Methodenartikel

Rijping van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten als Biowires gebruiken elektrische stimulatie

DOI:

10.3791/55373

⸱

6 mei 2017

 , 
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 3Heart & Stroke/Richard Lewar Centre of Excellence, University of Toronto, 4Laboratory of Medicine and Pathobiology, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De cardiale biowire platform is een in vitro werkwijze toegepast om menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (HPSC-CM) rijpen combineert driedimensionale celkweek elektrische stimulatie. Dit handschrift bevat de gedetailleerde opzet van de cardiale biowire platform.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Human pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (HPSC-CMS) hebben een veelbelovende bron van cellen geweest en hebben dus moedigde het onderzoek naar hun potentiële toepassingen in cardiale onderzoek, met inbegrip van de ontdekking van geneesmiddelen, de ziekte van modellering, tissue engineering en regeneratieve geneeskunde. Cellen die door bestaande protocollen geven een reeks onrijpheid vergeleken met natief volwassen ventriculaire hartspiercellen. Vele pogingen zijn gedaan om te rijpen HPSC-CM's, met slechts een matige rijping tot nu toe bereikt. Daarom is een ontworpen systeem, genaamd biowire is bedacht door zowel fysische en elektrische signalen leiden HPSC-CM naar volwassen toestand vitro. Het systeem gebruikt een microfabricated platform HPSC-CM zaad collageen type I gel langs een stijve matrijs hechtdraad assembleren tot uitgelijnde hartweefsel (biowire), die wordt onderworpen aan elektrisch veld stimulering met een progressief toenemende frequentie. Vergeleken met niet gestimuleerde controlesbiowired gestimuleerde cardiomyocyten vertonen een verhoogde mate van structurele en elektrofysiologische rijping. Dergelijke veranderingen zijn afhankelijk van de stimulatiefrequentie. Dit manuscript beschrijft in detail de ontwerpen en maken van biowires.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cel-gebaseerde therapie is een van de meest veelbelovende en onderzocht strategieën om cardiale reparatie / regeneratie te bereiken. Het is geholpen door hartweefsel engineering en co-afgifte van biomaterialen 1, 2. De meeste beschikbare bronnen van cellen zijn onderzocht in diermodellen voor hun mogelijk gunstige effecten op beschadigde, zieke of oude harten 3. In het bijzonder zijn aanzienlijke inspanningen gedaan om pluripotente stamcellen humaan gebruik (HPSC) afgeleide cardiomyocyten (HPSC-CM), een potentieel onbeperkte bron van autologe cellen voor cardiale tissue engineering. HPSC-CM's kunnen worden geproduceerd met behulp van verschillende vastgestelde protocollen 4, 5, 6. De verkregen cellen vertonen foetaal-achtige fenotypen met verschillende onvolwassen kenmerken in vergelijking met volwassen ventriculaire hartspiercellen 7, 8. Dit kan een belemmering vormen voor de toepassing van HPSC-CM's als modellen van volwassen hartweefsel in drug discovery onderzoek en in de ontwikkeling van volwassen hartziekten modellen 9 zijn.

Om deze beperking van de fenotypische onvolwassenheid te overwinnen, zijn nieuwe benaderingen actief onderzocht om cardiomyocyt rijping te promoten. Vroege studies toonden effectieve pro-rijping eigenschappen in neonatale cardiomyocyten van de rat via cyclische mechanische of elektrische 10 stimulatie 11. Gel verdichting en cyclische mechanische stimulatie werd ook aangetoond dat bepaalde aspecten van HPSC-CM maturatie 12, 13, met een minimale verhoging van de elektrofysiologische en calcium hanteringseigenschappen te verbeteren. Daarom is een platformsysteem genaamd "biologische wire" (biowire) werd ontwikkeld door zowel structurele signalen en elektrisch veld stimulatien de rijping van HPSC-CM 14 verbeteren. Dit systeem gebruikt een microfabricated platform gericht cardiaal weefsel dat geschikt is voor elektrisch veld stimulering te creëren. Dit kan worden gebruikt om de structurele en elektrofysiologische looptijd HPSC-CM verbeteren. Hier beschrijven we de details van het maken van dergelijke biowires.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Master ontwerp en de fabricage

OPMERKING: Gebruik een zachte lithografie voor fabricage van de inrichting. Maak een tweelaags SU-8 meester voor polydimethylsiloxaan (PDMS) gieten.

  1. Ontwerp het apparaat met een ontwerp en conceptsoftware (Figuur 1A, links). Trekken elke laag van de master gescheiden. Druk het ontwerp apparaat twee fotomaskers bij 20.000 dpi, overeenkomen met de twee lagen van de master 15. Stel de inrichtingpatroon doorzichtig en de omgeving zo donker; de maskers zal dienen als de matrijs optisch op SU-8 overdragen inrichtingpatroon door lithografie (zoals beschreven door anderen 15).
  2. Afzien ongeveer 4 ml SU-8 50 op het midden van een 4 inch siliciumwafel. Coat de SU-8 50 gelijkmatig over de wafer met gebruik van een spin coater door spinnen bij 2000 omwentelingen per minuut (rpm) gedurende 30 s. Bak de wafer op een kookplaat 95 ° C gedurende 10 minuten. Maak de wafer aan ultraviolette (UV) livechten bij 200 mJ / cm2.
  3. Giet ongeveer 4 ml SU-8 2050 op het midden van de wafel en centrifugeren bij 2500 rpm gedurende 30 s. Bakken op 95 ° C hete plaat gedurende 15 min. Koel af tot kamertemperatuur (RT).
  4. Herhaal stap 1.3 twee keer.
  5. Bedek de beklede wafer met de eerste laagtransparantie fotomasker. Maak de wafel UV licht bij 270 mJ / cm2 aan de eerste laag te maken. Bakken op 95 ° C hete plaat gedurende 15 min.
  6. Maak de tweede laag van SU-8 2050 door het herhalen van stap 1,3 maal.
  7. Lijn de tweede laag masker om de functies op de eerste laag een masker aligner. Dan, bloot te stellen aan UV-licht bij 240 mJ / cm2. Bakken bij 95 ° C gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: De belichtingstijd wordt bepaald door de vereiste totale UV-dosis en de UV lichtopbrengst intensiteit gemeten op de dag voorafgaand aan gebruik.
  8. Ontwikkeling van de wafer door het onder te dompelen in propyleenglycol monomethylether acetaat (PGMEA) en geschud bij 200 rpm gedurende 30 minuten op een rondschudapparaat.
  9. Plaatsde master in een petrischaal en giet het mengsel PDMS (base verknopingsmiddel in een verhouding van 10: 1 op gewichtsbasis) in het midden van de wafel. Bedek alle functies en vermijd luchtbellen.
  10. Verhit in een oven bij 70 ° C gedurende 2 uur. Met een scherp mes rond de rand van de PDMS biowire template (Figuur 1A, rechts) te snijden. Schil de PDMS van de master. Trim de inrichting met het blad. Zet de PDMS biowire matrijs in een sterilisatie zakje en stoom autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
  11. In een bioveiligheid kast (BSC), plaatst u de PDMS biowire template in een petrischaal. Met een pincet te houden en monteer een stuk steriel chirurgisch zijden hechtdraad (6-0) in het midden van het kanaal van de PDMS microputjes door plaatsing in de groeven aan beide uiteinden van het kanaal (Figuur 1B-I).

2. Het creëren van de elektrische stimulatie Chamber

  1. Voeg een paar rechthoekige stukken polycarbonaat (lengte x breedte x dikte: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) en gebruik ze als het frame van de elektrische stimulatie kamer (figuur 2).
  2. Boor twee gaten 3 mm breed 2 cm uit elkaar langs de hartlijn van elk polycarbonaat kozijndeel.
  3. Snij twee stukken van 1,5 cm koolstofstaven. Boor een 1 mm breed gat door de koolstaaf ongeveer 3 mm van het einde. Draad een platinadraad met het koolstofatoom staafgat en draai de draad door het wikkelen rond de koolstof staaf. Bevestig een clip aan het andere einde van de platinadraad later verbinding met de elektrische stimulator.
  4. Plaats de koolstof staven in het polycarbonaat raambenen. Plaats de gemonteerde frame koolstof staven in een putje van een plaat met zes putjes.
  5. Pour 2 mL PDMS in de put. Dompel de onderkant van het polycarbonaat frames in PDMS terwijl het PDMS maaiveld dichtbij, maar de bodem van de koolstofstaven niet bereiken. Verhit in een oven bij 70 ° C gedurende 2 uur.
  6. Neemt de elektrische stimulatie kamer van de zes-well bord en zet het in een sterilisatie zakje voor stoomsterilisatie bij 121 ° C gedurende 20 minuten.

3. Enzymatische dissociatie van HPSC-CM

  1. HPSC induceren te differentiëren tot hartspiercellen middels een vaststaand protocol 4.
    OPMERKING: kort genereren hartspiercellen via vastgesteld embryoiden lichaam (EB) voorschriften steel pro medium door de achtereenvolgende suppletie met bot morfogenetisch proteïne 4, basische fibroblast groeifactor, activine A, vasculaire endotheliale groeifactor, en Dickkopf homoloog 1 4. Gebruik EBS vanaf dag 20-34 van differentiatie te biowires te maken.
  2. Verzamel de EBS van de lage plaat bevestiging met een P1,000 pipetpunt en overbrengen naar een conische buis. Pellet door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 125 x g en kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met voorverwarmd, 37 ° C collagenase type I met 1% desoxyribonuclease I (DNAse I). Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uurvoor de spijsvertering.
  3. Voeg 5 ml voorverwarmd, 37 ° C wasmedium en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 125 x g en kamertemperatuur. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet met 2 ml trypsine ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) -oplossing / en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
  4. Voeg 1 ml stop medium met 3% (v / v) DNase I.
  5. Bevestig een 20 G (0,9 mm) naald in een 5 ml spuit en laat de EB suspensie doorheen 3-5 keer.
  6. 7 ml wasmedium en centrifugeer bij 280 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM) en bewaar op ijs. Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer. Neem 0,5 x 10 6 cellen en pellet door centrifugatie bij 280 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
  7. Pre-cool alle gelcomponenten op ijs alvorens ze te mengen in een steriele buis. Meng de volgende collageengel componenten (eindconcentratie): 2,1 mg / ml rattenstaart collageen type I, 24,9 mM glucose, 23,8 mM NaHCO 3, 14,3 mM NaOH, 10 mM HEPES en 10% extracellulaire matrix 1x M199 medium. Voeg de collageen en extracellulaire matrix laatste. Meng door en neer te pipetteren.
  8. Resuspendeer 0,5 x 10 6 cellen met 3,5 pl collageen gel en meng goed.
  9. Gebruik een P10 pipettip 4 pi van de celsuspensie toe te voegen van 0,5 cm lang kanaal (Figuur 1B-II). Stel de positie van de hechtdraad met een steriel pincet indien nodig.
  10. Bedek de bodem van de petrischaal met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en let niet aan de gel raken. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  11. Vervang PBS met 12 ml kweekmedium (bijvoorbeeld stam pro of medium door de fabrikant cel), voldoende om de cellen (Figuur 1B-III) te dekken. Kweken in een incubator bij 37 ° C gedurende 1 week. Verander het medium om de andere dag.

4. Elektrische stimulatie voor Biowire Teelt

  1. Inde BSC, voeg 2 ml PBS aan elk putje van een plaat met zes putjes die een elektrische stimulator kamer zal huisvesten. Gebruik steriele pincet plaats voorzichtig het geautoclaveerde elektrische stimulatie-inrichting in de put. Gooi de PBS uit de put.
  2. Bedek de koolstofstaven met 5 ml voorverwarmd kweekmedium. Gebruik steriele pincet om de biowires de elektrische stimulatie kamer monteren en richt ze loodrecht op de koolstof staven (figuur 2).
  3. Plaats het deksel bovenop de plaat met zes putjes, maar laat voldoende platinadraden bereiken buiten de plaat te verbinden met de elektrische stimulator. Plaats de plaat met zes putjes in een cel incubator bij 37 ° C en sluit de platinadraad de elektrische stimulator.
  4. Stimuleren biowires via een elektrische stimulator met de volgende instellingen: tweefasige herhalende puls 1 ms pulsduur, 3 V / cm en 1 puls per seconde (PPS). Breng de PPS elke 24 uur de volgende waarden: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15, en 6. Wijziging van het medium om de andere dag.
  5. Let op de cardiomyocyt contractiliteit in reactie op elektrische stimulatie onder een microscoop bij 10x vergroting.
    NB: Na een week van de stimulatie, de biowires volwassen wordt (zie de resultaten sectie).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De rationeel gebruik van een hechting in de biowires moet dienen als een matrijs voor het vormen van 3D-constructen die aansluiten op één as en bootsen de vorm van cardiale vezels. We tonen aan dat na zeven dagen van de cultuur in de biowire, cellen gerenoveerd de gel rond de hechtdraad (Figuur 3A). De cellen samengevoegd langs de as van de hechtdraad vormen uitgelijnde hartweefsel (figuur 3). Na 7 dagen voorkweek werden de biowires onderworpen aan 7 dag...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript beschrijft de opzet en uitvoering van de gemanipuleerde platform, biowire, om de rijping van HPSC-CM's te verbeteren. De inrichting kan worden vervaardigd in standaard microfabricage faciliteiten en biowires kunnen worden met gemeenschappelijke celkweek technieken en een elektrische stimulator.

Voor zover wij weten, is er geen methode gerapporteerd vergelijkbaar met biowires. Deze strategie blijkt dat een betere rijping eigenschappen waren afhankelijk van de elektrische st...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een subsidie-in-steun van de Heart and Stroke Foundation of Canada (G-14-0.006.265), operationele subsidies van de Canadese Institutes of Health Research (137.352 en 143.066), en een JP Bickell stichting subsidie ​​(1.013.821 ) aan SSN.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
L-Ascorbic acidSigmaA-4544hPSC-CM-kweekmediumcomponent
AutoCADAutodesk, IncSoftware om apparaat te ontwerpen
Carbon rods, Ø 3 mmComponent elektrische stimulatorkamer
Collagen, type 1, rat tailBD Biosciences354249Collageengel: 2,1 mg/mL type I rattail collageen in 24,9 mM glucose, 23,8 mM NaHCO3, 14,3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199-medium met 10 % groeifactor-verminderd Matrigel.
Collagenase type I SigmaC01300,2% collagenase type I (w/v) en 20% FBS (v/v) in PBS met Ca2+ en Mg2+. Steriliseer met 0,22 μm-filter en maak 12 mL-aliquots. Bewaar bij -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I)EMD Millipore260913-25MUMaak 1 mg/mL DNase I-stamplossing in water. Filter steriel en bewaar 0,5 mL-aliquots bij −20 °C
Boor & boorbits (Ø 1 mm en 2 mm)DremelBoor gaten in polycarbonaat frames
Elektrische stimulatorGrasss88x
Fetal bovien serum (FBS)WISENT Inc.080-450
D-(+)-Glucose SigmaG5767Collageengel component
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030081
H2OMilliQ18,2 MΩ·cm bij 25 °C, ultrapuur, om alle oplossingen te maken
HEPESSigmaH4034Collageengel component
Hot plateTorrey PinesHS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)Thermo Fisher Scientific12440053
Mask alignerEVG EVG 620
Matrigel, growth factor reduced Corning354230Collageengel component
Medium 199 (M199)Thermo Fisher Scientific11825015Collageengel component
Monothioglycerol (MTG)SigmaM-6145hPSC-CM-kweekmediumcomponent
Orbitale shakerVWR89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S)Thermo Fisher Scientific15070063
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met Ca2+ en Mg2+ Thermo Fisher Scientific14040133
Plaat (6-well)Corning353046
Plaat (6-well), lage bindingCorning3471
Platinedraden, 0,2 mmComponent elektrische stimulatorkamer
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Propyleenglycolmonomethyletheracetaat (PGMEA)Doe & Ingalls Inc.Om de wafer te ontwikkelen
Zak, peel-openConvertors92308Voor stoomsterilisatie
Siliciumwafer, 4 inchUniversityWafer Inc.
Natriumbicarbonaat (NaHCO3)SigmaS5761Collageengel component
NatriumhydroxideSigmaS8045Collageengel component
Sprin coaterSpecialty Coating SystemsG3P-8
StemPro-34-kweekmediumThermo Fisher Scientific10639011hPSC-CM-kweekmedium. Om 50 mL te maken, voeg 1,3 mL supplement toe, 500 μL van 100× L-Glutamine, 250 μL van 30 mg/mL transferrine, 500 μl van 5 mg/mL ascorbinezuur, 150 μL van 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), en 500 μL (1 %) penicilline/streptomycine.
Stop mediaWasmedium: FBS (1:1)
SU-8 50 MicroChem Corp.fotoresist, master component
SU-8 2050 MicroChem Corp.fotoresist, master component
TransferrineRoche10-652-202hPSC-CM-kweekmediumcomponent
Trypsin/EDTA, 0,25%Thermo Fisher Scientific25200056hPSC-CM-kweekmediumcomponent
WasmediumIMDM met 1% Penicilline/Streptomycine
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005(2015).
  2. Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
  3. Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).
  4. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
  5. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  6. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  7. Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
  8. Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
  9. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  10. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
  11. Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
  12. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397(2011).
  13. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  14. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  15. Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
  16. Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
  17. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
  18. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
  19. Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
  20. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Biowire systeemcardiale weefseltechniekrijping van hPSC CMcollageen type I gelzijden hechtingtemplatePDMS kamerfabricageprogressieve frequentiestimulatiestructurele elektrofysiologische rijping

Gerelateerde artikelen