Methodenartikel

Detectie en Verrijking van zeldzame antigeen-specifieke B-cellen voor analyse van fenotype en functie

11.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55382

⸱

16 februari 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 3Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 4Department of Biomedical Research, National Jewish Health

In dit artikel

Samenvatting

Een eenvoudige maar effectieve methode die magnetische nanodeeltjes in dienst aan antigeen-reactieve B-cellen voor functionele en fenotypische analyse op te sporen en te verrijken wordt beschreven.

Samenvatting

B-cellen die reageren met een specifiek antigeen komen meestal voor met een frequentie van <0,05% van de lymfocyten. Al tientallen jaren zijn onderzoekers op zoek naar methoden om deze zeldzame cellen te isoleren en te verrijken voor studies naar hun fenotype en biologie. Benaderingen zijn onvermijdelijk gebaseerd op het principe dat B-cellen natuurlijk antigeen herkennen door middel van celoppervlaktereceptoren die representatief zijn voor de specificiteit van antilichamen die uiteindelijk door hun gedifferentieerde dochters zullen worden uitgescheiden. Misschien is de meest voor de hand liggende benadering van het probleem het gebruik van fluorochroom-geconjugeerde antigenen in combinatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). De bruikbaarheid van deze methoden is echter beperkt door de celfrequentie en de haalbare snelheid van analyse en isolatie door elektronische sortering. Er wordt een nieuwe methode beschreven om zeldzame antigeenspecifieke B-cellen te verrijken met behulp van magnetische nanodeeltjes die resulteren in een hoge opbrengstverrijking van antigeen-reactieve B-cellen uit grote uitgaande celpopulaties. Deze methode maakt een beter toezicht mogelijk op het fenotype en de biologie van antigeen-reactieve cellen voor en na in vivo antigeen-ontmoeting, zoals na immunisatie of tijdens de ontwikkeling van auto-immuniteit.

Inleiding

Beperkende verdunning analyses van antilichaam uitscheidende cellen precursorfrequentie suggereren dat B-cellen reactief voor een bepaald antigeen kenmerkend optreden met een frequentie van 0,05-0,005% in de normale repertoire, afhankelijk van de status vaccinatie en grootte / het aantal aanwezige epitopen op het antigeen. De lage frequentie van deze cellen is het moeilijk om veranderingen in de status tijdens de ontwikkeling van immuunresponsen, zoals na vaccinatie en blootstelling aan een vreemd antigeen, of tijdens de ontwikkeling van auto-immuniteit te bestuderen. Eerder hebben onderzoekers isolatie van antigeen-reactieve B-cellen met behulp van technieken variërend van antigeen beklede platen of kolom adsorptiemiddelen, op met antigeen beklede rode bloedcellen resetten om uitgevoerd fluorescentie-geactiveerde celsortering 1, 2, 3, 4, 5, 6. though deze technieken zijn succesvol bij het identificeren en isoleren van antigeen-reactieve B-cellen zijn, zijn de resultaten variëren qua opbrengst, zuiverheid en schaalbaarheid. Onlangs hebben we een nieuwe methode om zowel te detecteren en te verrijken zeldzame B lymfocytensubpopulaties met magnetische nanodeeltjes. De methode kan verrijken met een relatief hoge opbrengst en zuiverheid van grote populaties starten, en is compatibel met de analyse van de reacties op antigeen. Door verrijken van populaties van cellen in suspensie, waarbij de werkwijze elimineert beperkingen die samenhangen met de geometrie van de met antigeen beklede platen of kolommen, en beperken doorvoer. Tenslotte, aangezien verrijkte cellen geassocieerd blijven met antigeen en een fluorescerende reporter, kunnen verder worden gezuiverd door FACS-sortering. Zoals hierin beschreven hebben we deze benadering voor onderzoek van perifeer bloed tetanustoxoïde-reactieve B-cellen voor en na immunisatie van menselijke patiënten, evenals autoantigeen-reactieve B-cellen van patiënten met verschillende autoi gebruiktmmune aandoeningen, waaronder type 1 diabetes, de ziekte van Graves, en de ziekte van 7 Hashimoto. De werkwijze werkt evengoed bij muis en mens, en is compatibel met de analyse van antigeen-reactieve B-cellen van verschillende weefsels (manuscript in voorbereiding).

In de basisopstelling weergave worden perifeer bloed mononucleaire cellen eerst geïncubeerd met gebiotinyleerd antigeen met antilichamen tegen oppervlakteantigenen vereist voor fenotypische analyse cel. Deze etikettering wordt gevolgd door wassen en fixatie, en toevoeging van streptavidine gekoppeld met ver-rood-fluorescerende kleurstof voor detectie van het gebiotinyleerde antigeen bindende cellen (Figuur 1). Eerdere studies hebben antigeenspecifieke B-cellen die in een vergelijkbare wijze maar met gebruik van antigenen rechtstreeks geconjugeerd aan een fluorochroom 8, 9, 10, 11. Hoewel dit is een waardigebenadering, gebruik van gebiotinyleerde antigenen in combinatie met streptavidine maakt grotere signaalversterking (dus betere differentiatie van bindende en niet-bindende cellen), met name wanneer antigenen kleine 12, 13, 14. Een aanvullende overweging is het gebruik van streptavidine in plaats van avidine omdat streptavidine gedeglycosyleerde, afneemt aspecifieke binding. Verder gebruiken we ver-rood-fluorescerende kleurstof als fluorochroom vanwege de fotostabiliteit, kwantumopbrengst (helderheid) en de kleine afmetingen (~ 1,3 kD). Eiwit fluorochromen zoals phycoerythrine (~ 250 kD) en allofycocyanine (~ 105 kD) 15 niet optimaal omdat veel potentieel antigene epitopen bevatten. Toepassing van een kleine organische fluorescente kleurstof uit één epitoop, zoals ver-rood-fluorescerende kleurstof, vermindert de complexiteit van de geïsoleerde celpopulatie.

Zodra cellen gebiotinyleerd-antigen en ver-rood-fluorescerende kleurstof-streptavidine geadsorbeerd, worden ze verrijkt met behulp van anti-ver-rood-fluorescerende kleurstof-geconjugeerde magnetische nanodeeltjes. Één nanodeeltjes worden niet herkend door de meeste flowcytometers en derhalve niet behoeven te worden verwijderd vóór zuivering door FACS sortering en downstream assays 16. Magnetische selectie van antigeenspecifieke B-cellen verrijkt de populatie van belang, waardoor de tijd en kosten van sortering zeldzame gebeurtenissen met een flow cytometer.

Hieronder tonen we representatieve resultaten van de verrijking van tetanus-toxoïde-specifieke B-cellen van een patiënt vóór en zeven dagen na tetanustoxoïd booster immunisatie. We kozen deze specifieke toepassing als bijvoorbeeld om het vermogen van deze methode om antigeenspecifieke B-cellen in vivo na acute stimulatie verrijking tonen. In combinatie met flowcytometrie is deze methode geschikt voor het verrijken en differentiëren antigeenspecifieke naïeve, geheugen, enplasmablast B-cellen en kan de onderzoeker aan veranderingen in de frequentie in de tijd te volgen. Bovendien nemen we een andere mogelijke downstream assay, zoals een ELISPOT assay, hetgeen aantoont dat cellen behouden het vermogen om antilichaam uitscheiden na verrijking. Een andere toepassing van deze werkwijze adoptieve overdracht van verrijkte cellen in een gastheer kunnen inhouden. We hebben eerder aangetoond cellen behouden het vermogen om als antigeenpresenterende cellen om antigenspecifieke T-cellen na isolatie en overdracht (gegevens niet getoond). Daarom zijn er een aantal mogelijke downstream assays die kunnen worden gekoppeld met de methode, die tezamen het begrip van de antigeen-specifieke immuunrespons informeert. We hebben de hieronder beschreven methode, met inbegrip van de controles aan de totale opbrengst, zuiverheid, cel specificiteit te bepalen, en vouw-verrijking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Isolatie van menselijke PBMCs

  1. Verzamel 30-50 ml bloed met behulp van heparine bloedafnamebuisjes.
    OPMERKING: De hoeveelheid bloed hangt af van de specifieke experimentele vraag alsmede frequentie bloed van antigeenspecifieke B-cellen van belang. Gehepariniseerd bloed kunnen direct worden verwerkt of zachtjes geschud gedurende de nacht bij kamertemperatuur verwerken van de volgende dag. De vertraging in de verwerking heeft zeer weinig invloed op de efficiëntie van verrijking en is geassocieerd met een minimaal verlies van levensvatbaarheid.
  2. Meng volbloed 1: 1 met een steriele, kamertemperatuur magnesium en calcium vrije fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  3. In een 50 ml steriele conische buis, voeg 10 ml kamertemperatuur dichtheidsgradiënt oplossing. Bewaar de geopende dichtheidsgradiënt flessen in het donker bij 4 ° C, maar opwarmen tot kamertemperatuur vóór gebruik.
  4. Indien mogelijk zet de pipet pistool aan de trage instelling en / of zeer weinig, maar toch consistent, trekker druk uit te oefenen om langzaamlaag 30-35 ml van het verdunde bloed bovenop de dichtheidsgradiënt, zorg dat de twee niet te mengen.
    Opmerking: Het plaatsen van de punt van de pipet tegen de rand van de 50 ml conische het geven van het verdunde bloed zal zorgen voor een constante stabiele stroom.
  5. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij 20 ° C met de rem uitgeschakeld.
  6. Verwijder de bovenste laag, die plasma en bloedplaatjes bevat, let de mononucleaire cellaag hieronder niet te verstoren.
  7. Met een steriele pipet, verzamel de mononucleaire cellaag (buffy coat) en plaats in een afzonderlijke steriele 50 ml conische buis.
  8. Voeg PBS aan de celsuspensie tot een volume van 50 ml. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij 20 ° C met rem.
  9. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet cellen in 10 ml PBS. Tellen cellen en het bepalen van de levensvatbaarheid van het gebruik van een hemocytometer of geautomatiseerde cel tegen te gaan.
  10. Resuspendeer cellen bij 10 7 cellen / ml en plaats op ijs tot klaar voor verdere verwerking.

2. Kleuring van cellen

  1. Verwijder 1-2 x 10 6 cellen per fluorescentie compensatie / FMO controle nodig is, indien van toepassing. Centrifuge resterende cellen bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C met rem.
  2. Resuspendeer cellen in steriel gefiltreerd koude FACS-buffer (PBS + 1% runderserumalbumine (BSA) + 0,01% natriumazide) en 3-6 x 10 7 cellen / ml (verwijderen in een 1,5 ml centrifugebuis). Zorg ervoor dat de FACS buffer is koud en te houden op het ijs gedurende de kleuring procedure.
    1. Verdeel de celpopulatie in vieren (AD) bij het optimaliseren van de test. Gebruik fractie A antigeen-specifieke B-cellen plaats, gebruik fracties B en C te verrijken om de specificiteit van de verrijking / kleuring bepalen (zie 2.5 en 2.6) en het gebruik fractie D de frequentie en aantal antigeenspecifieke cellen vast te de niet aangepaste bevolking berekening van het rendement mogelijk te maken en vouw-verrijking.
  3. Voeg menselijk FcyR blokkeren reagent fracties AD op ijs voorkomen binding van antilichamen aan Fc-receptoren.
    OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant voor de juiste omstandigheden.
  4. Add fluorochroom geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakteantigenen plaats cel fracties AD 30 min op ijs in het donker, dat evenwel niet tot fluorochromen die kunnen kruisreageren met het anti-ver-rood-fluorescerende kleurstof antilichamen gekoppeld aan magnetische nanodeeltjes omvatten.
    LET OP: Deze omvatten antilichaamconjugaten tot bijna-infrarood fluorescerende kleurstof, Cy5, Cy5.5 en Cy7. Elke levensvatbaarheid vlekken die toegevoegd moet verenigbaar zijn met het gebruik van een fixeermiddel zijn. Als men niet van plan de cellen met behulp van FACS analyse, maar bepalen de antilichaamsecreterende frequentie, bijvoorbeeld door ELISPOT, oppervlakte kleuring met antilichamen overbodig.
  5. Om de specificiteit van de assay, incubeer fractie B met een voldoende hoeveelheid niet-gemerkt antigeen voor 30 min op ijs, zodat de meerderheid van de receptoren met een affiniteit van ten minste10 -6 M geblokkeerd.
    OPMERKING: Meestal een goede uitgangsconcentratie een 50-100-voudige overmaat van de hoeveelheid antigeen voldoende geacht 2.6 hieronder (bijvoorbeeld 50-100 pM). Dit zou een L-cellen met hoge affiniteit te blokkeren voor de ongelabelde antigen te binden aan het gebiotinyleerde antigeen, dat wordt toegevoegd in stap 2.6 hieronder, waardoor bevestiging van de specificiteit van de verrijkte cellen. Deze stap kan in combinatie met stap 2.4 worden voltooid.
  6. Voeg gebiotinyleerd antigeen fracties A, B en D. Incubeer op ijs gedurende 30 min.
    OPMERKING: Concentratie van gebiotinyleerd antigeen worden getitreerd om de optimale hoeveelheid om een ​​adequate detectie en scheiding van cellen binding van niet-specifieke cellen te waarborgen bystander bepalen. Typisch een goed uitgangspunt concentratie test is 1-5 uM.
    LET OP: Voor fracties A en D, deze stap kan gelijktijdig worden gedaan met stap 2.4. Voor de fractie B, moet deze stap worden uitgevoerd nadat stap 2.5 (wassen in betwEen stappen niet nodig).
  7. Weglaten gebiotinyleerd antigeen van Fraction C om eventuele binding van B-cellen aan andere reagentia in het protocol, zoals streptavidine ver rood-fluorescerende kleurstof en de magnetische korrels te bepalen.
  8. Was de cellen tweemaal uit suspensie van cellen in 1 ml koude FACS-buffer per 5 x 10 7 cellen en centrifugatie bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  9. Na de laatste wasbeurt, verdun geconcentreerde celsuspensie in 1 ml 2% formaldehyde per 5 x 10 7 cellen en laat zitten in het donker op ijs gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Fixatie van de cellen op dit punt verzekert dat de gebiotinyleerde antigen gebonden blijft aan de BCR voor de rest van de procedure. Voor levensvatbare cellen - voor downstream-analyse, zoals in ELISPOTs of adoptief transfers, laat de fixatie stap.
  10. Was de cellen tweemaal met 1 ml koude FACS-buffer per 5 x 10 7 cellen en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer in 1 ml koud FACS buffer per 5 x 107 cellen.
  11. Voeg 1-2 pg streptavidine-ver-rood-fluorescerende kleurstof / ml en incuberen op ijs gedurende 20 minuten in het donker. Titreer de hoeveelheid streptavidine voor elke toepassing.
  12. Was de cellen tweemaal met 1 ml koude FACS-buffer per 5 x 10 7 cellen en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Fractie D is voorbereid op dit punt niet verrijking zal ondergaan met de magnetische korrels.
    Opmerking: Dit monster wordt gebruikt om de frequentie en het aantal antigeenspecifieke B-cellen in het monster. Deze wordt gebruikt om de opbrengst te bepalen en verrijking voudige verrijking bereikt.

3. magnetische nanodeeltjes gebaseerde Enrichment

  1. Resuspendeer cellen uit monsters AC in 1 ml koude buffer scheiding (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) per 5 x 10 7 cellen en passeren door een 40 urn filter om eventuele klonten die de kolom zou kunnen verstoppen te verwijderen.
  2. Voeg Anti-Cy5 / Anti-ver-rood-fluorescerende kleurstof nanodeeltjes. for optimaal resultaat moet de concentratie van de nanodeeltjes worden getitreerd voor elk gebruik, maar een goed startpunt is 50 pl suspensie per 5 x 10 7 cellen / ml. Roteren in het donker bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
  3. Was tweemaal met 1 ml koude buffer scheiding bij 400 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer cellen in 1 ml koude buffer scheiding per 5 x 10 7 cellen.

4. Magnetische Verrijking met behulp van LS of LD Columns

  1. Plaats drie LS of LD kolommen in het magnetische veld van een magnetische scheider en voeg 3 ml scheidingsbuffer de kolommen nat (zie het produkt te bepalen welk type kolom het meest geschikt). Laat alle 3 ml door de kolom te passeren en gooi deze na collectie.
    Opmerking Hoewel scheiding van magnetische nanodeeltjes gelabelde cellen kan worden uitgevoerd met een van de magnetische scheidingsinrichtingen die commercieel verkrijgbaar zijn, het laboratorium is het meeste succes met behulp van LS kolommen had, in terms opbrengst, zuiverheid en efficiency van verrijking.
  2. Plaats drie 15 ml conische buizen label "Fractie A / (B) / (C) negatief" voor negatief geselecteerde cellen in de kolom. Voeg het magnetisch gelabelde cellen hun respectieve kolom en laat het volledige volume passeren.
  3. Voeg 3 ml koude buffer scheiding geplaatst, en laat deze door de kolom stroomt en herhaal met 2 ml. Verzamel de negatief geselecteerde cellen en zet apart op ijs.
  4. Verwijder de kolom uit het magnetische veld en bovenop een 15 ml conische buis label "Fractie A / (B) / (C) positief", voor het positief geselecteerde cellen.
  5. Vul de kolom naar de top met ongeveer 6 ml scheidingsbuffer onmiddellijk duiken dit volume door de kolom cellen die het magnetische veld gebonden was met de bijgeleverde zuiger verzamelen.
  6. Om de zuiverheid te verhogen, kan de positief geselecteerde cellen verder worden verrijkt met een tweede schone kolom, het herhalen van de procedure.
  7. Spin zowel negatief als positief geselecteerde fracties bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en schorsen gewenste eindvolume. Ga verder met downstream-analyse, zoals FACS, ELISPOT of adoptieve overdracht.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Analyse van de zuiverheid, opbrengst, en vouw-verrijking met behulp van flowcytometrie

Populaties verrijkt zoals hierboven beschreven onvermijdelijk contaminerende cellen die niet gebonden streptavidine far-red-fluorescerende kleurstof maar zijn ingevangen in de matrix bevat. Deze verontreinigingen kunnen van verrijkte populaties van FACS-sortering worden verwijderd. Om de zuiverheid van verrijkte populatie te schatten, poort op ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een nieuwe werkwijze voor isolatie en verrijking van antigeen-bindende B-cellen uit humaan perifeer bloed bereiken. De werkwijze is goed toepasbaar voor muizen en andere weefsels zoals de milt en lymfeklieren, en is compatibel met post-verrijking analyse van cel fenotype en functie (manuscript in voorbereiding).

De gebruiker moet zich bewust van een aantal variabelen die het succes van deze procedure kan beïnvloeden. Uit ervaring dode cellen meestal bij de magnetische kra...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) en de National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201 en F30OD021477).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antigen van belangvariabelvariabelMinimaal 100 μg om gemakkelijk te biotinyleren; gebruik bij gebruik van eiwit een eiwit dat is gevalideerd door ELISA. Het moet vrij zijn van dragereiwit 
Biotine voor labeling; bijv. EZ link Sulfo-NHS-LC-BiotineThermo Scientific21335Biotine is beschikbaar in verschillende formuleringen, zoals die met  ruimte tussen verschillende lengtes, dus het type dat wordt gebruikt moet worden bepaald door de onderzoeker
Streptavidine-Alexa Fluor 647InvitrogenS21374Kan worden verkregen bij andere leveranciers.
Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 MicrobeadsMiltenyi Biotech130-091-395
LS KolommenMiltenyi Biotech130-042-401
MACS handmatige scheidersMiltenyi Biotechvariabel
FormaldehydeVerdun tot 2% met PBS; optioneel als downstream assay levende cellen vereist
PBS zonder calcium en magnesium
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
Vol bloed in heparine gevulde opvangbuisjes
FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0,01% natriumaziet)
Scheidelingsbuffer (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA)
50 ml kegelbuizen
15 ml kegelbuizen
1,5 ml Eppendorf buisjes
Reactieve oppervlaktemarker antilichamen, Fc Block, levend/dood discriminerende kleurstof, indien nodig
ELISPOT benodigdheden, indien nodig

Referenties

  1. de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
  2. Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
  3. Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
  4. Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
  5. Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
  6. Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
  7. Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
  8. Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
  9. Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
  10. Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
  11. Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
  12. Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
  13. Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
  14. Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
  15. Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
  16. Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Verrijking met magnetische nanodeeltjesfluorescentie geactiveerde celsorteringmononucleaire cellen uit perifeer bloedbiotinylering van antigeenbindingstreptavidine geconjugeerd antilichaamblokkeren van Fcgamma receptordichtheidsgradi ntcentrifugatiescheiding via magnetische kolomtetanus toxo de antigeen

Gerelateerde artikelen