Imaging Neuronen binnen Dik Brain af met de Golgi-Cox Method

Summary

We presenteren een protocol voor het gebruik van Cox Golgi-kleuring werkwijze dikke hersenpreparaten, teneinde neuronen met lange dendritische bomen opgenomen in één weefselmonsters zichtbaar. Twee varianten van dit protocol worden ook getoond dat cresyl violet tegenkleuring, en het bevriezen van onbewerkte hersenen voor langdurige opslag omvatten.

Abstract

Het Golgi-Cox methode neuron kleuring is gebruikt voor meer dan tweehonderd jaar aan ons begrip van neuron morfologie te bevorderen binnen histologische hersenen monsters. Hoewel het de voorkeur verdient vanuit praktisch oogpunt hersenen secties de grootste dikte materialen te bereiden, teneinde de waarschijnlijkheid van het identificeren bevlekt neuronen die volledig zijn vervat binnen enkele secties verhogen, deze benadering beperkt technisch oogpunt de werkafstand van high -Vergroting microscoop doelstellingen. Wij rapporteren hier een protocol om neuronen te kleuren volgens de methode Golgi-Cox in muizenhersenen secties 500 pm dikte gesneden, en neuronen te visualiseren over de hoogte van die gebieden af ​​met een rechtopstaande microscoop uitgerust met een hoge-resolutie 30X 1,05 NA siliconen olie-immersie objectief dat een 800 pm werkafstand heeft. Wij rapporteren ook twee nuttige varianten van dit protocol dat kan worden gebruikt om het oppervlak van tegenkleuringgemonteerde hersensecties met cresyl violet Nissl vlek of gehele hersenen voor langdurige opslag bevriezen voorafgaand aan snijden en eindverwerking. De belangrijkste protocol en de twee varianten produceren lood dikke hersencoupes, gedurende welke volledige neuron dendritische bomen en dendriet stekels betrouwbaar kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd.

Introduction

De visualisatie van de individuele neuronen in weefselmonsters maakt het mogelijk om in situ analyse van neuron morfologische kenmerken, die aanzienlijk heeft geavanceerde ons begrip van de hersenen en hoe het kan worden beïnvloed door endogene ziekte of exogene omgevingsfactoren. Het Golgi-Cox kleuringsmethode een kosteneffectief, relatief eenvoudig middels kleuren van een steekproef van neuronen in de hersenen. Eerst ontwikkeld door Golgi ¹ en gewijzigd door Cox ² in de jaren 1800, hebben de onderzoekers verder verfijnd deze techniek door de jaren heen aan duidelijke, goed gekleurde neuronen die kunnen worden....

Protocol

Volwassen vrouwelijke CD1-stam muizen werden gebruikt in deze studie. Vergelijkbare kleuring kan worden bereikt met behulp van beide geslachten op verschillende leeftijden. Proefdieren werden verzorgd volgens de principes en richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care, en de experimentele protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Guelph Animal Care Committee.

1. Golgi-Cox kleuring

1. Golgi-Cox Impregneren van Brains
   1. Maak het Golgi-Cox oplossing van 1% (w / v) kaliumdichromaat, 0,8% (w / v) kalium- chromaat en 1% (w / v) kwikchloride door oplossing van kaliumdichromaat en kalium- chromaat i....

Results

Dit Golgi-Cox kleuringsprotocol en twee optionele beschreven varianten kunnen worden toegepast om individuele neuronen te visualiseren binnen 400-500 urn dikke hersencoupes. Representatief beeld montages tweedimensionale Z-uitsteeksels opgenomen met een 10X objectief en 5 urn stappen in de Z-as zijn weergegeven in Figuur 1: A1 - C1 voor een groot gebied van coronale hersenplakjes de anterior cingulate cortex gebied 1 en het omvat secundaire motorische cortex

Discussion

We beschrijven hier een Golgi-Cox kleuringsprotocol met twee nuttige varianten voor het visualiseren van neuronen in hersenen dikke secties. Zoals getoond in de representatieve resultaten, het gebruik van een hoge-resolutie doelstelling met een lange werkafstand 800 pm heeft zorgt voor een betrouwbare weergave van gehele neuronen gehele diepte van hersensecties snijden bij 500 urn. Deze studie relatief dikke hersencoupes vermindert de waarschijnlijkheid dat gekleurde neuronen van elk type volledig binnen de slice, wat v.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium dichromate	Fisher Scientific	P188-100	Hazardous
potassium chromate	Fisher Scientific	P220-100	Hazardous
mercuric chloride	Fisher Scientific	S25423	Hazardous
Whatman grade 1 filter paper	Fisher Scientific	1001-185
isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	CP0406V2
20 mL scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-4
sucrose	Bioshop Canada	SUC700.1
sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S5011-500G
sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9390-500G
50 mL conical tube	Fisher Scientific	12-565-271
isopentane	Fisher Scientific	AC126470010	Also known as 2-methylbutane; hazardous
agar	Sigma Aldrich	A1296-100G
small weigh dish	Fisher Scientific	02-202-100
vibratome	Leica	VT1000 S
6-well tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-1b
mesh bottom tissue culture inserts	Fisher Scientific	07-200-214
paraformadelhyde (PFA), 16%	Electron Microscope Sciences	15710-S	Hazardous
ammonium hydroxide	Fisher Scientific	A669S-500	Hazardous
Kodak Fixative A	Sigma Aldrich	P7542
superfrost plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
CitroSolv clearing agent	Fisher Scientific	22-143-975
anhydrous ethyl alcohol	Commercial Alcohols	N/A
cresyl violet	Sigma Aldrich	C1791
permount	Fisher Scientific	SP15-100
upright microscope	Olympus	BX53 model
colour camera, 12 bit	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D motorized microscope stage, controller and enoders	MBF Biosciences	N/A	Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences
4X microscope objective	Olympus	4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X microscope objective	Olympus	10x 0.3 N.A. UPlan FL N
30X microscope objective	Olympus	30x 1.05 N.A. UPlanSApo
60X microscope objective	Olympus	60x 1.42 N.A. PlanAPO N
silicone immersion oil	Olympus	Z-81114
Neurolucida software	MBF Biosciences	Version 10
ImageJ software	U. S. National Institutes of Health	Current version	With the OME Bio-Formats plugin installed
Photoshop software	Adobe	version CS6