambdoïde naad. Er is vastgesteld dat 3 schroeven voldoende zijn voor het verankeren van het dentale cement (zie 4.2.18) aan de schedel, aangezien een vierde schroef (anterieur aan de linker lambdoïde naad) de plaatsing van de bipolaire elektrode zou belemmeren.
    10. Haal een EMG-headstage uit de Petrischaal. Positioneer de headstage zodanig dat de 10T-draad zich aan de rechterkant van de rat bevindt. Buig de 10T-draad omhoog, parallel aan de onderrand van de microstrip. Buig deze licht naar de rechterkant, zodat de draad rond de anterieure en posterieure 0-80 schroeven kan lopen. Leg deze opzij, maar binnen bereik.
    11. [Uitgaande van een rechtshandige persoon] Houd een 3-inch dressingpincet in de linkerhand en een 4-inch dressingpincet in de rechterhand. Pak de bovenste huid bij de incisielocatie van het linkeroog vast met de 4-inch dressingpincet en richt de 3-inch dressingpincet naar de ooghoek; pak de huid bij deze hoek vast. Houd de grip met de 3-inch dressingpincet vast terwijl u de 4-inch dressingpincet loslaat.
    12. Neem een 26G x 3/8 in naald en steek deze door de hoek van het ooglid; roteer de naald zodat de schuine zijde naar boven wijst. Gebruik de micro-dissectiepincet met platform om de middelste 3T-draad in het gat van de naald te steken. Duw deze enkele centimeters door het gat zonder deze volledig door te steken; deze draad is de negatieve lead.
    13. Voer de procedures uit zoals beschreven in 4.2.11 en 4.2.12 om de buitenste 3T-draad in het middelste gedeelte van het ooglid te steken; deze draad is de positieve lead.
    14. Pak beide naalden met één hand vast terwijl u de headstage met de andere hand (of pincet) vastpakt. Trek de naalden in één continue beweging weg van het ooglid, terwijl u de headstage in dezelfde richting geleidt. Roteer de headstage indien nodig zodat de 10T-draad naar het rechteroog van het dier wijst; zorg dat de 3T-draden elkaar niet kruisen. Gebruik fijne pincetten om te controleren of de positieve lead zich in het midden van het ooglid bevindt.
    15. Stel de headstage zo af dat deze gecentreerd is tussen de ogen en zich in een optimale positie bevindt bovenop het frontale bot, anterieur aan de bilateraal geplaatste schroeven. Houd de headstage met één hand vast en de 3-inch dressingpincet met de andere hand. Wikkel de 10T-draad rond één of beide schroeven aan de 10T-zijde.
    16. Houd een 3-inch dressingpincet in de ene hand en een 4-inch dressingpincet in de andere hand. Gebruik de 3-inch dressingpincet om de huid bij de incisielocatie richting de linker slaap vast te pakken. Gebruik de 4-inch dressingpincet om een klein "zakje" te creëren door de huid (d.w.z. oppervlakkige fascia) van de musculus temporalis te scheiden. Gebruik de irisschaar om meer bindweefsel weg te knippen, werkend richting de hoek van het linkeroog, om de omvang van dit zakje te vergroten. Pas op dat u niet te diep gaat of bloedvaten doorsnijdt.
    17. Neem een bipolaire elektrode en vorm de draadleads zodanig dat ze langs de kromming van de musculus temporalis passen, terwijl de twee pinnen (dorsaal en ventraal) posterieur aan het linkeroog zijn gesitueerd (zie video), en het onderste uiteinde van de bipolaire elektrode recht op het schedeldak kan worden geplaatst. Houd voldoende afstand tussen de headstage en deze elektrode zodat de commutator-kabelstekkers (Figuur 3) zonder belemmering kunnen worden bevestigd.
    18. Giet dental cement-poeder in de smeltkroes - begin met ongeveer 1/3 van de smeltkroes en schaal de hoeveelheid indien nodig op. Voeg het vloeibare component toe tot de consistentie waterig is, en meng deze componenten met de spatel. Wanneer de consistentie van het cement viskeuzer wordt, brengt u het aan op de incisielocatie - waarbij alle randen van de huid met een rand van ten minste 1/8 inch worden bedekt.
      1. Breng voldoende cement aan om de headstage en bipolaire elektrode te verstevigen zonder dat de rat wordt belemmerd in het sluiten van beide ogen. Veeg snel eventueel cement weg dat op ongewenste plaatsen van de vacht van de rat druppelt.
    19. Zorg ervoor dat ten minste 4-5 windingen van de bipolaire elektrode niet door cement zijn afgesloten, zodat de bipolaire stekker kan worden aangedraaid (Figuur 3). Verwijder overtollig cement van de headstage - de bovenkant van de microstrip en de drie contactpinnen moeten schoon zijn. Het cement hardt snel uit en kan gemakkelijk de volledige koppeling van enige van deze elektroden aan de commutator-kabelstekkers belemmeren. Gebruik splintersplitterpincetten om overtollig cement te verwijderen dat gedeeltelijk is opgedroogd.
    20. Wacht tot het cement hard is; het wordt transparant. Gebruik de micro-dissectieschaar om de overtollige lengte van de twee 3T-draden weg te knippen, waarbij enkele centimeters werkruimte overblijven.
    21. Houd de micro-dissectiepincet met platform in de linkerhand en de micro-dissectiepincet met fijne punten in de rechterhand. Pak één 3T-draad vast met de linkerpincet iets voor het ooglid. Duw met de rechterpincet het ooglid op om meer van de 3T-draad bloot te leggen en houd dit vast. Laat de linkerpincet los en gebruik de linkerhand om de headstage vast te pakken (verzeker u ervan dat deze inmiddels stevig vastzit). Gebruik de rechterpincet om een deel van de PTFE-afscherming af te strippen, zodat de draad contact kan maken met de musculus orbicularis oculi.
      OPMERKING: Pas op dat u niet te hard aan een 3T-draad trekt, omdat deze kan losraken van de contactpin. Als een draad losraakt, is het niet mogelijk om de contactpin te vervangen, aangezien het uitgeharde cement niet gemakkelijk van de schedel zal loskomen zonder botbreuk te veroorzaken.
    22. Voer de stappen in 4.2.21 uit om overtollige PTFE van de tweede 3T-draad af te strippen.
    23. Houd de twee micro-dissectiepincetten vast zoals beschreven in 4.2.21 (platform links, fijne punten rechts). Positioneer de linkerpincet iets voor een 3T-draad, terwijl er ruimte wordt gelaten voor de rechterpincet direct voor het ooglid. Pak de draad met beide pincetten vast.
      1. Creëer een "haakje" door de rechterpincet stil te houden en de linkerpincet in één beweging omhoog en rond richting het ooglid te draaien. Laat voorzichtig eerst de rechterpincet en daarna de linkerpincet los.
        OPMERKING: Het haakvormig bevestigen van de elektroden aan de oogleden helpt om de kans te minimaliseren dat ze tegen het hoornvlies schuren. Dit minimaliseert ook de kans op draadbreuk tijdens enige fase van de gedragstests. Hoewel het haakvormig maken niet volledig voorkomt dat de draad tegen het hoornvlies schuurt bij alle dieren, vertonen zij doorgaans geen tekenen van oogschade, wat blijkt uit hun hoge knipperamplitudes (gemeten met de digitale oscilloscoop in 5.1.7) en uit dagelijkse post-operatieve gezondheidsobservaties (overmatige traanvorming, gedeeltelijke sluiting van het ooglid, gebrek aan mobiliteit door oogschade). Als een rat initiële tekenen van ongemak vertoont, wordt deze geanestheseerd met isofluraan (zie 4.1.10) en worden de elektroden opnieuw onderzocht en/of geplaatst. Er wordt oogzalf aangebracht om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. De rat wordt dagelijks geobserveerd op post-procedurele oogcomplicaties; indien deze aanhouden, wordt veterinaire zorg gezocht. Ratten die ernstige oogcomplicaties vertonen die niet kunnen worden gecorrigeerd door herplaatsing van de elektrode of veterinaire behandeling, worden humaan geëuthanaseerd volgens de standaardprocedures van de ECU IACUC.
    24. Voer de stappen in 4.2.23 uit voor de tweede 3T-draad. Knip overtollige draad weg met de micro-dissectieschaar.
    25. Gebruik één hand om de rat uit de oorstaven te bevrijden, terwijl u het lichaam met de andere hand ondersteunt. Inspecteer de kop op bloed of resten, maak indien nodig schoon, en geef een post-operatieve injectie buprenorfine.
    26. Plaats de rat in een herstelbak met een warmtebron (zoals een thermoreguleerbare waterwarmtemat) om het herstel te bevorderen. Noteer de eindtijd van de operatie in het operatielogboek en eventuele relevante aantekeningen over de rat tijdens de operatie. Monitor de rat op een goede ademhaling; zodra deze in sternale recumbens ligt of zich beweegt, kan de rat terug naar de thuiskooi worden gebracht.
    27. Steriliseer de instrumenten opnieuw (behalve de micro-dissectiepincetten - deze kunnen beschadigd raken) met de parelsterilisator en zorg dat de chirurgische zone aseptisch blijft; herhaal de aseptische procedures als er meerdere ooglidoperaties worden uitgevoerd.

5. Procedure voor klassieke conditionering van het oogknipperreflex

figure-protocol-2
Figuur 3: Gemodificeerde operante conditioneringsbox voor oogknipperconditionering. Ratten zijn vrij bewegende zoogdieren; daarom wordt een roterende commutator gebruikt om het elektrische signaalcontact te behouden van de EMG en bipolaire stekkers die aan de kop zijn bevestigd. De commutator is bevestigd aan de arm van de steunpaal, die is voorzien van een contragewicht om de druk op de rat te verminderen. Een piezo tweeter (luidspreker) zendt een toon van 2,8 kHz uit bij 85 dB, en deze waarden worden regelmatig gekalibreerd. Akoestisch schuim helpt bij het dempen van omgevingsruis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 4: Systeem voor eyeblink-conditionering. Dit op maat gebouwde systeem bestaat uit een EMG-integratoreenheid die inkomende signalen van de ratten filtert en versterkt, een stimuluscontrole-eenheid die diverse stimuli levert naast tonen en schokken, een voorversterker voor elke operante box om de EMG-signaalversterking te verhogen, en een stimulusisolator voor elke operante box; het biedt variabele schokniveaus (in mA). Een digitale oscilloscoop (geen onderdeel van het standaard eyeblink-systeem) wordt voor diagnostische doeleinden gebruikt tijdens habituatie en acquisitie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Begin de habituatie- en acquisitietraining 5 dagen na de operatie. Geef elke rat één dag handling en habituatie aan het trainingsapparaat - bestaande uit een gemodificeerde operante conditioneringsbox die is geplaatst in een grotere, geluidsgedempte kamer (Figuur 3) - gevolgd door 6 dagen acquisitietraining. Voer de habituatie- en acquisiesessies uit met behulp van een op maat gebouwd oogknipper-systeem (Figuur 4).
    1. Maak een trainingslogbestand aan en print dit uit om te gebruiken voor de dagelijkse verslaglegging. In dit logboek moeten de groepen ratten pseudo-willekeurig (of via een andere randomisatiemethode) zijn toegewezen aan hun trainingsboxen.
    2. Zet het eyeblink-systeem en de computer aan en start de eyeblink-software. Deze versie van de software bevat verschillende modules (of applicaties) die onafhankelijk van elkaar werken. Start de Animal-module om een *.RAT-bestand aan te maken waarin de subjectinformatie is opgenomen (sessienummer, dier-ID, geslacht, gewicht en kooinummer). Eén enkel RAT-bestand beheert maximaal vier ratten, wat een groep subjecten vormt. Voer de waarden dienovereenkomstig in en sla het bestand op. Maak voor elke groep ratten die getraind moet worden een apart RAT-bestand aan.
    3. Verplaats de ratten van hun vivarium naar de testruimte en sluit de deur. Handel elke rat gedurende 5 min.
    4. Plaats de rat in de toegewezen box en sluit de EMG- en bipolaire stekkers van de commutatorabel aan op de overeenkomstige EMG-headstage en bipolaire elektrode op de kop.
      OPMERKING: Bij het eerste contact met de commutator kabel kan een rat worstelen en tekenen van stress vertonen. Behandel de rat voorzichtig en las pauzes in tussen mislukte bevestigingen om de stress te verminderen.
    5. Gebruik een commutator die roteert 360° terwijl de elektrische signaaloverdracht en -ontvangst behouden blijven terwijl een rat zich vrij beweegt binnen een box. Het beschikt over 5 kanalen (3 voor de EMG-elektroden, 2 voor de bipolaire elektroden) die leiden naar de EMG-integratoreenheid, die het ruwe signaal filtert en versterkt.
    6. Stel vast dat de rat zich vrij kan bewegen en dat deze niet wordt gehinderd door het gewicht van de commutator kabelassemblage of de arm van de stanchion. Pas indien nodig het contragewicht aan de achterzijde van de stanchion aan. Controleer of alle stekkers goed vastzitten en sluit vervolgens de deur van de kooi. Voer dezelfde aansluitings- en controleprocedure uit voor alle ratten.
    7. Gebruik een oscilloscoop om hun EMG-activiteit op abnormale signalen te controleren (bijv. hoogfrequente en/of hoogamplitude elektrische activiteit) en, indien beschikbaar, een videobewakingssysteem om hun status te controleren (bijv. motorische activiteit, gevoeligheid voor de omgeving, tekenen van pijn). Noteer alle geobserveerde problemen in het trainingslogboek.
    8. Laat de ratten 10 minuten wennen aan hun kamers en plaats ze vervolgens terug in hun thuiskooien.
    9. Reinig en desinfecteer de operante boxen, veeg de vloer en maak de tafel(s) schoon. Voer deze procedures na elke sessie uit.
  2. De acquisitietraining vindt plaats over 6 opeenvolgende dagen (sessies).
    1. Dag 1: Plaats een rat in de toegewezen box en verbind de EMG- en bipolaire stekkers van de commutator kabel met de overeenkomstige EMG-headstage en bipolaire elektrode op de kop. Voer dezelfde procedures uit als aangegeven in 5.1.6 en 5.1.7.
    2. Schakel de stimulusisolatoren in en stel de toe te dienen stroom in op 0,4 mA (4% van 10 mA, zoals getoond in de video). De isolatoren leveren de elektrische stroom afwisselend (d.w.z. van trial tot trial) tussen de dorsale en ventrale pinnen van de bipolaire elektrode. Dit helpt om spiervezelvermoeidheid (op elke spierlocatie) bij herhaaldelijke stimulusstimulaties te verminderen.
    3. Observe alle knipperreacties en toleranties die bij elke trial door alle ratten worden vertoond. Verhoog na elke tweede trial de intensiteit van de schok-US met 0,4 mA voor elke rat, totdat 1,6 mA is bereikt (bij trial 7 en 8). Controleer zorgvuldig of alle ratten normaal reageren in hun kooien, of alle versterkings- en gain-instellingen constant zijn en of de elektrische signalen (d.w.z. weinig/minimale EMG-ruis) correct zijn. Gebruik een schok-US-intensiteit van 1,6 mA voor alle dagen van de acquisitietraining.
      OPMERKING: Indien een rat pijn vertoont bij een bepaald schokniveau (bijv. hoog van de vloer springen, tegen muren opklimmen, rondrennen), wordt de proef gepauzeerd en keert de rat voor twee proeven terug naar de vorige mA-instelling (0,4 mA lager). Daarna ontvangt de rat opnieuw de hogere schokwaarde die niet werd getolereerd; indien tolerantie wordt getoond, ontvangt de rat toenemende waarden tot 1,6 mA is bereikt. Indien de rat geen enkele waarde kan tolereren, wordt de eerstvolgende lagere waarde (in stappen van 0,4) die wel wordt getolereerd, gedurende de gehele training gebruikt.
    4. Gebruik een oscilloscoop om hun EMG-activiteit op abnormale signalen te observeren (bijv., hoogfrequente en/of hoogamplitude elektrische activiteit) en een videosurveillancesysteem om hun status te controleren (bijv., motorische activiteit, gevoeligheid voor de omgeving, tekenen van pijn).
      OPMERKING: Toelichting op Trace ECC: Een representatief trial-epoch met vastgelegde EMG-golfvormen is geïllustreerd in Figuur 1 en de procedure voor trace ECC wordt in detail in de video uitgelegd. Het trainingsbestand voor trace conditioning is zo ingesteld dat er 100 trials worden geleverd (90 gekoppelde CS-US trials en 10 CS-only trials per 10th proef) met een gemiddeld interval tussen de proeven van 30 sec. De volledige trainingssessie duurt ongeveer 52 min (ervan uitgaande dat er geen onderbrekingen zijn). Alle ratten zijn naïef in sessie 1 en zullen differentiële leercurves ontwikkelen (bepaald door de expressie van CR's) naarmate ze vorderen gedurende meerdere dagen van training.
    5. Start de training: Start de Blink-softwaremodule. Selecteer, wanneer daarom wordt gevraagd, het juiste RAT-bestand en het trainingsbestand voor "spoormeting" conditionering van het oogknipperreflex
    6. Noteer de starttijd en de naam van de experimentator in het trainingslogboek. Controleer op dit punt alle activiteiten: correcte EMG-signalen, goede knipperresponsen op de schok-US (d.w.z. hoge/frequente UR's), de gezondheidstoestand van de dieren en de juiste werking van de hardware. Noteer alle relevante opmerkingen in het trainingslogboek.
    7. De gegevensverzameling wordt automatisch door de software vastgelegd als RAW-bestanden (één per rat, per dag). De RAW-bestanden bevatten de EMG-amplitude (in volts), frequentietellingen, latentie en areaalgegevens voor schrikreacties (SR's), UR's en CR's (totaal en adaptief). Het schokartefact maskeert de eerste 100 ms van de UR-periode; daarom bevatten alleen de laatste 140 ms van de UR-periode UR-gegevens.
    8. Aan het einde van de training zal de software automatisch sluiten. Haal alle ratten uit hun trainingsdozen en breng ze terug naar het vivarium.
    9. Herhaal stappen 5.2.5 - 5.2.6 voor alle volgende trainingsdagen. Voordat u op een bepaalde dag met de Blink-module begint, werkt u het sessienummer in het RAT-bestand bij. Dit maakt de creatie van nieuwe RAW-bestanden mogelijk voor alle ratten op die dag. Elke rat moet 6 RAW-bestanden hebben, uitgaande van het feit dat er geen ratten uit de training zijn verwijderd.
  3. Verwerk de RAW-bestanden en maak een bestand dat is gefilterd voor statistische analyse.
    1. Voer de Analysis-module uit. Beoordeel elke sessie voor elke rat op trial-niveau om problematische trials te identificeren. Dit wordt gedaan om trials te screenen die mogelijk gecompromitteerd zijn door verschillende redenen (bijv., overmatige baseline-activiteit vóór de CS, overmatige beweging, loslaten van elektroden, problemen met bekabeling/bedrading). De software beschikt over algoritmen die de experimentator helpen bij het detecteren en verwijderen van "mislukte proeven" om deel uit te maken van de gefilterde dataset.
    2. Importeer de gefilterde gegevens in een spreadsheetprogramma en voer de relevante statistische analyses uit.

Resultaten

De eyeblink-software is geschikt voor een grote en uitgebreide verzameling van gegevens te voorzien van vele soorten metingen. Voor beknoptheid, rapporteren we in deze studie, vertegenwoordiger resultaten voor leren en prestaties maatregelen waaronder adaptieve CR percentage, adaptieve CR amplitude, UR percentage en UR amplitude. De adaptieve CR-periode werd gekozen als het vertegenwoordigt de verwerving van een goed getimede eyeblink reacties over herhaalde opleiding, als gevolg van verbeterde synaptische plasticiteit in de hippocampus tijdens trace ECC50,51,52. De UR-maatregelen werden gekozen om te verhelderen of de neonatale alcohol-geïnduceerde leren tekorten in ECC waren als gevolg van storingen in associative leren of verstoringen traceren in het reageren op de schok ons - die op motiverende of motor verschillen, in plaats van leren verschillen tussen behandelgroepen wijzen kunnen. Gegevens voor elke maatregel zijn geanalyseerd met behulp van 2 (seks) x 3 (neonataal groep) x 6 (sessie) gemengd ANOVAs, met een sessie als de factor herhaald-maatregelen. Belangrijke belangrijkste gevolgen voor neonatale behandeling zijn geanalyseerd met behulp van Tukey post hoc tests en belangrijke interacties werden geanalyseerd met behulp van eenvoudige effecten proeven. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met een minimale alfaniveau van 0,05 en resultaten in grafieken zijn gemiddelde ± SEM.

Beginnend met de adaptieve CR percentage maatregel, de ANOVA aangegeven een belangrijke belangrijkste effect van neonatale groep, F(2,21) 11.69, p = < 0.001, maar geen significant belangrijkste effect van geslacht (p = 0.71) of belangrijke interactie tussen deze elementen (p = 0,20). Zoals verwacht, adaptieve CR percentage verhoogd de zes sessies van opleiding, F(5, 105) = 81.15, p < 0.001, en de verschillen tussen de neonatale groepen waren afhankelijk van enige mate van sessie, F(10, 105) = 4,58, p < 0,001. Er waren geen andere belangrijke interacties met betrekking tot de factor van de sessie. Ook voor adaptieve CR amplitude, was er weer een aanzienlijke belangrijkste effect van neonatale groep, F(2,21) 22.32, p = < 0.001, maar geen significant belangrijkste effect van geslacht (p = 0.21) of belangrijke interactie tussen deze elementen (p = 0,48). CR amplitude ook aanzienlijk toegenomen de zes sessies van opleiding, F(5, 105) = 59.27, p < 0.001, en de verschillen tussen de neonatale groepen waren afhankelijk van enige mate van sessie, F(10, 105) 4.31, p = < 0,001. Globaal, beide maatregelen CR toonde significante verschillen tussen de groep middelen en deze middelen gescheiden aanzienlijk bij de verschillende sessies van de opleiding. Om te bevestigen welke groepen verschilde aanzienlijk, van Tukey post hoc tests bleek dat de ratten (AI) alcohol-intubated uitgevoerd aanzienlijk slechter op beide CR maatregelen dan de unintubated-control (UC) en de sham-intubated (SI) ratten (p < 0,01 voor CR percentage; p < 0.001 voor CR amplitude), die niet van elkaar verschillen (p's> 0,05). Eenvoudige effecten proeven uitgevoerd op de aanzienlijke neonataal groep x sessie interacties voor beide maatregelen CR, bevestigd dat de AI rats belangrijker is in het verwerven van CRs begint bij sessie 2 en t/m 6 van de sessie op te voeren ten opzichte van zowel UC en SI ratten werden aangetast (alle p's< 0,05), die niet van elkaar verschillen gedurende zes sessies. De enige uitzondering was adaptieve CR amplitude SI ratten begonnen niet significant afwijken van AI ratten tot sessie 3. Deze resultaten worden weergegeven in figuur 5A, 5B.

Er waren geen significante verschillen in de UR maatregelen als gevolg van seks, neonatale groep of interacties van deze factoren met de factor van de sessie. Deze negatieve bevindingen aangegeven dat elke groep was in staat om het uitzenden van eyeblink reacties op de schokken ons even, en dat de tekorten van de leren waargenomen in de AI-ratten niet werden beïnvloed door motiverende of motor verschillen in knipperen (figuur 6A, 6B).

figure-results-1
Figuur 5 : Overname van trace geconditioneerd reagerende (gemiddelde ± SEM). Vroege alcohol blootstelling (groep AI) sterk beïnvloed verwerving van adaptieve geconditioneerde reactie (CR) percentage (A) en de amplitude (B). Trace ECC is inherent moeilijk te verwerven, daarom de maatregelen zijn relatief lagere voor alle groepen - met vertraging ECC, percentages oplopen tot 80-85% in knaagdier modellen van FAS21,53. De trace ECC procedure is echter meer belasting op de hippocampus, die tijdens de vroege ontwikkeling van de hersenen is gevoelig voor de effecten van alcohol. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0.001 tussen UC en AI ratten; omvang van de steekproeven worden geleverd in haakjes. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 6 : Verwerving van unconditioned Reacties (bedoel ± SEM). Eyeblink prestaties (UR percentage en UR amplitude) was niet significant verschillend tussen groepen. Het ontbreken van verschillen aangeven dat de intensiteit van de schok gebruikt tijdens de acquisitie training motivatie in de AI-ratten niet differentieel gewijzigd of hun vermogen om te produceren defensieve reacties op de schok, in vergelijking met beide controlegroepen (UC en SI) knipperen. Omvang van de steekproeven worden geleverd in haakjes. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

Neonatale rat pups die ethylalcohol tijdens postnatale dagen 4-9 ontvangen tentoongesteld trace eyeblink conditioning bijzondere waardeverminderingen in de volwassenheid. Deze bevindingen ondersteunen de idee dat alcohol een teratogen is met blijvende schadelijke gevolgen voor de hippocampal functie. Algemene, geconditioneerde reageert in de trace-procedure was lager voor ratten blootgesteld aan alcohol in vergelijking met ratten in beide controlegroepen. De waardeverminderingen op associative leren in de rats alcohol-blootgesteld werden niet beïnvloed door motiverende of motor verschillen (dwz., geen verschillen in het knipperen aan schok U.S. intensiteit).

Terwijl trace ECC een handig diagnostisch hulpmiddel voor informatief uitdaging-geïnduceerde hippocampal Neuropathologie is, moeten de resultaten van deze methode worden geplaatst in de juiste context. Ten eerste, de belangrijkste procedurele elementen in deze demonstratie betrokken de gerichte levering van alcohol tijdens een bekende venster van de kwetsbaarheid voor de ontwikkelende hersenen, fabricage van elektrode hardware waarmee opname van Electromyografische activiteit en levert shock, chirurgische implantatie van de bovengenoemde hardware en latere dierproeven met behulp van een leren paradigma dat een cognitieve functie van belang beoordeelt. In elke fase in het proces, moet worden gezorgd om geen onnodige/onbedoelde schade toebrengen aan de knaagdier onderwerpen en regelmatig te controleren hun gezondheidssignalering. Hun gedrags resultaten bieden de "venster" naar cognitie, een psychologische construct dat alleen nauwkeurig beschreven wanneer hun gezondheid niet in gevaar komt door experimentele fouten omvat alcohol doseren, hardware defecten of chirurgische implantatie. Elk procedurele element in het onderzoeksproces moet dus worden uitgevoerd op een verantwoorde wijze om ervoor te zorgen dat de resultaten van ECC kunnen worden geëxtrapoleerd naar de bevindingen bij de mens. Ten tweede, het ECC paradigma geeft inzicht over de aard van de associative leren, maar wees voorzichtig niet om uit te breiden bevindingen met behulp van deze aanpak in grote lijnen het toeschrijven van hen aan andere cognitieve domeinen - zoals werkgeheugen, korte/lange termijn herinneringen en bewustzijn - tenzij een sommige facet van deze domeinen binnen een ECC studie door experimenteel design heeft opgenomen. Bijvoorbeeld, deze demonstratie onderzocht de fase overname van trace ECC leren, maar heeft niet onderzocht geheugen bewaren in de rats nadat zij de opleiding voltooid. Geheugen is dus een onafhankelijke psychologische proces dat naast leren moet worden geëvalueerd. Bij het ontwerp, kan een een geheugen retentie interval om te beoordelen of vermogen op korte termijn of lange termijn geheugen opnemen. Ten derde is zijn er parallelle geheugen systemen54 die gelijktijdig kunnen werken samen met motiverende, ervaringsgerichte en hormonale factoren die aan gedrag bijdragen, erkenning essentieel voor dien verstande dat associativiteit (tijdens ECC) is maar een van de vele processen die wat is onthullen "goed" of "slecht" over leren. Tot slot, trace ECC is niet een zuiver hippocampal-afhankelijke taak, zoals andere hersengebieden sommige component van de CR kunnen bemiddelen. Een goed begrip van de interacties tussen de verschillende neurale circuits en/of het soort stimulans parameters die worden gebruikt in een studie, moet dus rekening worden gehouden bij het maken van de gevolgen die berust op discrete resultaten. Het cerebellum, bijvoorbeeld, draagt ook bij aan trace ECC, waar het beïnvloedt de topografische kenmerken van de CR en CR timing, met name wanneer de ISI is kort van duur. Trace ECC niet wordt beïnvloed bij mensen met cerebellaire schade die worden getest met een lange trace interval (1000 ms), maar bij degenen die een kortere trace interval (400 ms)34ontvangen wordt beïnvloed. Bovendien voorkomen bilaterale laesies van de dorsale mediale prefrontale cortex (mPFC) die gericht zijn op de regio anterior cingularis en mediale agranular's in muizen, overname van trace CRs55, terwijl de vernietiging van de caudal mPFC bij konijnen produceert soortgelijke resultaten46. Deze bevindingen benadrukken ook het belang rekening te houden met soorten verschillen in de prefrontale bijdragen aan cerebellaire-hersenen het gevolg gedreven associative leren, zoals trace ECC. Terwijl neonatale alcohol blootstelling tijdens PD 4-9 aangetast verwerving van 500-ms trace CRs voor volwassen in deze studie en anderen47,56 ratten, is dit niet het zelfde geval voor neonatale alcohol-blootgesteld ratten die zich voordoen van een 300-ms trace interval, zelfs wanneer uitgedaagd bij een relatief hoge dosis van alcohol (5 g/kg)57, suggereert dat de waardevermindering van de trace bij alcohol-blootgesteld ratten afhankelijk van de duur van het interval trace is.

In deze studie werd de hippocampus als uitermate belangrijk voor het bemiddelen van trace ECC, en als uitgedaagd door neonatale alcohol blootstelling, neurale-gerelateerde schade vertoont, zoals weerspiegeld door waardeverminderingen in overname van trace CRs benadrukt. Het moet waarschuwde echter dat het cerebellum-hersenen stam circuits, met name de interpositus kern, is essentieel voor de vele facetten van ECC, waaronder de verwerving, expressie en topografische kenmerken van de CR, afhankelijk van het type van taak van de ECC met inbegrip van trace ECC36,40,55,58,59. Inderdaad, dit neurale circuit interageert met de hippocampus voor het besturen van de expressie van CRs tijdens hogere-orde vormen van ECC, zoals trace ECC60. Het is niet geheel duidelijk of alcohol blootstelling tijdens de vroege ontwikkeling van de hersenen specifiek hippocampal functie in trace ECC beïnvloedt. Veel verschillende hersengebieden zijn kwetsbaar voor vroege alcohol belediging, met inbegrip van de mPFC, het cerebellum en de hippocampus18,19,23,47,61,62, en het is zeer waarschijnlijk dat alcohol verstoort de werking van deze structuren voor wisselend en variërend, maar functioneel belangrijke verschillen over vele ECC procedures. Ondanks de valkuilen betreffende de interpretatie van de resultaten van de trace ECC studies, is succesvolle overname van trace CRs aangetoond ten minste vertrouwen op een intact hippocampus, zoals ondersteund door dierlijke laesie studies42,44,63,64,,65. Deze procedure blijft dus een zeer waardevolle benadering voor het aantonen van de verbanden tussen ontwikkelings alcohol blootstelling aan trace geconditioneerd reageren omdat de neurale circuits die ten grondslag liggen aan het, is veel beter begrepen dan die van andere hippocampal-afhankelijke taken, zoals het leren van de plaats in de Morris water maze, roman objectherkenning, en contextuele- and -trace angst conditionering.

ECC als een gedrags methode om te "assay" cognitie, heeft brede toepasbaarheid op het gebied van developmental neuroteratology. Inderdaad, recente bevindingen uit ons lab ondersteunen het idee dat de ontwikkelingslanden hippocampus is zeer gevoelig voor de effecten van alcohol, die kunnen worden verzacht door verschillende Interventionele strategieën18,47. Het belangrijkste voordeel hier is dat met een beter begrip van de alcohol-geïnduceerde trace ECC leren tekorten, kunnen zij voorspellende van andere problemen in de hippocampal gebaseerde functies buiten associative leren - met name die bekend worden gemedieerd door de zelfde hippocampal neurocircuitry.

Toepassing van trace ECC en andere varianten (bijvoorbeeldvertraging, omkering, discriminatie, samengestelde) ophelderen van de neurobiologische mechanismen en neurale systemen die betrokken zijn bij het leren van de associative, kan worden uitgebreid buiten het gebied van foetaal alcohol onderzoek. Dit paradigma heeft bijvoorbeeld veel aandacht gekregen in de gevallen bij de mens en dierlijke modellen van psychiatrische aandoeningen zoals schizofrenie66,67, neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer68,69en drugs misbruik70,71,72. De voordelen ervan als een onderzoeksmethode te beoordelen Neurocognitieve functie en dysfunctie zijn dus duidelijk in veel psychologische en biomedische disciplines, met inbegrip van de neurowetenschappen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door een subsidie aan TDT uit de Alcohol Beverage Medical Research Foundation (ABMRF).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Neonatal Alcohol Exposure
190 Proof Ethyl Alcohol (USP)Pharmco-AAPER225-36000 [ECU Medical Storeroom]Kan worden vervangen; moet USP zijn; vermijd het gebruik van 200 proof ethyl alcohol
Container/Mandje voor PupsAny
Corn OilAnyFood grade
Verwarmde watertherapiepomp met padsGaymarTP-500Om pups warm te houden; kan worden vervangen
Hypodermische naalden 22G x 1 inch, sterieleAny
Hypodermische naalden 30G x 1/2 inch, sterieleAny
Isopropyl Alcohol 70%EMD MilliporePX1840-4 [Fisher Scientific]Kan worden vervangen; reagent grade
www.fishersci.com
Long-Evans Rats (Vrouwelijke en Mannelijke Fokkers)Charles River LaboratoriesN/A [ECU Dept. of Comparative Medicine]Leeftijd en gewicht moeten worden gespecificeerd; prijzen variëren op basis van deze factoren
www.criver.com
Micro-dissectiescharen, 3.5 inch, 23 mm BladenBiomedical Research Instruments11-2200Voor het snijden van PE-buis
brisurgical.com
Polyethyleen 10 Buizen (0.011 inch I.D.; 0.024 inch O.D.)BD Diagnostic Systems22-204008 [Fisher Scientific]Kan worden vervangen
www.fishersci.com
Polyethyleen 50 Buizen (0.023 inch I.D.; 0.038 inch O.D.)BD Diagnostic Systems22270835 [Fisher Scientific]Kan worden vervangen
www.fishersci.com
Geregelde waterverwarmer of babymelkflesverwarmerAnyOptioneel; helpt bij het opwarmen van koude meloplossingen
Tuberculin-spuiten, steriele, 1.0 mlAny
Tuberculin-spuiten, steriele, 10 mlAnyKan worden gebruikt om ethyl alcohol te verwijderen of een geschikte micropipetgrootte te gebruiken
WeegschaalAnyMoet een goede resolutie hebben (in grameenheden)
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
EMG Headstage Fabricage en Bipolaire Electrode Wijziging
Bipolaire Electrode, 2 Kanaals SS TwistedPlastics One, Inc.MS303/2-B/SPC  ELECT SS  2C TW.008"Moet een aangepaste lengte van 20 mm onder het voetstuk specificeren
www.plastics1.com
Centi-Loc Strip Socket Isolatie (ook wel Micro Strip genoemd)ITT Cannon / ITT Interconnect SolutionsCTA4-IS-60* of CTA4-1S-60**Afhankelijk van leverancier; zie www.onlinecomponents.com of www.avnetexpress.avnet.com
Tandartstangen, GekarteldCMF Medicon390.20.05Kan worden vervangen; gebruikt om draden op mannelijke contactpennen te crimpen
www.medicon.de
Micro-dissectiescharen, 3.5 inch, 23 mm BladenBiomedical Research Instruments11-2200Alleen gebruiken om 3T draden te snijden; het snijden van 10T draden zal het mes beschadigen - gebruik in plaats daarvan de kling van de draadstripper
brisurgical.com
PTFE-gecoate roestvrijstalen draad, 10T (Naakte Diameter.010 inch)Sigmund Cohn-Medwire316SS10T
www.sigmundcohn.com
PTFE-gecoate roestvrijstalen draad, 3T (Naakte Diameter 0.003 inch)Sigmund Cohn-Medwire316SS3T
www.sigmundcohn.com
ScheermesjeAnyOm 1 mm van de prongs van de bipolaire elektrode te verwijderen
Relia-Tac-contactpen, MannelijkCooper Interconnect220-P02-100Zie Allied Electronics Cat # 70144761
www.alliedelec.com
Pincet, Hoogprecies, Gekarteld, 4 3/4 inchElectron Microscopy Sciences78314-00DOm 10T draad stevig vast te grijpen tijdens het strippen van PTFE met glad pincet
www.emsdiasum.com
Pincet, Hoogprecies, Glad, 4 3/4 inchElectron Microscopy Sciences78313-00B
www.emsdiasum.com
Pincet, Ultra Fijne Punten, 4 3/4 inchElectron Microscopy Sciences78510-0Om 1 mm PTFE van een uiteinde van 3T draad te verwijderen; pak beschermde porties met glad pincet
www.emsdiasum.com
Draadstripper, 16-26 AWGAnyGebruik de kling-eind om microstrips te snijden
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ooglidchirurgie
Chirurgische Instrumenten (Hoge Kwaliteit Roestvrij Staal)
2 x Dressing Forceps,

Referenties

  1. Jones, K. L., Smith, D. W. Recognition of the fetal alcohol syndrome in early infancy. Lancet. 2, 999-1001 (1973).
  2. Stratton, K. R., Howe, C. J., Battaglia, F. C. Fetal alcohol syndrome: Diagnosis, epidemiology, prevention, and treatment. , National Academy Press. (1996).
  3. Streissguth, A. P., Barr, H. M., Martin, D. C., Herman, C. S. Effects of maternal alcohol, nicotine, and caffeine use during pregnancy on infant mental and motor development at eight months. Alcohol Clin Exp Res. 4 (2), 152-164 (1980).
  4. Streissguth, A. P., O'Malley, K. Neuropsychiatric implications and long-term consequences of fetal alcohol spectrum disorders. Semin Clin Neuropsychiatry. 5 (3), 177-190 (2000).
  5. May, P. A., et al. Prevalence and epidemiologic characteristics of FASD from various research methods with an emphasis on recent in-school studies. Dev Disabil Res Rev. 15 (3), 176-192 (2009).
  6. Sowell, E. R., et al. Mapping callosal morphology and cognitive correlates: Effects of heavy prenatal alcohol exposure. Neurology. 57 (2), 235-244 (2001).
  7. Sowell, E. R., et al. Abnormal development of the cerebellar vermis in children prenatally exposed to alcohol: Size reduction in lobules I-V. Alcohol Clin Exp Res. 20 (1), 31-34 (1996).
  8. Autti-Ramo, I., et al. MRI findings in children with school problems who had been exposed prenatally to alcohol. Dev Med Child Neurol. 44 (2), 98-106 (2002).
  9. Hamilton, D. A., Kodituwakku, P., Sutherland, R. J., Savage, D. D. Children with Fetal Alcohol Syndrome are impaired at place learning but not cued-navigation in a virtual Morris water task. Behav Brain Res. 143 (1), 85-94 (2003).
  10. Uecker, A., Nadel, L. Spatial but not object memory impairments in children with fetal alcohol syndrome. Am J Ment Retard. 103 (1), 12-18 (1998).
  11. Uecker, A., Nadel, L. Spatial locations gone awry: object and spatial memory deficits in children with fetal alcohol syndrome. Neuropsychologia. 34 (3), 209-223 (1996).
  12. Goodlett, C. R., Lundahl, K. R. Temporal determinants of neonatal alcohol-induced cerebellar damage and motor performance deficits. Pharmacol Biochem Behav. 55 (4), 531-540 (1996).
  13. Goodlett, C. R., Kelly, S. J., West, J. R. Early postnatal alcohol exposure that produces high blood alcohol levels impairs development of spatial navigation learning. Psychobiol. 15, 64-74 (1987).
  14. Bayer, S. A., Altman, J., Russo, R. J., Zhang, X. Timetables of neurogenesis in the human brain based on experimentally determined patterns in the rat. Neurotoxicol. 14 (1), 83-144 (1993).
  15. Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Arch Dis Child. 48 (10), 757-767 (1973).
  16. West, J. R. Fetal alcohol-induced brain damage and the problem of determining temporal vulnerability: A review. Alcohol Drug Res. 7 (5-6), 423-441 (1987).
  17. Zecevic, N., Rakic, P. Differentiation of Purkinje cells and their relationship to other components of developing cerebellar cortex in man. J Comp Neurol. 167, 27-48 (1976).
  18. Rufer, E. S., et al. Adequacy of maternal iron status protects against behavioral, neuroanatomical, and growth deficits in fetal alcohol spectrum disorders. PLoS One. 7 (10), e47499(2012).
  19. Tran, T. D., Kelly, S. J. Critical periods for ethanol-induced cell loss in the hippocampal formation. Neurotoxicol Teratol. 25 (5), 519-528 (2003).
  20. Pierce, D. R., Goodlett, C. R., West, J. R. Differential neuronal loss following early postnatal alcohol exposure. Teratology. 40 (2), 113-126 (1989).
  21. Tran, T. D., Jackson, H. J., Horn, K. H., Goodlett, C. R. Vitamin E does not protect against neonatal ethanol-induced cerebellar damage or deficits in eyeblink classical conditioning in rats. Alcohol Clin Exp Res. 29 (1), 117-129 (2005).
  22. Goodlett, C. R., Peterson, S. D., Lundahl, K. R., Pearlman, A. D. Binge-like alcohol exposure of neonatal rats via intragastric intubation induces both Purkinje cell loss and cortical astrogliosis. Alcohol Clin Exp Res. 21 (6), 1010-1017 (1997).
  23. Green, J. T., Tran, T. D., Steinmetz, J. E., Goodlett, C. R. Neonatal ethanol produces cerebellar deep nuclear cell loss and correlated disruption of eyeblink conditioning in adult rats. Brain Res. 956, 302-311 (2002).
  24. Cronise, K., Marino, M. D., Tran, T. D., Kelly, S. J. Critical periods for the effects of alcohol exposure on learning in rats. Behav Neurosci. 115 (1), 138-145 (2001).
  25. Tran, T. D., Cronise, K., Marino, M. D., Jenkins, W. J., Kelly, S. J. Critical periods for the effects of alcohol exposure on brain weight, body weight, activity and investigation. Behav Brain Res. 116 (1), 99-110 (2000).
  26. Steinmetz, J. E. Brain substrates of classical eyeblink conditioning: A highly localized but also distributed system. Behav Brain Res. 110 (1-2), 13-24 (2000).
  27. Thompson, R. F. The neurobiology of learning and memory. Science. 233 (4767), 941-947 (1986).
  28. Ivkovich, D., Eckerman, C. O., Krasnegor, N. A., Stanton, M. E. Eyeblink classical conditioning: Vol. 1 Applications in humans. Woodruff-Pak, D. S., Steinmetz, J. E. , Kluwer Academic Publishers. 119-142 (2000).
  29. Woodruff-Pak, D. S., Steinmetz, J. E. Eyeblink classical conditioning: Volume I - Applications in humans. , Kluwer Academic Publishers. (2000).
  30. Woodruff-Pak, D. S., Steinmetz, J. E. Eyeblink classical conditioning: Volume II - Animal models. , Kluwer Academic Publishers. (2000).
  31. Kishimoto, Y., et al. Implicit Memory in Monkeys: Development of a Delay Eyeblink Conditioning System with Parallel Electromyographic and High-Speed Video Measurements. PLoS One. 10 (6), e0129828(2015).
  32. Chen, L., Bao, S., Lockard, J. M., Kim, J. K., Thompson, R. F. Impaired classical eyeblink conditioning in cerebellar-lesioned and Purkinje cell degeneration (pcd) mutant mice. J Neurosci. 16 (8), 2829-2838 (1996).
  33. Freeman, J. H. Jr, Carter, C. S., Stanton, M. E. Early cerebellar lesions impair eyeblink conditioning in developing rats: Differential effects of unilateral lesions on postnatal day 10 or 20. Behav Neurosci. 109 (5), 893-902 (1995).
  34. Gerwig, M., et al. Trace eyeblink conditioning in patients with cerebellar degeneration: Comparison of short and long trace intervals. Exp Brain Res. 187 (1), 85-96 (2008).
  35. LaBar, K. S., Disterhoft, J. F. Conditioning, awareness, and the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 620-626 (1998).
  36. McCormick, D. A., Steinmetz, J. E., Thompson, R. F. Lesions of the inferior olivary complex cause extinction of the classically conditioned eyeblink response. Brain Res. 359 (1-2), 120-130 (1985).
  37. Clark, R. E., Zola, S. Trace eyeblink classical conditioning in the monkey: a nonsurgical method and behavioral analysis. Behav Neurosci. 112 (5), 1062-1068 (1998).
  38. Anderson, B. J., Steinmetz, J. E. Cerebellar and brainstem circuits involved in classical eyeblink conditioning. Rev Neurosci. 5 (3), 251-273 (1994).
  39. Thompson, R. F., Krupa, D. J. Organization of memory traces in the mammalian brain. Annu Rev Neurosci. 17, 519-549 (1994).
  40. Miller, M. J., et al. fMRI of the conscious rabbit during unilateral classical eyeblink conditioning reveals bilateral cerebellar activation. J Neurosci. 23 (37), 11753-11758 (2003).
  41. Geinisman, Y., et al. Remodeling of hippocampal synapses after hippocampus-dependent associative learning. J Comp Neurol. 417 (1), 49-59 (2000).
  42. Ivkovich, D., Stanton, M. E. Effects of early hippocampal lesions on trace, delay, and long-delay eyeblink conditioning in developing rats. Neurobiol Learn Mem. 76 (3), 426-446 (2001).
  43. Moyer, J. R. Jr, Deyo, R. A., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts trace eye-blink conditioning in rabbits. Behav Neurosci. 104 (2), 243-252 (1990).
  44. Solomon, P. R., Vander Schaaf, E. R., Thompson, R. F., Weisz, D. J. Hippocampus and trace conditioning of the rabbit's classically conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 100 (5), 729-744 (1986).
  45. Kronforst-Collins, M. A., Disterhoft, J. F. Lesions of the caudal area of rabbit medial prefrontal cortex impair trace eyeblink conditioning. Neurobiol Learn Mem. 69 (2), 147-162 (1998).
  46. Weible, A. P., McEchron, M. D., Disterhoft, J. F. Cortical involvement in acquisition and extinction of trace eyeblink conditioning. Behav Neurosci. 114 (6), 1058-1067 (2000).
  47. Thomas, J. D., Tran, T. D. Choline supplementation mitigates trace, but not delay, eyeblink conditioning deficits in rats exposed to alcohol during development. Hippocampus. 22 (3), 619-630 (2012).
  48. West, J. R., Hamre, K. M., Pierce, D. R. Delay in brain growth induced by alcohol in artificially reared rat pups. Alcohol. 1 (3), 213-222 (1984).
  49. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880(2008).
  50. Christian, K. M., Thompson, R. F. Neural substrates of eyeblink conditioning: acquisition and retention. Learn Mem. 10 (6), 427-455 (2003).
  51. Kishimoto, Y., Nakazawa, K., Tonegawa, S., Kirino, Y., Kano, M. Hippocampal CA3 NMDA receptors are crucial for adaptive timing of trace eyeblink conditioned response. J Neurosci. 26 (5), 1562-1570 (2006).
  52. Shors, T. J., et al. Neurogenesis in the adult is involved in the formation of trace memories. Nature. 410 (6826), 372-376 (2001).
  53. Tran, T. D., Stanton, M. E., Goodlett, C. R. Binge-like ethanol exposure during the early postnatal period impairs eyeblink conditioning of short and long CS-US intervals in rats. Dev Psychobiol. 49 (6), 589-605 (2007).
  54. Mizumori, S. J., Yeshenko, O., Gill, K. M., Davis, D. M. Parallel processing across neural systems: Implications for a multiple memory system hypothesis. Neurobiol Learn Mem. 82 (3), 278-298 (2004).
  55. Siegel, J. J., et al. Trace Eyeblink Conditioning in Mice Is Dependent upon the Dorsal Medial Prefrontal Cortex, Cerebellum, and Amygdala: Behavioral Characterization and Functional Circuitry(1,2,3). eNeuro. 2 (4), (2015).
  56. Murawski, N. J., Jablonski, S. A., Brown, K. L., Stanton, M. E. Effects of neonatal alcohol dose and exposure window on long delay and trace eyeblink conditioning in juvenile rats. Behav Brain Res. 236 (1), 307-318 (2013).
  57. Lindquist, D. H. Hippocampal-dependent Pavlovian conditioning in adult rats exposed to binge-like doses of ethanol as neonates. Behav Brain Res. 242, 191-199 (2013).
  58. Ivarsson, M., Svensson, P. Conditioned eyeblink response consists of two distinct components. J Neurophysiol. 83 (2), 796-807 (2000).
  59. Woodruff-Pak, D. S., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Trace conditioning: abolished by cerebellar nuclear lesions but not lateral cerebellar cortex aspirations. Brain Res. 348 (2), 249-260 (1985).
  60. Takehara-Nishiuchi, K. The Anatomy and Physiology of Eyeblink Classical Conditioning. Curr Top Behav Neurosci. , (2016).
  61. Mattson, S. N., Schoenfeld, A. M., Riley, E. P. Teratogenic effects of alcohol on brain and behavior. Alcohol Res Health. 25 (3), 185-191 (2001).
  62. Goodfellow, M. J., Abdulla, K. A., Lindquist, D. H. Neonatal Ethanol Exposure Impairs Trace Fear Conditioning and Alters NMDA Receptor Subunit Expression in Adult Male and Female Rats. Alcohol Clin Exp Res. 40 (2), 309-318 (2016).
  63. Beylin, A. V., et al. The role of the hippocampus in trace conditioning: Temporal discontinuity or task difficulty? Neurobiol Learn Mem. 76 (3), 447-461 (2001).
  64. Port, R. L., Romano, A. G., Steinmetz, J. E., Mikhail, A. A., Patterson, M. M. Retention and acquisition of classical trace conditioned responses by rabbits with hippocampal lesions. Behav Neurosci. 100 (5), 745-752 (1986).
  65. Weiss, C., Bouwmeester, H., Power, J. M., Disterhoft, J. F. Hippocampal lesions prevent trace eyeblink conditioning in the freely moving rat. Behav Brain Res. 99 (2), 123-132 (1999).
  66. Brown, S. M., et al. Eyeblink conditioning deficits indicate timing and cerebellar abnormalities in schizophrenia. Brain Cogn. 58 (1), 94-108 (2005).
  67. Sears, L. L., Steinmetz, J. E. Effects of haloperidol on sensory processing in the hippocampus during classical eyeblink conditioning. Psychopharmacology. 130 (3), 254-260 (1997).
  68. Kronforst-Collins, M. A., Moriearty, P. L., Schmidt, B., Disterhoft, J. F. Metrifonate improves associative learning and retention in aging rabbits. Behav Neurosci. 111 (5), 1031-1040 (1997).
  69. Woodruff-Pak, D. S., Finkbiner, R. G., Sasse, D. K. Eyeblink conditioning discriminates Alzheimer's patients from non-demented aged. Neuroreport. 1 (1), 45-48 (1990).
  70. Oristaglio, J., Romano, A. G., Harvey, J. A. Amphetamine influences conditioned response timing and laterality of anterior cingulate cortex activity during rabbit delay eyeblink conditioning. Neurobiol Learn Mem. 92 (1), 1-18 (2009).
  71. Scavio, M. J., Clift, P. S., Wills, J. C. Posttraining effects of amphetamine, chlorpromazine, ketamine, and scopolamine on the acquisition and extinction of the rabbit's conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 106 (6), 900-908 (1992).
  72. Fortier, C. B., et al. Delay discrimination and reversal eyeblink classical conditioning in abstinent chronic alcoholics. Neuropsychology. 22 (2), 196-208 (2008).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Associatief lerenelektromyografische knipperactiviteitspoorperiodegeconditioneerde responsongeconditioneerde responsadaptieve CR s

Gerelateerde artikelen