Meiose is het ontwikkelings proces waaraan gameten worden gevormd door een ronde van DNA-replicatie en twee opeenvolgende ronden van chromosoom segregatie. Zoogdieren meiose kan worden onderzocht met behulp van een techniek ter voorbereiding Meiotische chromosoom spreads. Hier tonen we een methode voor te bereiden oppervlak-spread kernen van muis spermatocyten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Voorbereiding van Meiotische chromosoom verspreidt van muis spermatocyten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zoogdieren meiose is een dynamische developmental proces dat voorkomt in de geslachtscellen en kan worden bestudeerd en gekenmerkt. Met behulp van een methode te verspreiden kernen op het oppervlak van de dia's (in plaats van neer te zetten vanaf een hoogte), tonen we een geoptimaliseerde techniek op muis spermatocyten die voor het eerst in 1997 beschreven werd. Deze methode wordt veel gebruikt in laboratoria te onderzoeken zoogdieren meiose omdat het resulteert in een overvloed van hoge kwaliteit kernen ondergaan substages van profase I. Seminiferous tubuli voor het eerst in een hypotone oplossing gebracht te zwellen spermatocyten worden geplaatst. Vervolgens een sacharoseoplossing maken een celsuspensie spermatocyten vrijkomen en kernen zijn verspreid in glas fixeerspray doordrenkte dia's. Naar aanleiding van immunokleuring, een verscheidenheid van eiwitten germane Meiotische processen kan worden onderzocht. Bijvoorbeeld, de eiwitten van het synaptonemal-complex, een tripartiete structuur die de chromosoom assen/kernen van homologen samen verbindt kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd. Meiotische recombinatie eiwitten, die bij de reparatie van DNA dubbele-strand einden door homologe recombinatie betrokken zijn, kunnen ook worden immunostained om te evalueren van de voortgang van de profase ik. Hier wij beschrijven en demonstreren in detail een techniek om te studeren van zoogdieren meiose in spermatocyten van jonge of volwassen mannelijke muizen op grote schaal gebruikt.
Inleiding
Muizen worden veel gebruikt als een modelorganisme voor het bestuderen van de meiose bij zoogdieren. Zowel de normale ontwikkelings processen en de gebreken die zich tijdens de meiose voordoen kunnen worden geëvalueerd. De tijdlijn en de progressie van de meest opvallende kenmerken die zich voordoen tijdens de profase I en substages, evenals een scala aan specifieke proteïnen die betrokken zijn bij processen van cruciaal belang voor de regulering van de meiose kan gekarakteriseerd worden bij zowel wild type en mutant muizen. Verschillende gespecialiseerde processen die zich tijdens de meiose die ik kunnen bestudeerd worden in detail voordoen (herzien in Handel en Schi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle methoden waarbij muizen gebruikt hoge ethische en sociale normen, en goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité aan Drexel University College of Medicine.
1. bereiding van de oplossingen en instrumenten die nodig zijn
- Bereiden hypotone extractie Buffer (HEB) in 50 mL ultrazuiver laboratorium rang water, pH 8.2-8.4 (tabel 1). Maak de oplossing vers telkens Houd op ijs, en gebruik binnen 2 uur van de voorbereiding van de spreads; Dit is nodig om de vermindering en protease remming van activiteiten van DTT en PMSF, respectievelijk te optimaliseren. Gebruik 10 mL HEB voor elk paar van muis teelballen. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het vermogen van deze methode om grote aantallen oppervlak verspreid kernen met intact homologen hangt af van drie belangrijke factoren: 1) passende incubatietijd van seminiferous buisjes in hypotone buffer (d.w.z. HEB) voldoende om gepofte spermatocyte kernen die barsten, maar doen niet desintegreren van langdurige incubatie in HEB, 2) micropipetting de sacharose druppels van cellen te verkrijgen van een gescheiden opschorting van kernen die niet worden samengeklonterd samen, en 3) dia i.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Met het oog op een groot aantal goed verspreid, goede kwaliteit spermatocyte kernen, omvatten de belangrijkste stappen van dit protocol passende incubatietijd van seminiferous buisjes in HEB, passende hakken van seminiferous buisjes, en de techniek gebruikt om te de celsuspensie sacharose verspreid de kleefpoeders gecoate dia('s). We broeden seminiferous buisjes van testes van wild type mannetjes variërend van postnatale dag 15 naar volwassenheid in HEB voor 45 min, terwijl de teelballen van relatief leeftijd Chtf18<.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de technische bijstand van Abigail Harris. Zij erkennen ook Paula Cohen en Kim Holloway voor zijn bijdrage aan het optimaliseren van het protocol van de voorbereiding van de oppervlak-spread kernen van muis spermatocyten. De auteurs waarderen ook kritische lezing van het manuscript door Karen Schindler.
Dit werk werd gesteund door de NIH R01 GM106262 te K.M.B.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde waterige oplossing) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Verdun 16% oplossing in 4% werkstocks met 1X PBS en bevries aliquoten bij -20 °C |
| Teflon bedrukte 3-ring dia's | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium ongeladen gefroste glazen einddia's | Verschillende commerciële merken | Reinig dia's in ethyl of isopropyl alcohol en laat ze druppeldrogen voor gebruik; label dia's op gefroste kant met een permanente marker of potlood, afhankelijk van het verdere gebruik van de dia's | |
| Chirurgische schaar (scherpe en stompe punten) | Fine Science Tools | 14001-12 | Een ander merk van een vergelijkbaar type zal werken |
| Chirurgische schaar met fijne punt (scherpe punten) | Fine Science Tools | 14058-11 | Een ander merk van een vergelijkbaar type zal werken |
| Scherpe punt pincet | Fine Science Tools | 11050-10 | Een ander merk van een vergelijkbaar type zal werken |
| Gebogen middelpunt pincet | Fisher | 16100110 | Een ander merk van een vergelijkbaar type zal werken |
| Schelphandgreep | Fine Science Tools | 10003-12 | Een ander merk van een vergelijkbaar type zal werken |
| Muis anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Gebruik bij 1:300 |
| Anti-centromeer-eiwit (afkomstig van humaan CREST-patiëntserum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Gebruik bij 1:50 |
| Bevochtigde kamer | We gebruiken Nunc vierkante kweekschotels 500 cm2/put met bevochtigde papieren handdoeken | ||
| Widefield microscoop met epifluorescentie | Leica Microsystems | Elk standaardmodel | |
| Coplin potten | Verschillende commerciële merken | 50 ml capaciteit; 40 mm (1,6 inch) diameter, houdt 10 dia's (rug tegen rug) | |
| Petri schotels | Verschillende commerciële merken | 100 x 15 mm diameter, polystyreen sterieel onbehandeld |
Referenties
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spre....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
